一种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，公开了一种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因、含有该基因的载体、重组株、重组蛋白、多抗隆抗体及其应用。发明公开了一种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因，该基因是以尼罗罗非鱼头肾总RNA为模板，经RT-PCR和RACE方法而得到的具有尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因全长cDNA序列的基因片段；本发明构建了含该基因的载体和重组株；本发明还运用大肠杆菌原核表达了来源稳定、成本便宜的活性尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因重组蛋白，本发明还检测了该尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因重组蛋白对Hela细胞的凋亡活性，可以进一步制备为抗癌药物。制备了抗尼罗罗非鱼凋亡因子FasL多抗隆抗体，并测定了其效价，为进一步开发为定量检测罗非鱼FasL试剂盒奠定了基础。
【专利说明】—种尼罗罗非鱼调亡因子FasL基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及的是一种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因及含有该基因的载体和重组株以及该基因在制备免疫佐剂或检测试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]FasL (⑶95L)是细胞凋亡系统中的外源凋亡途径中的凋亡配体，与其靶细胞上的受体FasR(Alapo-l，⑶95)蛋白结合后，诱导靶细胞凋亡。FasL主要在活化的白血病细胞、外周血T细胞，巨噬细胞甚至一些非免疫组织有FasL的表达，Fas可以在免疫细胞、实体组织细胞表面广泛表达。
[0003]FasL是II型跨膜蛋白，它们能以膜结合形式或经基质溶解因子(金属酶Matrilysin)切割成可溶形式与死亡受体结合，但凋亡活性比膜结合形式的FasL低。
[0004]Fas属于I型跨膜蛋白，包括一个富含Cys区域，一个跨膜区，和一个胞内死亡结构域。
[0005]死亡配体和受体结合后导致受体三聚化，接头分子通过与受体DDs的蛋白质接触被招募。接头分子如FAlaDD含有DED结构域能通过同种亲和作用与起始caspases8, 10结合，被招募到受体复合物上，这种由受体，接头分子，起始caspase组成的大复合物叫死亡诱导信号复合物(DISC),两个线性的caspase8或10通过自身活化成为有活性的caspases。Caspase8或10能直接激活下游的执行Caspases。执行Caspases切割特异性的物质导致细胞结构的分解(如细胞骨架)，使蛋白质失去功能(DNA损伤修复酶Ploy-ADP-核酸聚合酶)，或者是被激活(caspase依赖性的DNA酶)。
[0006]FasL/Fas凋亡途径的功能:
T细胞稳态维持=FasL随T细胞的活化而在T细胞内表达，在T细胞克隆性增殖过程中对Fas介导的凋亡有抵抗性，但随活化时间增加，这种抵抗性逐渐减弱，最后启动激活-诱导细胞死亡(ACD)，此工程有利于防止过强的免疫反应和清除自身反应性的T细胞。人类FasL/Fas系统发育不全会导致淋巴结病，脾肿大，全身性红斑狼疮。
[0007]毒性T细胞的活性(还有NK细胞):机体细胞被外来病原体感染时，毒性T细胞会通过激活FasL/Fas途径介导被感染细胞凋亡。
[0008]此外，免疫赦免、肿瘤的抗性、产妇的耐受性等都与FasL/Fas凋亡途径相关。
