侦测膀胱癌的新颖表基因生物标记及其方法
【专利摘要】一种侦测膀胱癌的新颖表基因生物标记及其方法，该方法包含：提供一受测检体；检测该受测检体的基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态，该目标基因选自由ZNF671、PTPRR、SOX1、PAX1、ZNF582、AJAP1、SOX17、EDN3、ST6GAL2、ZNF614、PTGDR、SYT9、SOX8、HS3ST2、POU4F3、ADRA1D、MAGI2、EPO、NEFH、POU4F2、STC2以及THRB所组成的群组至少一个；以及根据该目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有癌症或癌前病变，或作为治疗预后的指标。本发明也揭示一种侦测膀胱癌的新颖表基因的生物标记，其中该生物标记包含一目标基因的CpG位点且该位点被甲基化，可在尿液中被侦测出。
【专利说明】侦测膀脯癌的新颖表基因生物标记及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种侦测膀脫癌的新颖表基因生物标记及其方法，特别是指一种W甲 基化DNA作为生物标记的膀脫癌症筛检的方法。
【背景技术】
[0002] 膀脫癌是世界第六大常见癌症，并在台湾西南部的发病率特别高。约90%的膀脫 癌是泌尿道上皮癌（urothelial carcinoma, UC),又称移行细胞癌（transitional cell carcinoma, TCC)，另外约8%的膀脫癌是鱗状细胞癌，约2%是腺癌。虽然膀脫癌患者的死亡 率低，然而由于膀脫癌属于高复发肿瘤性质，因此长期追踪W及反复的膀脫镜检查是必要 的。对于详细的膀脫检查，检测膀脫是否有异状，须利用膀脫镜直接经由患者的尿道，大多 数患者须遭受该些侵入性的检查。
[0003] 基因的缺失（genomic deletions)被认为是肿瘤形成的重要因素，长久W来，我们 都习惯了基因组中的编码是仰赖ATCG四个碱基排列的观念，Knudson早在1975年即提出双 重受创理论（two-hit theory),指出一些同源肿瘤抑制基因伴随的突变或缺失可能造成或 易造成癌症的发生；然而，其他影响表现型（phenotype)的讯息可能存于被修饰过的碱基 5-甲基胞嚼巧巧-methylcytosine)中，5-甲基胞嚼巧被发现存在于哺乳类动物细胞内的 回文序列5'-CpG-3'中，在哺乳类动物细胞内除了一些被称为"CpG岛"(CpG islands，CGIs) 的区域之外，大多数的CpG双核巧酸对都被甲基化，CpG岛是指在大约1000个碱基对（1肺） 的区域内含有大量的GC- W及CpG-，通常位于基因的附近，且在广泛表现的基因的启动 子附近被发现。胞嚼巧的甲基化发生在DNA合成后，自一甲基捐赠者S-腺核巧甲硫胺酸 (S-adenosylmethionine，SAM)将一甲基经酵素转移到胞嚼巧第5个碳的位置上，该酵素反 应由DNA甲基转移酶值NA methyltransferase，DNMTs)执行，DNMT1是哺乳类动物主要的 甲基转移酶，负责将半甲基化位置复制后修复（post-replicative restoration)为全甲基 化，被称为维持甲基化（maintenance methylation);反之，DNMT3A及DNMT3B则被认为主要 负责甲基化新的位置，进行一种称为重新甲基化（de novo met的lation)的步骤。
[0004] CpG双核巧酸对甲基化的遗失（loss of methylation)，意即一般的低度甲基 化，是癌细胞内的第一个表基因异常（epigenetic油normality);然而，在过去几年内 的研究却显示，特定位置（例如；一些肿瘤抑制基因）的高度甲基化（site-specific hypermethylation)与其功能的丧失有关，该可能会在癌症生成时提供选择优势 (selective advantages);在启动子区域上CpG岛的高度甲基化，可W借由组蛋白修饰 化istone modification)伴随接续而来的基因默化现象（gene silencing),来引起染色质 改造（C虹omatin remodeling);除了染色体缺失及基因突变之外，经由启动子的高度甲基 化所造成肿瘤抑制基因的表基因默化现象（epigenetic silencing)也常见于人类癌症中。
