一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法
【专利摘要】本发明为一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法，属于病菌检测【技术领域】。该方法包括：(1)对肝硬化病人的肝腹水样本进行培养；(2)对步骤(1)中进行培养的样本采用安瓿法，放入微热量热仪中，得到样本中细菌生长代谢热谱曲线；(3)将步骤(2)得到的热谱曲线与相同条件下标准细菌的热谱曲线进行对比，确定肝硬化腹水中细菌的种类。本发明的方法具有可信度高、灵敏度好，可以快速有效的鉴定肝硬化腹水细菌感染病原菌的优点，同时相对于微生物自动化检测系统，本方法还具有简便实用、成本低的特点。
【专利说明】一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病菌检测【技术领域】，具体涉及一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法。
【背景技术】
[0002]肝硬化腹水，是一种慢性肝病，俗称肝腹水。正常人腹腔内有少量(约50ml)起维持脏器间润滑作用的游离腹水，当腹腔内出现过多游离液体时，称为腹水。而肝硬化肝功能减退引起门静脉高压，导致脾肿大，对蛋白质和维生素的不吸收而渗漏出的蛋白液，形成了腹水症。由于肝腹水患者的抵抗力低，特别是肝内网状内皮系统严重受损、巨噬细胞吞噬功能以及白细胞粘附趋化与吞噬功能降低等原因有关，这时肠道内细菌就会增多，易引起肝硬化腹水细菌感染和少数真菌感染，出现自发性细菌性腹膜炎(Spontaneous bacterialperitonitis, SBP)、呼吸道感染、尿路感染以及软组织感染约占肝硬化合并感染等症。
[0003]近年研究表明，肝硬化腹水患者约20%伴自发性细菌性腹膜炎。其原因主要包括肠道细菌的转运、病原菌的接触传播以及血源污染。致病菌常为来源于肠道的需氧的革兰阴性菌(49.5%)及非肠源性的链球菌。最常见的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、枯草芽胞杆菌、产气肠杆菌等。目前，微生物自动化检测系统，如API和VITEK系统，相对于常规鉴定方法具有准确、快速和鉴定病原体的特点，较广泛地应用于临床检验、疾病控制等领域。临床上鉴定肝硬化腹水感染细菌种类主要通过制作血培养阳性标本，采用VITEK、API方法和药敏法等方法进行检测，均具有较好的灵敏度和准确度，但是微生物自动化检测系统在检测中过程复杂、成本较闻。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于公开了一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0006]一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法，包括下述步骤:
[0007](I)、对肝硬化病人的肝腹水样本进行培养；
[0008](2)、对步骤(I)中进行培养的样本采用安瓿法，放入微热量热仪中，得到样本中细菌生长代谢热谱曲线(热功率-时间曲线)；
[0009](3)、将步骤⑵得到的热谱曲线与相同条件下标准细菌的热谱曲线进行对比，确定肝硬化腹水中细菌的种类。
[0010]上述技术方案所述的方法，其中，步骤(I)中的样本在接种量为IXio6Cells/ml条件下，在LB培养基中进行培养，所述LB培养基的组成为蛋白胨0.01g/ml、酵母膏0.005g/ml 和 NaCl0.005g/ml。
[0011]上述技术方案所述的方法，其中，步骤(2)中得到热谱曲线的条件为37°C等温条件下得到热谱曲线。[0012]上述技术方案所述的方法，其中，步骤(3)中是通过对比两个热谱曲线之间的出峰数量N、峰宽W和各峰出峰时间t来确定肝硬化腹水中细菌的种类。
[0013]上述技术方案所述的方法，其中，在步骤(I)之前还包括获得标准细菌热谱曲线的过程，步骤为:在37°C恒温条件下，采用安瓿法，将标准细菌以lX106cellS/ml的浓度接种到LB培养基中，放入微热量热仪中，得到标准细菌的生长代谢热谱曲线。
[0014]本发明具有以下有益效果:
[0015]本发明一种利用微量热法鉴别肝硬化腹水感染细菌种类的方法是将检测样本中的细菌生长代谢热谱曲线与标准细菌生长代谢热谱曲线的出峰数量(N)、峰宽(W)、各峰的达峰时间t等指标进行对比，从而可以快速、准确地鉴定样本中细菌种类；与VITEK等方法(直接法)检测的结果相比，本发明方法的鉴定结果具有可信度高、灵敏度好，可以快速有效的鉴定肝硬化腹水细菌感染病原菌的优点，同时相对于微生物自动化检测系统，本方法还具有简便实用、成本低的特点。