[0009]尼罗罗非鱼是一 种全世界范围内重要的经济养殖鱼类，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。然而近年来，尼罗罗非鱼病害严重，尤其是链球菌病，给养殖业带来了巨大的困扰，这使得研究尼罗罗非鱼病害治病机理以及随后的预防治理工作显得尤为重要。Fasl/Fas凋亡途径是免疫系统中重要的组成部分，尼罗罗非鱼FasL凋亡因子的相关研究将为尼罗罗非鱼病害治理提供依据。例如D.L.EVANS等证明罗非鱼在海豚链球菌感染时，其自然杀伤细胞(NCC细胞)中的FasL蛋白的表达量增加，因此可以利用FasL作为一种监测鱼体受外来病原体感染的指标。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种重组尼罗罗非鱼SFasL基因；
本发明的另一目的在于提供含有该基因的载体，特别是克隆载体和表达载体；
本发明的另一目的在于提供上述载体转化的微生物菌株；
本发明的另一目的在于提供利用上述大肠杆菌重组株得到重组尼罗罗非鱼sFasL蛋白质的方法。
[0011]本发明的另一目的在于提供检测上述重组尼罗罗非鱼sFasL蛋白活性的方法。
[0012]本发明的另一目的在于提供了一种生产尼罗罗非鱼sFasL蛋白多抗隆抗体的方法，并用Elisa方法检测了其效价，及检测试剂盒开发中的应用。
[0013]发明首先提供了一种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]发明提供了一种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因编码蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0015]发明还提供了尼罗罗非鱼凋亡因子FasL胞外活性区基因sFasL，核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。该段序列是FasL基因中最关键的序列，其对应的氨基酸序列(SEQ IDNO:4)与FasL配体结合，激活细胞凋亡。
[0016]上述胞外活性区基因sFasL的克隆载体，该载体为大肠杆菌克隆载体PTZ57/R_T_sFasL0
[0017]发明还提供了一种重组株，由上述的克隆载体PTZ57/R-T-sFasL转入大肠杆菌疋col1.DH5a中所形成的大肠杆菌重组株PTZ57/R-T-sFasL_DH5 a。
[0018]发明提供了一种克隆载体或表达载体，其特征在于含有权利要求3所述尼罗罗非鱼凋亡因子FasL胞外活性区基因序列。
[0019]一种表达载体，该载体为大肠杆菌表达载体PQE30- sFasL。
[0020]一种重组株，是由权利要求7所述的表达载体PQE30- sFasL转入大肠杆菌M15中所形成的大肠杆菌重组株PQE30- sFasL-M15。
[0021]发明还提供给了一种尼罗罗非鱼sFasL重组蛋白，由所述的大肠杆菌重组株PQE30- sFasL-M15在IPTG诱导下表达的蛋白。
[0022]发明还提供了一种多抗，其特征在于该多抗为用权利要求3的尼罗罗非鱼凋亡因子sFasL的重组蛋白免疫动物得到的抗血清。上述尼罗罗非鱼sFasL重组蛋白兔源多抗，其特点在于用罗非鱼sFasL蛋白作为包被抗原的El isa检测中，结合效价高达1:8192000，可以开发为检测罗非鱼体乃至其他物种体内FasL蛋白水平的试剂盒，从而检测鱼体受外来病原体感染的情况。(D.L.EVANS等证明罗非鱼在海豚链球菌感染时，其自然杀伤细胞(NCC细胞)中的FasL蛋白的表达量增加)。
[0023]发明还提供了上述的基因或蛋白在制备抗癌制剂中的应用。发明发现上述基因或蛋白可以促进人宫颈癌细胞(Hela细胞)凋亡，可以进一步开发为抗癌药物。优选将上述的基因或蛋白进一步与放线酮组合作为抗癌药物。
[0024]以下进一步说明本发明的研究思路: 本发明的尼罗罗非鱼FasL全长基因是以尼罗罗非鱼头肾总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR和RAlaCE方法扩增而得到的，最初的引物设计是源于GENBANK预测的尼罗罗非鱼FasL mRNA序列。
[0025]本发明用于表达尼罗罗非鱼sFasL重组蛋白的基因序列是以尼罗罗非鱼FasL全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，尼罗罗非鱼FasL跨膜蛋白胞外区域所对应的基因片段。