[0005] 因此，一个敏感的和非侵入性的检测法，对于膀脫癌患者是迫切需要的，而DNA甲 基化是一种用于癌症检测理想的生物标志物。由于遗传与环境交互作用的特性，肿瘤抑制 基因甲基化程度因不同的基因及不同的族群而异，不同的疾病也会有不同的甲基化表现型 (methylator地enotypes);然而，膀脫癌中有何特定的基因会被甲基化，W及需要多少基 因方可达到临床应用的需求，该些问题仍是未来需要被确认的议题。
[0006] 上述现有的膀脫癌筛检方法仍有诸多缺失，确实不是好的方法，而急待加W改良。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的即在于提供一种侦测膀脫癌的新颖表基因生物标记及其方法，该方 法包含：提供一受测检体；检测该受测检体的基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列 甲基化状态，该目标基因选自由 ZNF671、PTPRR、S0X1、PAX1、ZNF582、AJAP1、S0X17、EDN3、 ST6GAL2、ZNF614、PTGDR、SYT9、S0X8、服3ST2、P0U4F3、ADRA1D、MAGI2、EP0、肥即、P0U4F2、 STC2 W及THRB所组成的群组中的至少一个；W及根据该目标基因甲基化状态的有无，判断 该检体是否具有癌症或癌前病变，或作为治疗预后的指标。
[0008] 为达成前述发明目的，其中该目标基因为ZNF671与另一目标基因选自由PTPRR、 S0X1、PAX1、ZNF582、AJAP1、S0X17、邸N3、ST6GAL2、ZNF614、PTGDR、SYT9、S0X8、服3ST2、 P0U4F3、ADRA1D、MAGI2、EP0、肥即、P0U4F2、STC2 W及 THRB 所组成的群组中的至少一个。
[0009] 为达成前述发明目的，其中该受测检体包含尿液、粪便、血液、腹水、姨、口腔黏膜 细胞、胃液、胆汁、或手术后的膀脫癌组织离体样本。
[0010] 为达成前述发明目的，其中该目标基因的CpG序列甲基化状态检测方法包含甲基 化特异性聚合酶连锁反应（methylation-specific PCR，MSP)、定量甲基化特异性聚合酶 连锁反应（quantitative methylation-specific PCR, QMSP)、亚硫酸盐定序 〇3isulfite sequencing, BS)、微数组（microarrays)、质谱仪分析（mass spectrometer)、变性高效液 相色谱（denaturing hi曲-performance liquid C虹omatography，DHPLC)、及焦磯酸定序 (pyrosequencing)中的至少一者。
[0011] 为达成前述发明目的，其中该目标基因甲基化的状态由引子对序列所侦测，各个 目标基因的引子对分别为；ZNF671引子对为SEQ ID No ;1-2、PTPRR引子对为SEQ ID No : 3-4、S0X1 引子对为 SEQ ID No ;5-6、PAX1 引子对为 SEQ ID No ;7-8、ZNF582 引子对为 SEQ ID No ;9-10、AJAP1 引子对为 SEQ ID No S0X17 引子对为 SEQ ID No ;13-14、邸N3 引子对为569 10齡；15-16、5166412引子对为569 10齡；17-18、2^614引子对为569 10 No ;19-20、PTGDR 引子对为 SEQ ID No ;21-22、SYT9 引子对为 SEQ ID No ;23-24、S0X8 引子 对为 SEQ ID No ;25-26、HS3ST2 引子对为 SEQ ID No ;27-28、P0U4F3 引子对为 SEQ ID No : 29-30、ADRAlD 引子对为 SEQ ID No ;31-32、MAGI2 引子对为 SEQ ID No ;33-34、EP0 引子对 为 SEQ ID No ;35-36、肥閒引子对为 SEQ ID No ;37-38、P0U4巧引子对为 SEQ ID No ; 39-40、 STC2引子对为SEQ ID No ;41-42、THRB引子对为SEQ ID No ;43-44 ;其中该引子包含至少 有50%的序列同一性、互补性或至少连续十个核巧酸相同的序列。