【专利附图】
【附图说明】:
[0016]1、图1为大肠埃希菌在不同接种量下的热谱曲线图(37°C，安瓿法)；
[0017]2、图2为大肠埃希菌在不同培养基下的热谱曲线图(37°C，安瓿法)；
[0018]3、图3为大肠埃希菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
[0019]4、图4为肺炎克雷伯囷标准囷株热功率_时间曲线标准图谱；
[0020]5、图5为阴沟肠杆菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
[0021]6、图6为铜绿假单胞菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
[0022]7、图7为金黄色葡萄球菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
[0023]8、图8为表皮葡萄球菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
[0024]9、图9为屎肠球菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
[0025]10、图10为血液链球菌标准菌株热功率-时间曲线标准图谱；
[0026]11、图11为临床样本中大肠埃希菌热功率-时间曲线图谱；
[0027]12、图12为临床样本中肺炎克雷伯菌热功率-时间曲线图谱；
[0028]13、图13为临床样本中阴沟肠杆菌热功率-时间曲线图谱；
[0029]14、图14为临床样本中铜绿假单胞菌热功率-时间曲线图谱；
[0030]15、图15为临床样本中金黄色葡萄球菌热功率-时间曲线图谱；
[0031]16、图16为临床样本中表皮葡萄球菌株热功率-时间曲线图谱；
[0032]17、图17为临床样本中屎肠球菌标准菌株热功率-时间曲线图谱；
[0033]18、图18为临床样本中血液链球菌热功率-时间曲线图谱。
【具体实施方式】:
[0034]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种鉴定肝硬化腹水中感染细菌种类的方法作进一步的说明。
[0035]以下试验例中的病例选择、仪器及材料如下:
[0036]一、肝硬化腹水细菌感染病例及入选、排除标准:
[0037]入选标准:(I)腹水病原菌培养阳性。(2)符合炎性渗出液特点，白细胞计数>0.5X IO9 / L，或多形核粒细胞计数>0.25Χ109 / L。(3)发热、寒战、腹痛、腹泻。(4)不同程度的腹膜刺激征。(5)腹水量迅速增加、利尿剂治疗无效。(6)排除继发性、结核性及癌性腹水者。
[0038]排除标准:(I)入院前2周内应用过抗生素、微生态制剂者；(2)继发性腹膜炎患者。
[0039]按上述入选标准和排除标准，选取2005年I月至2013年3月中国人民解放军第302医院治疗的500例肝硬化合并SBP患者，男362例，女138例，年龄26-67岁。原发病情况:病毒性肝炎后肝硬化329例(乙型肝炎263例，丙型肝炎28例，乙丙型肝炎28例)，酒精性肝硬化151例，原发性胆汁性肝硬化6例，自身免疫性肝炎肝硬化5例，血吸虫性肝硬化2例，不明原因7例。肝脏储备功能情况=Child-Pugh B级101例，c级399例。
[0040]二、标准菌株:
[0041]大肠埃希菌标准菌株ATCC25922 ;肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603 ;阴沟肠杆菌标准菌株CMCC45301 ;铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853 ;金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300 ;表皮葡萄球菌标准菌株ATCC12228 ;屎肠球菌标准菌株ATCC35667 ;血液链球菌标准菌株BZW23112。
[0042]以上标准菌株均从南京便诊生物科技有限公司购买。
[0043]三、试验仪器及耗材:
[0044]TAM Air微量量热仪(瑞典Thermometric公司);BACYEC9120全自动血培养仪(美国BD公司);VITEK-32自动微生物检测系统和API鉴定条(法国生物梅里埃公司);API120cAUX自动微生物检测系统(法国生物梅里埃公司);YXQG02型高压蒸汽灭菌器(山东安得医疗科技有限公司)；超净工作台(青岛冰峰公司)；ATL-032摇床(上海堪鑫仪器设备有限公司)；微量加样器(德国eppendorf公司)；加样枪头(德国eppendorf公司)；离心管、冻存管(德国Greiner公司)；血平板(北京世纪奥科生物技术有限公司，20120108)；麦康凯琼脂平板(上海泛柯实业有限公司，20120112)。
[0045]四、试验试剂:
[0046]1、LB培养基:蛋白胨10g，酵母膏5g，NaC15g，溶于1000ml蒸馏水中，调ρΗ=7.2后分装，121.1°C高压蒸汽灭菌30min，4°C冰箱中放置备用；蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司，20120412 ;酵母膏购自北京奥博星生物技术有限责任公司，20120412 ；NaCl购自北京化工厂，20120114。
[0047]2、营养肉汤培养基:蛋白胨IOg,酵母膏3g, NaC15g,溶于1000ml蒸懼水中，调pH=7.2后分装，121.1°C高压蒸汽灭菌30min，4°C冰箱中放置备用。
[0048]3、葡萄糖肉汤培养液:蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，葡萄糖10g，加入蒸馏水至IOOOmL,搅拌加热至全部溶解，调整pH为7.3 ±0.2，分装，121 °C高压灭菌15min，冷却备用。
[0049]试骀例I:
[0050]一、肝硬化腹水细菌感染样本病原菌分布鉴别试验:
[0051]病原菌培养鉴定方法:无菌抽取500例肝硬腹水细菌感染患者的腹水各IOml注入血培养瓶增菌液，置于BACYEC9120全自动血培养仪中常规培养，阳性者即时报警。革兰阳性菌及阴性菌的鉴定采用VITEK-32系统和API鉴定条，真菌的鉴定采用API120C AUX系统。以标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC43300、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853作室内质控菌株。以上检测按照VITEK-32系统操作指南和API鉴定条使用说明进行鉴定，严格无菌操作。
[0052]I周内2次腹水培养检出相同病原菌记为一株。观察SBP致病菌的分布情况。
[0053]试验结果:500例肝硬化合并SBP患者腹水标本中141例培养阳性，共检出148株病原菌，阳性率为28.2%，单一病原菌感染比例为95.3%。148株病原菌中，革兰阴性菌115株，革兰阳性菌29株，真菌4株，厌氧菌未分离得到，病原菌构成比见表1。
[0054]表1500例肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎患者腹水检出病原菌构成比
[0055]
【权利要求】
1.一种鉴别肝硬化腹水中感染细菌种类的方法，包括下述步骤: (1)、对肝硬化病人的肝腹水样本进行培养； (2)、对步骤(I)中进行培养的样本采用安瓿法，放入微热量热仪中，得到样本中细菌生长代谢热谱曲线； (3)、将步骤(2)得到的热谱曲线与相同条件下标准细菌的热谱曲线进行对比，确定肝硬化腹水中细菌的种类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中的样本在接种量为I X IO6ce 11 s/ml条件下，在LB培养基中进行培养，所述LB培养基的组成为蛋白胨0.0lg/ml、酵母膏 0.005g/ml 和 NaCl0.005g/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中得到热谱曲线的条件为37°C等温条件下得到热谱曲线。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中是通过对比两个热谱曲线之间的出峰数量N、峰宽W和各峰出峰时间t来确定肝硬化腹水中细菌的种类。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(I)之前还包括获得标准细菌热谱曲线的过程，步骤为:在37°C恒温条件下，采用安瓿法，将标准细菌以lX106cellS/ml的浓度接种到LB培养基中，放入微热量热仪中，得到标准细菌的生长代谢热谱曲线。
【文档编号】C12Q1/04GK103499600SQ201310418427
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】赵艳玲, 肖小河, 王伽伯, 鄢丹, 郑全福 申请人:中国人民解放军第三0二医院