[0026]按照上述的尼罗罗非鱼sFasL重组蛋白对应的基因序列，它正好是尼罗罗非鱼FasL全长基因199bp至696bp (相当于67位至132位氨基酸)的片段,其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。
[0027]本发明还构建了含有上述尼罗罗非鱼sFasL重组蛋白的基因序列的载体；特别是含有该基因的大肠杆菌克隆载体以及表达载体。这些载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的尼罗罗非鱼sFasL基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的相应载体的相应酶切位点(即HindIII和BamH/)之间，即构建成所需的含有尼罗罗非鱼sFasL基因的表达载体。[0028]上述含尼罗罗非鱼sFasL的大肠杆菌表达载体优选由本发明合成的尼罗罗非鱼sFasL与大肠杆菌表达载体PQE-30构建成的重组表达载体，命名为PQE30- sFasL。
[0029]本发明还用上述含有尼罗罗非鱼sFasL基因的相应表达载体构建了能高效表达尼罗罗非鱼sFasL基因的大肠杆菌重组株。
[0030]本发明的上述能表达尼罗罗非鱼sFasL大肠杆菌重组菌株优选由含有尼罗罗非鱼sFasL的表达载体PQE30- sFasL转化大肠杆菌M15而得到的菌株，命名为PQE30-sFasL_M150
[0031]本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产尼罗罗非鱼sFasL的方法。先将菌种接种在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，200转/分培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，28°C，150转/分培养，6小时后收集菌体，经分离纯化得到重组尼罗罗非鱼sFasL产品。
[0032]尼罗罗非鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的尼罗罗非鱼FasL基因和重组株PQE30- sFasL_M15，生产重组尼罗罗非鱼sFasL蛋白，并可进一步用作制备免疫佐剂或开发试剂盒。
[0033]本发明还提供了利用MTT法和DNAladder法检测重组尼罗罗非鱼sFasL蛋白活性的方法。本发明还提供了一种生产尼罗罗非鱼sFasL蛋白多抗隆抗体的方法，并用Elisa方法检测了其效价。
[0034]细胞中存在促凋亡途径和抗凋亡途径，两者协调作用控制细胞是否走向凋亡。抗凋亡途径要发挥作用，需要新合成一些蛋白质分子，而促凋亡途径中的蛋白质在细胞中有储备，无需新合成。放线酮可以抑制抗凋亡途径中的蛋白质合成，在放线酮和凋亡因子Fasl(sFasL)作用下，细胞的凋亡途径被启动，而抗凋亡途径被抑制，细胞走向凋亡。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是以尼罗罗非鱼头肾总RNA反转录得到的cDNA为模板的FasL基因中间片段PCR扩增产物的凝胶电泳分析图，其中:M.分子量标准；1.2为PCR扩增产物。
[0036]图2是尼罗罗非鱼FasL基因3’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图。其中:M.分子量标准；1.PCR扩增产物。[0037]图3是尼罗罗非鱼FasL基因5’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图。其中:M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
[0038]图4是尼罗罗非鱼全长验证PCR凝胶电泳分析图。其中:M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
