一种针对微量样本的转录组高通量测序方法
【专利摘要】本发明公开了一种针对微量样本的转录组高通量测序方法，包括以下步骤：微量样本总RNA提取；针对真核生物样本取样；微量RNA的扩增富集：采用SMART技术对微量RNA进行的相关富集对提取的微量总RNA进行反转录及相应的扩增富集；构建cDNA?Illumina-solexa测序文库；在富集生成的cDNA层面上进行片段化后使用Illumina?HiSeq?TM2000进行高通量测序。本发明方法所需最低起始的样本核酸量可低至10ng，避免了传统转录组高通量测序所需大量样本核酸起始量的要求，能有效应用于微量样本的转录组高通量测序，尤其对无法获得大样本量的稀有样本及特殊样本具有很高的应用前景。
【专利说明】一种针对微量样本的转录组高通量测序方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和分子生物学领域，具体涉及一种针对微量样本的转录组高通量测序方法及其应用。
【背景技术】
[0002]转录组(Transcriptome)指特定组织或细胞在某一环境或生理条件下所转录表达的所有RNA的总和，既包括编码蛋白的mRNA，也包括了各种非编码RNA，是连接基因组遗传信息与蛋白质组生物功能的纽带。转录组研究作为后基因组时代的重要组学研究，其不仅为研究基因表达及调控提供了重要的手段和方法，同时也为发掘功能基因提供了重要路径，是基因功能及结构研究的基础和出发点。
[0003]大规模转录组学检测技术的发展已有20多年，从最初的差别杂交(differentialhybridization)、mRNA 差异显不(mRNA differential display)、抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization)等技术到当前DNA芯片、基因表达系列分析(Serial Analysis of Ge ne Expression)等技术的广泛应用，转录组学研究技术得到了长足进步。而近年来，随着新一代高通量测序技术的发展，在此基础上产生的转录组测序(RNA-Seq, RNA sequencing)技术已渐成为大规模研究转录组的一种新的且更为有效的方法，并颠覆了传统转录组学的思维方式。
[0004]目前，转录组高通量测序(RNA-Seq)对样本的起始RNA量要求较高，一般都至少需要微克级(μ g)的RNA，对无法达到最小要求量的样本是不能进行进一步的转录组测序文库的构建和测序。但是，在许多情况下，如在生殖发育生物学，干细胞，癌症，考古学，临床诊断等多种研究中，都无法获得这样数量的总RNA。因为上述研究均涉及微量且稀有的样本，无法满足目前转录组高通量测序的基本RNA量的要求。由于对起始RNA量要求较高，这无形中阻碍了转录组高通量测序这项新技术在不同研究领域的进一步应用。
[0005]因此，本领域迫切需要在传统转录组高通量测序的基础上建立一种针对微量样本的转录组高通量测序方法。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于克服现有微量样本难以满足转录组高通量测序技术的要求的问题，提供一种针对微量样本的转录组高通量测序方法，旨在解决微量样本及稀有样本无法应用转录组高通量测序技术的困难。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
[0008]一种针对微量样本的转录组高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0009]a.微量样本总RNA提取；针对真核生物样本取样；
[0010]b.微量RNA的扩增 富集:采用SMART技术对微量RNA进行的相关富集对提取的微量总RNA进行反转录及相应的扩增富集；
[0011]C.构建cDNA Illumina-solexa测序文库:在富集生成的cDNA层面上进行片段化后使用Illumina HiSeq ?2000进行高通量测序。
[0012]本发明针对微量样本的转录组高通量测序方法，在实际检测中，可细化为以下步骤:
[0013]a.微量样本总RNA提取:利用市售的RNeasy Micro Kit (Qiagen, Germany)试剂盒对微量样本的总RNA进行提取。微量样本其RNA总含量不得低于IOpg.[0014]本发明只针对真核生物样本，不针对原核生物样本。本发明提取总RNA的试剂盒专门选用了针对微量样本提取的试剂盒，以保证最大限度的提取效果。经比较市售的相关试剂盒，RNeasy Micro Kit (Qiagen, Germany)试剂盒效果较好。
[0015]b.微量 RNA 的扩增富集:利用市售的 SMARTer PCR cDNA synthesis kit(Clontech, Japan)试剂盒对提取的微量总RNA进行反转录及相应的扩增富集。采用了SMART技术对提取的微量RNA进行了相关的扩增富集，以达到进一步测序建库的要求。实施步骤参照SMARTer PCR cDNA synthesis kit (Clontech, Japan)试剂盒说明书并稍加该进，具体如下:
[0016](I)第一链cDNA的合成:提取的总RNA (不低于IOpg)与1.5μ I SMARTII寡核苷酸(12μΜ)和1.5μ I cDNA Synthesis引物(12 μ Μ)混合，并用ddH20补足体系至10 μ I。在热循环仪上70°C孵育2min，然后在室温下加入5Χ第一链反应缓冲液(250mMTris-HCl, Ph8.3 ;375mmol/L KCl ;30mmol/LMgCl2) 4 μ 1，dNTP (IOmM) I μ 1，RNaseInhibiter (40U/ μ I) 0.5 μ I, Prime Script 反转录酶(200U/μ I) I μ I,并用 ddH20 补足总体系至20 μ I。42°C孵育60min，然后加2μ 10.5mol/L EDTA终止反应。
[0017](2)长距离PCR (LD-PCR)优化扩增合成第二链cDNA:取2 μ I第一链反应混合物，加入 50 X advantage PCR buffer 10 μ 1、dNTP (IOmM) 2 μ 1、SMART PCR 弓丨物(12 μ Μ) 2 μ 1、50Xadvantage polymerase mix聚合酶2 μ I,并用ddH20补足体系至100 μ I。以此反应体系配置二管反应液，分别标记为Α、Β两管。然后按如下条件进行PCR反应:95°C预变性Imin后，95°C 15sec、65°C 30sec、68°C 6min，共进行28个循环。当反应至第15个循环时，取出A管反应液至4°C保存，同时也在B管中取出15 μ I反应产物至4°C保存，接着让B管继续进行反应。然后分别在第17、21、2`4个循环时，从B管中转移15μ I反应产物至4°C保存。当反应完毕后，用电泳分析B管分别在第15、17、21、24、28个循环时的反应产物，以确定扩增合成的最优循环数。最后取进行15个循环后4°C保存的A管反应液，继续反应至确定的最优循环数。
[0018]c.构建 cDNA Illumina-solexa 测序文库，使用 Illumina HiSeq ?2000 进行高通
量测序。
[0019]本发明中cDNA Illumina-solexa测序文库的构建在传统转录组cDNAIllumina-solexa测序文库构建的流程基础上有所改进，与传统转录组cDNAIllumina-solexa测序文库的构建有所不同的是,传统转录组cDNA Illumina-solexa测序文库先在RNA层面把纯化的RNA进行片段化，然后再进行后续操作，而在本方法是在富集生成的cDNA层面上进行片段化后，再进行后续操作，这样的改进是适应于步骤b中采用SMART技术对微量RNA进行的相关富集，有利于微量RNA的转录组测序建库。本方法步骤c的具体流程如下:
[0020](l)cDNA 片段化:利用 Covaris E210 仪器(Covaris，USA)对经 SMART 技术扩增富集的cDNA进行片段化，片段长度设置为200bp。然后琼脂糖凝胶电泳检测验证。(2) cDNA双链末端修复:利用 T4DNA poIymerase>Klenow DNA polymerase 和 T4PNK,将合成的 cDNA的末端补平并进行磷酸化修饰(3) cDNA3’末端腺苷酸化:利用Klenow exo-polymerase对经过cDNA进行3'末端腺苷酸化，使其3'末端带有一个突出的腺苷酸“A”，以便于随后的接头连接。(4)测序接头连接:利用T4DNA Ligase将Illumina PE adapter接头连接到经腺苷酸化的cDNA片段的3 '末端。(5)琼脂糖电泳分离及片段回收:通过2%的琼脂糖凝胶电泳分离加有接头的cDNA片段，回收凝胶中大小为200bp±25bp的cDNA片段。(6)cDNA片段扩增构建测序文库:利用引物PCR Primer PEL O和PCR Primer ΡΕ2.0，以上述回收的cDNA片段(大小为200bp±25bp)为模板，进行15个循环的PCR扩增以富集加有接头的大小为 200bp±25bp 的 cDNA 片段。利用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Germany)对扩增产物进行纯化。经 Agilent Techno1gies2IOOBioanalyzer (Agilent, USA)检测合格后，作为测序的cDNA文库；(7)使用Illumina HiSeq?2000进行高通量测序。
[0021 ] 本发明的有益效果是:利用SMART技术对微量样本中的RNA进行有效扩增富集，克服了现有微量样本难以满足转录组高通量测序技术要求的起始上样量的问题，所需最低起始的样本核酸量可低至10ng。同时在传统转录组cDNA Illumina-solexa测序文库构建的基础上有所改进，更加有利于微量样本RNA的转录组测序建库。该方法能广泛有效应用于微量样本中的转录组高通量测序。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例的基本流程图
[0023]图2SMART合成cDNA电泳检测图