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种侦测膀脫癌的新颖表基因的生物标记，其中该 生物标记系包含一目标基因的CpG位点且该位点被甲基化；其中该目标基因的CpG位点 序列选自由 ZNF671 (SEQ ID No ;1-2)、PTPRR(SEQ ID No ;3-4)、S0X1 (SEQ ID No ;5-6)、 PAXKSEQ ID No ：7-8). ZNF582(SEQ ID No ：9-10). AJAP1(SEQ ID No ： 11-12). S0X17 (SEQ IDNo;13-14)、邸N3(SEQIDNo;15-l的、ST6GAL2(SEQIDNo;17-18)、ZNF614(沈QIDNo: 19-20)、PTGDR(沈Q ID No;21-22)、SYT9(SEQ ID N〇;23-24)、SOX8(沈Q ID No;25-26)、 HS3ST2(SEQ ID No ：27-28). P0U4F3 (SEQ ID No ：29-30). ADRAID (SEQ ID No ：31-32). MAGI2(SEQ ID N〇;33-：M)、EPO(沈Q ID No;35-36)、肥即（SEQ ID N〇;37-38)、POU4F2GEQ ID N〇;39-40)、STC2(SEQ ID No;41-42) W及 THRB(SEQ ID No;43-44)所组成的群组中的 至少一个。
[001引为达成前述发明目的，其中该目标基因的CpG位点序列为ZNF67USEQ ID No : 1-2)与另一目标基因的CpG位点序列选自由PTPRR(SEQ ID N0;3-4)、SOX1(SEQ ID No: 5-6)、PAXl(SEQ ID No;7-8)、ZNF582(SEQ ID N0;9-10)、AJAP1(SEQ ID No;ll-12)、 S0X17(SEQIDNo;13-14)、抓N3(SEQIDNo;15-16)、ST6GAL2(SEQIDNo;17-18)、 ZNF614(沈Q ID N0;19-20)、PTGDR(沈Q ID No;21-22)、SYT9(SEQ ID N0;23-24)、SOX8(沈Q 10齡；25-26)、服3512(569 10齡；27-28)、？0則。3(沈9 10齡；29-30)、40^10 669 10 No;31-32)、MAGI2(SEQ ID N0;33-：M)、EPO(沈Q ID No;35-36)、肥即（SEQ ID No;37-38)、 P0U4F2(SEQ ID No ;39-40)、STC2(SEQ ID No ;41-42) W及THRB(SEQ ID No ;43-44)所组成 的群组中的至少一个。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种目标基因在制备用于膀脫癌症筛检试剂中的用 途，其为受测检体内目标基因组中DNA中CpG序列甲基化的状态，其中该目标基因系选自 由 ZNF671、PTPRR、SOX 1、PAX 1、ZNF582、AJAP1、SOX 17、EDN3、ST6GAL2、ZNF614、PTGDR、SYT9、 S0X8、服3ST2、P0U4F3、ADRAID、MAGI2、EPO、肥即、P0U4F2、STC2 W及 THRB 所组成的群组中 的至少一个。
[001引为达成前述发明目的，其中该目标基因为ZNF671与另一目标基因选自由ZNF671、 PTPRR、S0X1、PAX1、ZNF582、AJAP1、S0X17、EDN3、ST6GAL2、ZNF614、PTGDR、SYT9、S0X8、 服3512、？0則。3、40^10、祖612、6?0、肥即、？0則。2、51'〔2^及了皿8所组成的群组中的至少 一个。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 请参阅W下有关本发明一优选实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发 明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为：