[0039]图5是以尼罗罗非鱼全长DNA为模板，用KOD高保真酶，含有酶切片段的引物克隆的sFasL PCR扩增产物的凝胶电泳分析图。其中:M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
[0040]图6-1是表达载体PQE30- sFasL Bam H I和Hind III双酶切前后电泳示意图，其中:M.分子量标准；1:酶切前；2:酶切后。
[0041]图6-2是重组表达载体PQE30- sFasL的构建过程示意图。
[0042]图7是尼罗罗非鱼sFasL重组表达菌株未加IPTG和加IPTG诱导的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。其中，M:蛋白分子量；1:未用IPTG诱导的PQE30- sFasL-M15总菌；2 =IPTG诱导的 PQE30- sFasL-M15 总菌；3:1PTG 诱导的 PQE30- sFasL_M15 破碎后上清；4:sFasL纯化后的蛋白样。
[0043]图8是尼罗罗非鱼sFasL基因表达产物的Western blot鉴定图谱。其中，M:蛋白分子量；1:未用 IPTG 诱导的 PQE30- sFasL-M15 总菌；2 =IPTG 诱导的 PQE30- sFasL_M15总菌；3 =IPTG诱导的PQE30- sFasL-M15破碎后上清；4:sFasL纯化后的蛋白样。
[0044]图9是放线酮共刺激条件下下MTT法检测sFasL细胞毒性中药物浓度与细胞存活率的柱状图。
[0045]注:无放无BSA无Fa:刺激液中不含放线酮、不含BSA、不含sFasL蛋白质的实验组 有放无BSA无Fa:刺激液中含20mM放线酮、不含BSA、不含sFasL蛋白质的实验组 有放有BSA无Fa:刺激液中含20mM放线酮、含200ug/mL BSA不含sFasL蛋白质实验
组
有放Fa25:刺激液中含20mM放线酮，不含BSA，含25ug/mlsFasL蛋白质的实验组 有放Fa50:刺激液中含20mM放线酮，不含BSA，含50ug/mlSFaSL蛋白质的实验组 有放FalOO:刺激液中含20mM放线酮，不含BSA，含lOOug/mlsFasL蛋白质的实验组 有放Fa200:刺激液中含20mM放线酮，不含BSA，含200ug/mlSFaSL蛋白质的实验组 图10是无放线酮条件下用MTT法检测sFasL细胞毒性中，药物浓度与细胞存活率间的 柱状图。
[0046]注:无放无BSA:刺激液中不含放线酮、不含BSA、不含sFasL蛋白质的实验组 无放无BSA25:刺激液中不含放线酮、含25 ug/mL BSA、不含sFasL蛋白质的实验组 无放无BSA50:刺激液中不含放线酮、含50 ug/mL BSA、不含sFasL蛋白质的实验组 无放无BSA100:刺激液中不含放线酮、含100 ug/mL BSA、不含sFasL蛋白质的实验组 无放无BSA200:刺激液中不含放线酮、含200 ug/mL BSA、不含sFasL蛋白质的实验组 无放Fa25:刺激液中不含放线酮，不含BSA，含25ug/mlsFasL蛋白质的实验组 无放Fa50:刺激液中不含放线酮,不含BSA,含50ug/mlsFasL蛋白质的实验组无放FalOO:刺激液中不含放线酮，不含BSA，含lOOug/mlsFasL蛋白质的实验组无放Fa200:刺激液中不含放线酮，不含BSA，含200ug/mlSFaSL蛋白质的实验组图11是DNA ladder法检测FasL凋亡活性的电泳图，其中M=DS2000 marker ;1=含sFasL与放线酮双抗MEM培养基处理HeLa细胞IOh ；2=含sFasL与放线酮双抗MEM培养基处理HeLa细胞13h ;3=含sFasL与放线酮双抗MEM培养基处理HeLa细胞16h ；4=含sFasL与放线酮双抗MEM培养基处理HeLa细胞19h ；5=含放线酮双抗MEM培养基处理HeLa细胞19h ；6=无sFasL无放线酮双抗MEM培养基对照组HeLa细胞19h。
【具体实施方式】
[0047]以下实施例是对
【发明内容】
的阐释，而非限制。
实施例1:尼罗罗非鱼FasL基因中间片段的合成