[0024]图3a测序原始数据的碱基组成情况。X轴上，l-90bp代表readl的碱基位置，91-180bp代表read2的碱基位置。碱基组成平衡的情况下，A、T曲线基本重合，G、C曲线基本重合；图3b测序原始数据的碱基质量分布。横坐标是分布在read上碱基的位置，纵坐标代表碱基的质量。图中的每个点表示某条read中相应位置的碱基质量值。从整体上看，如果低质量(〈20)的碱基比例较低，说`明测序质量比较好。
[0025]图4测序结果随机性评估。X轴表示基因的相对位置，Y轴是比对上的reads数，正常情况下reads应该是均匀分布于基因上，否则说明此样品的测序随机性不好，会影响到后续的分析。
【具体实施方式】
[0026]以下通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。但不限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0027]实施例:以牦牛卵母细胞作为微量样本的代表进行本发明的微量转录组高通量测序方法
[0028]牦牛卵母细胞微量总RNA提取
[0029]使用市售的RNeasy Micro Kit (Qiagen, Germany)试剂盒对微量样本的总RNA进行提取，参照试剂盒说明稍作调整，具体步骤如下:[0030](I)选取20个成熟的牦牛MII期卵母细胞放入1.5ml离心管中，加入350 μ I裂解液RLT (使用前加入β-巯基乙醇，终浓度为1%)，涡旋振荡或用移液器混匀。
[0031](2)将加入裂解液的细胞转移至过滤柱QIA shredder spin column上(过滤柱QIA shredder spin column 放在收集管中)，12，OOOrpm(~13，400 X g)离心 2min,收集滤液。
[0032](3)加入I倍体积(通常为350 μ I) 70%乙醇，用移液器混匀。
[0033](4)将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱RNeasy MinElute spin column上(吸附柱放在2m I RNase-Free的收集管中),轻柔地盖上管盖，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心30-60sec,弃废液，将吸附柱放回收集管中。
[0034](5)向吸附柱中加入350 μ I去蛋白液RWl，12，OOOrpm (~13，400 Xg)离心30_60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
[0035](6)向吸附柱中央加入80 μ I的DNase I工作液(取10 μ I DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μ I试剂盒自带RDD溶液，轻柔混匀配制成工作液)，室温方文置15min。
[0036](7)向吸附柱中加入350 μ I去蛋白液RWl，12，OOOrpm (~13，400 Xg)离心30_60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
[0037](8)向吸附柱中加入500μ I漂洗液鼎，室温静置2min，12，000rpm(~13，400Xg)离心30_60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。并重复漂洗一次。
[0038](9) 12，OOOrpm(~13，400Xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0039](10)将吸附柱放入一个新的RN`ase-Free离心管(本试剂盒中已经备有)中，向膜中央加入10μ1 RNase-Free dd H2O,轻柔地盖上管盖，室温放置2min。12，OOOrpm(~
13,400 Xg)离心lmin，所得溶液即为RNA溶液。
[0040]RNA的质量和含量通过使用Nanodrop ND-1000 (LabTech, USA)检测吸光度260nm/280nm(A260/A280)比值进行测定，RNA的完整性通过1.5%(w/v)凝胶电泳进行检测。
[0041]微量RNA的扩增富集:利用市售的SMARTer PCR cDNA synthesiskit (Clontech, Japan)试剂盒对提取的微量总RNA进行反转录及相应的扩增富集。采用了SMART技术对提取的微量RNA进行了相关的扩增富集，以达到进一步测序建库的要求。实施步骤参照SMARTer PCR cDNA synthesis kit (Clontech, Japan)试剂盒说明稍作调整，具体如下:
[0042](I)第一链cDNA的合成:取提取的总RNA (IOpg)与1.5 μ I SMART 11寡核苷酸(12μΜ)和1.5μ I cDNA Synthesis引物(12 μ Μ)混合，并用ddH20补足体系至10 μ I。在热循环仪上70°C孵育2min，然后在室温下加入5Χ第一链反应缓冲液(250mMTris-HCl, Ph8.3 ;375mmol/L KCl ;30mmol/LMgCl2) 4 μ 1，dNTP (IOmM) I μ 1，RNaseInhibiter (40U/ μ I) 0.5 μ I, Prime Script 反转录酶(200U/μ I) I μ I,并用 ddH20 补足总体系至20 μ I。42°C孵育60min，然后加2μ 10.5mol/L EDTA终止反应。
[0043](2)长距离PCR (LD-PCR)优化扩增合成第二链cDNA:取2 μ I第一链反应混合物，加入 50 X advantage PCR buffer 10 μ 1、dNTP (IOmM) 2 μ 1、SMART PCR 弓丨物(12 μ Μ) 2 μ 1、50Xadvantage polymerase mix聚合酶2 μ I,并用ddH20补足体系至100 μ I。以此反应体系配置二管反应液，分别标记为A、B两管。然后按如下条件进行PCR反应:95°C预变性Imin后，95°C 15sec、65°C 30sec、68°C 6min，共进行28个循环。当反应至第15个循环时，取出A管反应液至4°C保存，同时也在B管中取出15 μ I反应产物至4°C保存，接着让B管继续进行反应。然后分别在第17、21、24个循环时，从B管中转移15μ I反应产物至4°C保存。当反应完毕后，用电泳分析B管分别在第15、17、21、24、28个循环时的反应产物，以确定扩增合成的最优循环数。最后取进行15个循环后4°C保存的A管反应液，继续反应至确定的最优循环数。
[0044](3)对扩增富集的 cDNA 米用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Germany)进行产物纯化。然后通过1.2%(w/v)凝胶电泳对富集的cDNA质量进行检测(图2)。一般来说，从真核生物总RNA合成的cDNA，在1.2%凝胶电泳检测下应该出现一个0.5kb_5kb之间中等大小的抹带。
[0045]cDNA片段化:利用Covaris E210仪器(Covaris, USA),按照仪器说明书将富集的全长cDNA剪切成200bp范围的cDNA片段。然后琼脂糖凝胶电泳检测验证。
[0046]cDNA双链末端修复:在RNase-free管中配制如下反应体系(总体积100 μ I):Eluted cDNA50 μ l、10XEnd Repair Buffer 10 μ 1、25mM dNTP Mixl.6 μ 1、T4DNAPolymerase5 μ 1、Klenow DNA Polymerasel μ 1、T4PNK5 μ 1，加 ddH20 补足体系至 100 μ I。然后 20°C 反应 30min。利用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Germany)进行产物纯化。
[0047]cDNA3’末端腺苷酸化:在RNase-free管中配制如下反应体系(总体积50μ I):Eluted cDNA32 μ 1、A- Tailing Buffer5 μ 1、ImM dATPIO μ I 及 Klenow exo(3，to5’ exominus) 3 μ I。将上述混合液置于37°C下孵育30min。然后利用QIAquick PCR PurificationKit (QIAGEN, Germany)进行产物纯化。
[0048]测序接头连接:在RNase-free管中配制如下反应体系(总体积50 μ I):ElutedcDNA23μ I>2XRapid T4DNA Ligase Buffer25 μ 1> PE Adapter Oligo Mixl μ I 及 T4DNALigasel μ I。将上述混合液置于室温下孵育15min。然后利用QIAquick PCR PurificationKit (QIAGEN, Germany)进行产物纯化。
[0049]琼脂糖电泳分离及片段回收:通过2%的琼脂糖凝胶电泳分离加有接头的cDNA片段，切割凝胶中大小为200bp±25bp的cDNA片段。然后利用QIAquick Gel ExtractionKit (QIAGEN, Germany)进行胶回收。
[0050]cDNA片段扩增构建测序文库:在200 μ I的PCR反应管中配制如下混合液(总体积 50 μ I):5XPhusion BufferlO μ 1> PCR Primer PEL 01 μ 1、PCR Primer PE2.01 μ 1>25mM dNTP Mix0.5 μ 1、Phusion DNA Polymerase0.5 μ 1、ddH207 μ 1，再加入 30 μ I cDNA回收片段补足体系至50μ I。然后按如下条件进行PCR扩增:a.30seconds at98°C变性30sec 后，98°C 10sec、65°C 30sec、72°C 30sec，共进行 15 个循环，最后 72°C再次延伸 5min。利用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Germany)对产物进行纯化。经 AgilentTechno1gies2IOOBioanalyzer (Agilent, USA)检测合格后，作为 RNA-Seq 测序的 cDNA 文库。