[0017] 图1为利用qMSP分析膀脫癌与正常人尿液样本ZNF671基因甲基化程度。
[0018] 图2为利用qMSP分析膀脫癌与正常人尿液样本PTPRRR、S0X1、PAX1与ZNF582基 因甲基化程度。
[001引 图3为利用qMSP分析膀脫癌与正常人尿液样本AJAPUS0X17、邸N3与ST6GAL2基 因甲基化程度。
[0020] 图4为利用qMSP分析膀脫癌与正常人尿液样本ZNF614、PTGDR、SYT9与S0X8基因 甲基化程度。
[0021] 图5为利用qMSP分析膀脫癌与正常人尿液样本服3ST2、P0U4F3、ADRA1D与MAGI2 基因甲基化程度。
[0022] 图6为利用qMSP分析膀脫癌与正常人尿液样本EP0、肥FH与P0U4巧基因甲基化 程度。
[0023] 图7为利用qMSP分析膀脫癌与正常人尿液样本STC2与THRB基因甲基化程度。
[0024] 图8为利用qMSP分析膀脫癌与正常人尿液样本H0XB3基因甲基化程度。
【具体实施方式】
[0025] 本发明为一种侦测膀脫癌的新颖表基因生物标记及其方法，该方法包含；提供一 受测检体；检测该受测检体的基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态，该目 标基因选自由 ZNF671、PTPRR、S0X1、PAX1、ZNF582、AJAP1、S0X17、EDN3、ST6GAL2、ZNF614、 PTGDR、SYT9、S0X8、服3ST2、P0U4F3、ADRA1D、MAGI2、EP0、肥即、P0U4F2、STC2 U及 THRB 所 组成的群组中的至少一个；W及根据该目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有 癌症或癌前病变，或作为治疗预后的指标。
[0026] 本发明也掲示一种侦测膀脫癌的新颖表基因的生物标记，其中该生物标记包含一 目标基因的CpG位点且该位点被甲基化。
[0027] 本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，都为该所属领域 的技术人员可共同了解的意义。
[0028] 术语"侦测"、"筛检"并非确定性诊断方法，根据现有技术中的医学知识和本专利 申请公开的通过检测目标基因在各类检体CpG序列甲基化的状态所获得的信息本身，并不 能够直接得出诊断结果或健康状况，即是否患有癌症的诊断结果，而只是属于"对已经脱离 人体或动物体的组织、体液或排泄物进行处理或检测W获取作为中间结果的信息的方法， 或处理该信息的方法"，为"不属于诊断方法的发明"。依本领域具通常知识者（例如；医生、 医学研究人员）皆了解，要诊断是否患癌一定要进行病理切片检查。易言之，本发明应作为 一种膀脫癌侦测、筛检的方法，而非确定性诊断方法。因此本发明并非法定不予专利的诊断 方法。
[0029] 术语"受测检体"指离体的受测样本，该样本包括前述的腹水、血液、尿液、粪便、 姨、口腔黏膜细胞、胃液、胆汁、或手术后的癌症组织等离体的检体样本。本发明的癌症筛检 方法用于检测该些离体样本中目标基因甲基化的状态，W作为各类癌症的筛检指标。本发 明所提供的癌症筛检方法及其筛检指标，可供检测研究人员于实验室中进行检测。
[0030] 术语"治疗"、"治疗中"及其类术语指延缓、改善、减少或逆转目前正折磨着患者的 该病症或该病症相关的任何症状的方法W及预防该病症或其任何正出现的症状的方法。
[0031] 本发明W下面的实施例予W示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明 所用的药物、生物材料都易于取得，下列仅为示例可取得的管道。
[0032] 本发明W下面的实施例予W示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
[003引细胞株的信息