根据GENBANK上预测的尼罗罗非鱼FasL mRNA序列为引物设计模板，设计合成两对引物，第一对引物中的上游引物(Sense)是从第342位碱基起20个碱基【5’ -GTGGGACACGACGCAITCTG】，下游引物(Ant1-sense)是从第575位碱基起17个碱基【5’ -ATCTCCCTGAGTGGCTGTGC】。第二对引物中的上游引物(Sense)是从第128位碱基起17个碱基【5’ - TGGTTGGCGTAGTGGTGCTG】，下游引物(Ant1-sense)是从第448位碱基起20个碱基【5’- ACCTTAGAATCGCCCTTGGA】。Touch-down PCR尼罗罗非鱼头肾脏总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增原第342位至591位和第128位至467位的核苷酸序列，反应条件为:95°C预变性3分钟；下边为40个循环，分为两个阶段:(I )95°C变性30秒，从61°C向52 °C每两个循环降0.3 °C，退火20秒，共30循环，72 V延伸50秒；(2 ) 95 °C变性20秒，52°C退火20秒，共10循环，72°C延伸50秒；最后72°C延伸5分钟。最后将两端片段拼接为464bp序列。
[0048]PCR扩增产物的电泳鉴定图见图1。从图1可见PCR扩增的第一个片段长约340bp的序列，第二个片段长约250bp的序列。将两个扩增产物分别连接到PTZ57/R-T载体上得到重组质粒PTZ57/R-T-FasL-l, PTZ57/R-T-FasL_2。将重组质粒PTZ57/R-T-FasL_l，PTZ57/R-T-FasL-2用PTZ57/R-T的一对通用引物进行序列测定，测序结果与GENBANK的序列进行比较，结果表明克隆的PCR产物是尼罗罗非鱼FasL基因的中间片段。
[0049]实施例2:尼罗罗非鱼FasL基因5’端片段的合成
依据已测序的FasL中间片段的序列设计了两条下游引物Fa-5’ -Rl和Fa_5’ -R4以进行嵌套PCR。第一条下游引物(Fa-5’-Rl)是从已测序的FasL中间片段的序列第199位碱基起22个碱基【5’ - CCACTGAAGACAACCCGATA】，第二条下游引物(Fa_5，-R4)是从第4位碱基起22个碱基【5’ - AATAAATGCAGCACCACTACGC】。第一次PCR以上述例I得到的PCR产物稀释产物(1:10)为模板，经降落PCR方法扩增中间片段第218位至5’端的核苷酸序列，反应条件为:94°C预变性3分钟；下边为40个循环，分为两个阶段:(I) 94°C变性20秒，从570C向47°C每个循环降0.5°C，退火20秒，共20循环，72°C延伸50秒；(2) 94°C变性20秒，47°C退火20秒，共20循环，72°C延伸50秒；最后72°C延伸10分钟。第二次PCR以第一次PCR产物稀释产物(1:10)为模板，经PCR方法扩增中间片段第25位至5’端的核苷酸序列，反应条件为:94°C预变性3分钟；下边为40个循环，分为两个阶段:(1) 94°C变性20秒，从59 °C向53 °C每个循环降0.3 °C，退火20秒，共20循环，72 °C延伸50秒；(2 )94 V变性20秒，53°C退火20秒，共20循环，72°C延伸50秒；最后72°C延伸10分钟。二次PCR扩增在257bp出现了预期条带，电泳鉴定图见图2。
[0050]将257bp的扩增产物连接到PTZ57/R-T载体上得到重组质粒PTZ57/R-T -5’-257。将重组质粒PTZ57/R-T -5’ -257用PTZ57/R-T的一对通用引物进行序列测定，测序结果与GENE BANK的序列进行比较，结果表明克隆的257bp产物是尼罗罗非鱼FasL5’端基因。
[0051]实施例3:尼罗罗非鱼FasL基因3’端片段的合成