[0051]使用Illumina HiSeq ?2000进行高通量测序，对测序基本数据分析，结果如表1所示:[0052]表1.测序基本数据分析
【权利要求】
1.一种针对微量样本的转录组高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤: a.微量样本总RNA提取；针对真核生物样本取样； b.微量RNA的扩增富集:采用SMART技术对微量RNA进行的相关富集对提取的微量总RNA进行反转录及相应的扩增富集； c.构建cDNAIllumina-solexa测序文库:在富集生成的cDNA层面上进行片段化后使用Illumina HiSeq ?2000进行高通量测序。
2.如权利要求1所述之针对微量样本的转录组高通量测序方法，其特征在于，步骤c采用如下的步骤:(I )cDNA片段化:利用Covaris E210仪器对经SMART技术扩增富集的cDNA进行片段化，片段长度设置为200bp，然后琼脂糖凝胶电泳检测验证；(2) cDNA双链末端修复:利用 T4DNA poIymerase>Klenow DNA polymerase 和 T4PNK,将合成的 cDNA 的末端补平并进行磷酸化修饰；(3) cDNA3’末端腺苷酸化:利用Klenow exo-polymerase对经过cDNA进行3'末端腺苷酸化，使其3 '末端带有一个突出的腺苷酸“A”，以便于随后的接头连接；(4)测序接头连接:利用T4DNA Ligase将Illumina PE adapter接头连接到经腺苷酸化的cDNA片段的3 ’末端； (5)琼脂糖电泳分离及片段回收:通过2%的琼脂糖凝胶电泳分离加有接头的cDNA片段，回收凝胶中大小为200bp±25bp的cDNA片段；(6) cDNA片段扩增构建测序文库:利用引物PCR Primer PEL O和PCR Primer ΡΕ2.0，以上述回收的大小为200bp±25bp的cDNA片段为模板，进行15个循环的PCR扩增以富集加有接头的大小为200bp±25bp的cDNA片段；利用QIAquick PCR Purification Kit对扩增产物进行纯化,经AgilentTechno1gies2IOOBioanalyzer 检测合格后，作为测序的 cDNA 文库；(7)使用 IlluminaHiSeq ?2000进行高通量测序。
3.如权利要求1所述之针对微量样本的转录组高通量测序方法，其特征在于，步骤a中提取总RNA的试剂盒选用市售RNeasy Micro Kit试剂盒。
4.如权利要求1所述之针对微量样本的转录组高通量测序方法，其特征在于，步骤b中采用SMART技术对提取的微量RNA进行了相关的扩增富集，以达到进一步测序建库的要求，具体实施步骤如下: Cl)第一链cDNA的合成:提取不低于IOpg的总RNA与1.5μ I SMART 11寡核苷酸(12μΜ)和1.5μ I cDNA Synthesis引物(12 μ Μ)混合，并用ddH20补足体系至10μ I;在热循环仪上70°C孵育2min，然后在室温下加入5Χ第一链反应缓冲液(250mMTris-HCl, Ph8.3 ;375mmol/L KCl ;30mmol/LMgCl2) 4 μ 1，dNTP (IOmM) I μ 1，RNaseInhibiter (40U/ μ I) 0.5 μ I, Prime Script 反转录酶(200U/μ I) I μ I,并用 ddH20 补足总体系至20 μ I。42°C孵育60min，然后加2μ 10.5mol/L EDTA终止反应； (2)长距离PCR (LD-PCR)优化扩增合成第二链cDNA:取2 μ I第一链反应混合物，加Λ 50Xadvantage PCR buffer 10 μ 1、dNTP (IOmM) 2 μ I, SMART PCR 引物(12 μ Μ) 2 μ 1、50Xadvantage polymerase mix聚合酶2 μ I,并用ddH20补足体系至100 μ I。以此反应体系配置二管反应液，分别标记为Α、Β两管；然后按如下条件进行PCR反应:95°C预变性Imin后，95°C 15sec、65°C 30sec、68°C 6min，共进行28个循环。当反应至第15个循环时，取出A管反应液至4°C保存，同时也在B管中取出15 μ I反应产物至4°C保存，接着让B管继续进行反应。然后分别在第17、21、24个循环时，从B管中转移15μ I反应产物至4°C保存。当反应完毕后，用电泳分析B管分别在第15、17、21、24、28个循环时的反应产物，以确定扩增合成的最优循 环数；最后取进行15个循环后4°C保存的A管反应液，继续反应至确定的最优循环数。
【文档编号】C12Q1/68GK103667442SQ201310419151
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】兰道亮, 李键, 熊显荣, 陈亚冰, 胡敏, 苏小珊, 钟珍, 龚蔚华 申请人:西南民族大学