[0034] 人类膀脫泌尿道上皮细胞（Human urothelial cell,皿C)培养在尿路上皮细胞培 养液扣CM)中。
[00对病人检体
[0036] 从台湾嘉义基督教医院膀脫癌患者，收集100位膀脫癌扣C)样本（表一）与9位 相邻正常区域样本。收集27位膀脫癌患者的尿液样本，与19位非癌症个体的尿液样本作 为对照组。
[0037] 表一、膀脫癌临床样本
【权利要求】
1. 一种侦测膀胱癌的新颖表基因生物标记及其方法，该方法包含： 提供一受测检体； 检测该受测检体的基因组DNA中至少一个目标基因的CpG序列甲基化状态，该目标基 因选自由ZNF6 71、PTPRR、SOX1、PAX1、ZNF58 2、AJAP1、SOX17、EDN3、ST6GAL2、ZNF614、PTCDR、 SYT9、S0X8、HS3ST2、P0U4F3、ADRA1D、MAGI2、EPO、NEFH、P0U4F2、STC2 以及THRB所组成的 群组至少一个；以及 根据该目标基因甲基化状态的有无，判断该检体是否具有癌症或癌前病变，或作为治 疗预后的指标。
2. 如权利要求1所述的侦测膀胱癌的新颖表基因生物标记及其方法，其特征在于：其 中该目标基因为ZNF671与另一目标基因选自由PTPRR、S0X1、PAX1、ZNF582、AJAP1、S0X17、 EDN3、ST6GAL2、ZNF614、PTCDR、SYT9、S0X8、HS3ST2、P0U4F3、ADRA1D、MAGI2、EPO、NEFH、 P0U4F2、STC2以及THRB所组成的群组至少一个。
3. 如权利要求1所述的侦测膀胱癌的新颖表基因生物标记及其方法，其特征在于：其 中该受测检体包含尿液、粪便、血液、腹水、痰、口腔黏膜细胞、胃液、胆汁、或手术后的膀胱 癌组织离体样本。
4. 如权利要求1所述的侦测膀胱癌的新颖表基因生物标记及其方法，其特征在于： 其中该目标基因的CpG序列甲基化状态检测方法包含甲基化特异性聚合酶连锁反应 (methylation-specific PCR，MSP)、定量甲基化特异性聚合酶连锁反应（quantitative methylation-specific PCR，QMSP)、亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing，BS)、微数 组（microarrays)、质谱仪分析（mass spectrometer)、变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)、及焦憐酸定序（pyrosequencing)中 至少一者。
5. 如权利要求1或2所述的侦测膀胱癌的新颖表基因生物标记及其方法，其特征在 于：其中该目标基因甲基化的状态由引子对序列所侦测，各个目标基因的引子对分别为： ZNF671 引子对为 SEQ ID No :1-2、PTPRR 引子对为 SEQ ID No :3-4、S0X1 引子对为 SEQ ID No :5-6、PAX1 引子对为 SEQ ID No :7-8、ZNF582 引子对为 SEQ ID No :9-10、AJAP1 引子对 为 SEQ ID N〇:11-12、SOX17 引子对为 SEQ ID No:13-14、EDN3 引子对为 SEQ ID No:15-16、 ST6GAL2 引子对为 SEQ ID No :17-18、ZNF614 引子对为 SEQ ID No :19-20、PTCDR 引子对 为 SEQ ID No :21-22、SYT9 引子对为 SEQ ID No :23-24、S0X8 引子对为 SEQ ID No :25-26、 HS3ST2 引子对为 SEQ ID N〇:27-28、POU4F3 引子对为 SEQ ID N〇:29-30、ADRA1D 引子对 为 SEQ ID No :31-32、MAGI2 引子对为 SEQ ID No :33-34、EP0 引子对为 SEQ ID No :35-36、 NEH1 引子对为 SEQ ID No :37-38、P0U4F2 引子对为 SEQ ID No :39-40、STC2 引子对为 SEQ ID No:41-42、THRB引子对为SEQ ID No:43-44;其中该引子包含至少有50%的序列同一性、 互补性或至少连续十个核苷酸相同的序列。