依据已测序的FasL中间片段的序列设计了两条下游引物Fa-3’ _Fl，Fa_3’ -F2以进行嵌套PCR。第一条下游引物(Fa-3’-Fl)是从已测序的FasL中间片段的序列第320位碱基起20个碱基【5’- TCCAAGGGCGATTCTAAGGT】，第二条下游引物(F Race F2)是从第344位碱基起20个碱基【5’ - ACTAGCCAGCAAGGTCCAGC】。第一次PCR以上述例I得到的PCR产物稀释产物(1: 10)为模板，经降落PCR方法扩增中间片段第320位至5’端的核苷酸序列，反应条件为:94°C预变性3分钟；下边为40个循环，分为两个阶段:(1)94°C变性20秒，从60°C向52 0C每个循环降0.4°C，退火20秒，共20循环，72 °C延伸60秒；(2 )94 V变性20秒，52 °C退火20秒，共20循环，72°C延伸60秒；最后72°C延伸10分钟。第二次PCR以第一次PCR产物稀释产物(1: 10)为模板，经PCR方法扩增中间片段第344位至5’端的核苷酸序列，反应条件为:94°C预变性3分钟；下边为40个循环，分为两个阶段:(1)94°C变性20秒，从59°C向53°C每个循环降0.3°C，退火20秒，共20循环，72°C延伸60秒；(2)94°C变性20秒，53°C退火20秒，共20循环，72°C延伸60秒；最后72°C延伸10分钟。二次PCR扩增在514bp出现了预期条带，电泳鉴定图见图3。
[0052]将2514bp的扩增产物连接到PTZ57/R-T载体上得到重组质粒PTZ57/R-T-3’ -514。将重组质粒PTZ57/R-T -3’ -514用PTZ57/R-T的一对通用引物进行序列测定，测序结果与GENE BANK的序列进行比较，结果表明克隆的514bp产物是尼罗罗非鱼FasL3’
端基因。
`[0053]实施例4:尼罗罗非鱼FasL基因全长序列的拼接及ORF (开放阅读框)验证 将已经测序的FasL中间片段、5’ RACE片段和3’ RACE片段进行拼接，得到尼罗罗非鱼
FasL基因的全长，为1028bp，并从71bp处的起始密码开始，到其终止密码结束，推测出其氨基酸序列。FasL基因全长和推测的氨基酸序列见序列表。
[0054]根据拼接好的尼罗罗非鱼FasL基因cDNA全序列，设计合成引物，上游引物是在ORF前端第20位碱基起的19个碱基【5’ -TGTCACCGCTCCGCTCTAT】;下游引物是ORF后第87位碱基起的20个碱基，【5’ -TCCACGAAGATGTTTGAGCC】。用高保真KOD酶，及反转录产物为模板，PCR验证FasL 0RF，根据验证的ORF序列，PCR扩增产物的电泳鉴定图见图4，从图4可见PCR扩增了一段长约，823bp的序列。
[0055]将扩增产物回收测序，测序结果与GENE BANK的序列进行比较，发现GENE BANK预测序列完全符合本实验结果。
[0056]实施例5:尼罗罗非鱼sFasL基因的合成
设计合成两段引物合成sFasL基因，上游引物是在ORF第199位碱基起的25个碱基前加上BamHI的限制酶切位点以及保护碱基【5’ - CGCGGATCCGAAAAACATTTCTCAGCAGAAGATA],共34bp ;下游引物是在第673位碱基起的27个含有终止密码子的碱基，加上HandIII的限制酶切位点和保护碱基【5’ - CCCAAGCITTTATAGITTGTATATCCCAAAGnTGT】，共36bp。以尼罗罗非鱼FasL基因全长克隆PCR产物为模板，经PCR方法扩增尼罗罗非鱼FasL基因第67位至第232位氨基酸序列相应的DNA序列即尼罗罗非鱼sFasL基因，PCR反应条件为:94°C预变性3分钟；下边为40个循环:94°C变性20秒，51.5°C退火20秒，72°C延伸55秒；最后72°C延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图5。从图5可见PCR扩增了一段长约516bp的序列。
[0057]将516bp的扩增产物连接到PTZ57/R-T载体上得到重组质粒PTZ57/R-T -sFasL。将重组质粒PTZ57/R-T -sFasL用PTZ57/R-T的一对通用引物进行序列测定，测序结果与已测序的ORF序列及两端位点序列进行比较，结果表明克隆的516bp产物是尼罗罗非鱼sFasL表达基因。
[0058]实施例6:含尼罗罗非鱼FasL基因的大肠杆菌表达载体PQE30-sFasL的构建 质粒PTZ57/R-T -sFasL经限制酶BamHI和HindIII酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.?
Gel Extraction Kit回收。接着再将PQE30空载体用限制酶BamHI和HindIII酶切后，分离纯化3.5kb的大片段，与516bp的尼罗罗非鱼FasL基因片段按1:3混合，用Ferment T4连接酶4°C连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌M15大肠杆菌感受态细胞中，筛选具氨苄青霉素和卡那霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制酶Kpn I及Not I双酶切重组质粒，得到516bp和3.5kb的两个片段，大小分别与尼罗罗非鱼FasL基因和表达载体PQE30大小相同，证明尼罗罗非鱼FasL基因已克隆入大肠杆菌表达载体PQE30中，重组质粒命名为PQE30-sFasL。质粒酶切分析图和构建图分别见图6_1及图6_2。 [0059]实施例7:能高效表达尼罗罗非鱼FasL的大肠杆菌重组株PQE30-sFasL_M15的构建
CaCl2法将PQE30-sFasL转化E coli Ml 5菌株，在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含PQE30-sFasL的重组转化子PQE30_sFasL_M15。
[0060]实施例8:利用大肠杆菌基因工程菌PQE30-sFasL_M15生产重组尼罗罗非鱼凋亡因子sFasL
挑取大肠杆菌基因工程菌PQE30-sFasL-M15单菌落接种在含有50ug/ml氨苄青霉素和30ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，200转/分培养过夜，次日按1:50接种量接种于适当体积的相同培养基中，37°C培养至A_为0.5~0.6，加入IPTG (终浓度为0.4mmol/I )，于28°C诱导培养6小时后收菌。合成的尼罗罗非鱼凋亡因子sFasL在大肠杆菌基因工程菌PQE30-sFasL-M15中已获得高效表达。
[0061]取少量细胞加5 X电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳，显示经诱导的PQE30-sFasL-M15在约20.3kD的位置上出现一条蛋白带，未诱导的PQE30-sFasL-M15几乎不出现此带，证明尼罗罗非鱼凋亡因子sFasL在PQE30-sFasL-M15中诱导表达，将超声破碎后的诱导菌液离心收集上清，电泳后发现目的蛋白大部分存在于上清中，以可溶形式表达，目的蛋白经纯化后得到单一条带如图7。
[0062]将重组尼罗罗非鱼凋亡因子sFasL采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠抗与sFasL融合表达的His标签单抗，二抗为羊抗鼠IgG_AP。结果见图8，显示鼠抗His标签单克隆抗体能识别与His标签融合表达的sFasL蛋白，结合PQE30-sFasL重组子的DNA测序结果，证明得到的蛋白是重组尼罗罗非鱼凋亡因子sFasL。
[0063]实施例9:利用MTT法和DNA ladder法检测重组尼罗罗非鱼凋亡因子sFasL的蛋白活性
1.MTT 法
接种HeLa细胞:将对数期的HeLa细胞调整浓度至I X IO5,将稀释的细胞接种至96孔板的3-11列，每孔IOOuL,板四周孔加入PBS，消除水分蒸发引起的误差。将板置于37度，5% co2培养箱培养18h。
[0064]sFasL孵育HeLa细胞:配置孵育液:取20mLMEM培养基，加入200uL双抗配成MK，取出15mL加入15ul 20mM放线酮储备液(终浓度20um/mL=5.6ug/mL配成MK放，在2mL MK加8uL50ug/uL的sFasL原液,配置成含200ug/mL sFasL的MK放F,用0.22um微孔滤膜过滤除菌，取出ImL于另一管中，加入ImL无FBS加双抗的MEM培养基配成100ug/mL孵育液，依次浓度为50ug/mL和25ug/mL孵育液。如下加入96孔板:
【权利要求】
1.一种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因，该基因其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL基因编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.—种尼罗罗非鱼凋亡因子FasL胞外活性区基因sFasL，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；或其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
4.如权利要求3所述基因的克隆载体或表达载体，其特征在于所述克隆载体为大肠杆菌克隆载体PTZ57/R-T-sFasL ;所述表达载体为PQE30- sFasL。
5.一种重组株，其特征在于是由权利要求4所述的克隆载体PTZ57/R-T-sFasL转入大肠杆菌疋col1.0册0中所形成的大肠杆菌重组株？了257/1?-1'-8?381-0册0。
6.一种克隆载体或表达载体，其特征在于含有权利要求3所述尼罗罗非鱼凋亡因子FasL胞外活性区基因序列。
7.一种重组株，其特征在于是由权利要求7所述的表达载体PQE30- sFasL转入大肠杆菌M15中所形成的大肠杆菌重组株PQE30- sFasL-M15。
8.—种尼罗罗非鱼sFasL重组蛋白，其特征在于是由权利要求8所述的大肠杆菌重组株PQE30- sFasL-M15在IPTG诱导下表达的蛋白。
9.如权利要求1或3所述基因，或权利要求2或9所述蛋白，在制备抗癌制剂中的应用，所述癌为宫颈癌。
10.一种抗癌药物，其特征在于含有权利要求2或9所述蛋白，并含有放线酮。
【文档编号】C12N15/70GK103642812SQ201310438243
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】吴金英, 马太洋, 李文笙 申请人:中山大学