6. -种侦测膀胱癌的新颖表基因的生物标记，其中该生物标记系包含一目标基因的 CpG位点且该位点被甲基化；其中该目标基因的CpG位点序列选自由ZNF671 (SEQ ID No : 1-2).PTPRR(SEQ ID No ：3-4),S0X1(SEQ ID No ：5-6),PAX1(SEQ ID No ：7-8),ZNF582(SEQ ID No ： 9-10), A JAP 1 (SEQ ID No ： 11-12), S0X17 (SEQ ID No ： 13-14), EDN3 (SEQ ID No： 15-16)、ST6GAL2(SEQIDN〇:17-18)、ZNF614(SEQIDN〇 :19-20)、PTO)R(SEQIDN〇: 21-22)、SYT9(SEQ ID No :23-24)、S0X8(SEQ ID No :25-26)、HS3ST2(SEQ ID No :27-28)、 P0U4F3(SEQ ID N〇:29-30)、ADRA1D(SEQ ID No:31-32)、MAGI2(SEQ ID N〇:33-34)、EPO(SEQ ID No ： 35-36), NEFH(SEQ ID No ： 37-38), P0U4F2 (SEQ ID No ： 39-40), STC2 (SEQ ID No： 41-42)以及THRB(SEQ ID No:43-44)所组成的群组中的至少一个。
7. 如权利要求6所述的侦测膀胱癌的新颖表基因的生物标记，其特征在于：其中该目 标基因的CpG位点序列为ZNF671 (SEQ ID No :1-2)与另一目标基因的CpG位点序列选自 由 PTPRR(SEQ ID N〇:3-4)、SOX1(SEQ ID No:5-6)、PAXl(SEQ ID No:7-8)、ZNF582(SEQ ID N〇:9-10)、AJAP1(SEQ ID N〇:11-12)、SOX17(SEQ ID No:13-14)、EDN3(SEQ ID No:15-16)、 ST6GAL2(SEQ ID No:17-18)、ZNF614(SEQ ID N〇:19-20)、PT⑶R(SEQ ID No:21-22)、 SYT9(SEQ ID N〇:23-24)、SOX8(SEQ ID No:25-26)、HS3ST2(SEQ ID N〇:27-28)、POU4F3(SEQ ID No :29-30)、ADRA1D(SEQ ID No :31-32)、MAGI2(SEQ ID No :33-34)、EP0(SEQ ID No : 35-36)、NEFH(SEQ ID N〇:37-38)、POU4F2(SEQ ID N〇:39-40)、STC2(SEQ ID No:41-42)以 及THRB(SEQ ID No :43-44)所组成的群组中的至少一个。
8. -种目标基因在制备用于膀胱癌症筛检试剂中的用途，其为受测检体内目标基因 组中DNA中CpG序列甲基化的状态，其中该目标基因选自由ZNF671、PTPRR、S0X1、PAX1、 ZNF582、AJAP1、S0X17、EDN3、ST6GAL2、ZNF614、PTCDR、SYT9、S0X8、HS3ST2、P0U4F3、ADRA1D、 MAGI2、EPO、NEH1、P0U4F2、STC2以及THRB所组成的群组中的至少一个。
9. 如权利要求8所述的目标基因在制备用于膀胱癌症筛检试剂中的用途，其特征在 于：其中该目标基因为ZNF671与另一目标基因选自由PTPRR、S0X1、PAX1、ZNF582、AJAP1、 S0X17、EDN3、ST6GAL2、ZNF614、PTCDR、SYT9、S0X8、HS3ST2、P0U4F3、ADRA1D、MAGI2、EP0、 NEH1、P0U4F2、STC2以及THRB所组成的群组中的至少一个。
【文档编号】C12N15/11GK104513851SQ201310465313
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】陈永恩, 陈丕哲, 徐政达, 叶佳铭, 赖鸿政, 张德卿, 沈正煌 申请人:陈永恩, 戴德森医疗财团法人嘉义基督教医院