一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法，其步骤为：将聚乙烯醇、交联剂配置成混合水溶液，把酰化酶加入到上述聚乙烯醇与交联剂的混合水溶液中搅拌均匀，得酰化酶聚乙烯醇凝胶水溶液，经成形固化工艺处理得到聚乙烯醇固定化酰化酶。该聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶用于合成头孢类抗生素中间体7-ACA或7-ADCA。使用PVA来固载生物酶可以使酶活回收达到80%以上，并且固定化酰化酶更加稳定，重复使用达50批次以上，大大降低了酰化酶在7-ADCA和7-ACA生产中的应用成本，提高了生产效率和产品质量。
【专利说明】一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固定化酰化酶的制备方法及其在合成头孢类抗生素中间体7-ACA或7-ADCA中的应用。
【背景技术】
[0002]头孢菌素是一类抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、毒性低的抗生素，也是目前临床上使用最广泛的一类抗生素，从70年代开发至今，已经研制和生产到了第四代头孢菌素品种。
[0003]头孢菌素主要由7-ACA (7-氨基头孢烷酸，化学名:3_乙酰氧甲基_5_硫_7_氨基-8-氧-1-氮杂二环辛-2-烯-2羧酸)和7-ADCA (7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸)为母核半合成得到，70%以上的头孢菌素药物由7-ACA和7-ADCA出发经各种途径合成得到。
[0004]现已发展出多种合成上述两种母核的化学和酶法生产工艺，其中酶法因为避免了有毒化学试剂的使用，简化了生产工艺，大大降低了能耗和废物排放，其所得的产品在成本和质量上都比化学法更具优势。所有的酶法生产7-ADCA和7-ACA的工艺中，水解其氨基侧链是必经反应过程，且是达到高产率和高质量的关键步骤。酶催化水解工艺包括使用戊二酰-7-ACA酰化酶催化脱去戊二酰-7-ACA和戊二酰-7-ADCA侧链得到7-ACA和7-ADCA，使用头孢菌素C酰化酶水解头孢菌素C和去乙酰氧基头孢菌素C，脱去alfa-氨基-己二酰基分别得到7-ACA和7-ADCA，以及使用己二酰-7-ADCA酰化酶催化脱去己二酰基得到7-ADCA。目前已经开发了多种酰化酶可以用来催化水解上述底物得到7-ACA和7-ADCA母核，但相较于化学催化剂，生物酶还存在稳定性较低、价格相对较贵、有的酰化酶酶活性还很低的缺点。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:提供一种能提高酶的催化活性并保持其稳定性，实现多批次重复使用的聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶。
[0006]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:一种聚乙烯醇固定化酰化酶的方法，其步骤为:将聚乙烯醇、交联剂配置成混合水溶液，把酰化酶加入到上述聚乙烯醇与交联剂的混合水溶液中搅拌均匀，得酰化酶聚乙烯醇凝胶水溶液(质量百分含量通常为0.1%-1%)，经成形固化工艺处理得到聚乙烯醇固定化酰化酶。
[0007]所述的聚乙烯醇，其聚合度为1000~4000，优选聚合度为2000，所述的聚乙烯醇在混合溶液中浓度为2Wt.%~Wt.20%,优选5Wt.%~15Wt.%。
[0008]所述的聚乙烯醇与交联剂质量比为2:1~1:1,优选1.5:1 ；
[0009]所述的交联剂选自下述物质中的一种:羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素(CMC)、微晶纤维素(MCC);其中，所述的HPMC粘度为2-50cps，优选
5-20 ;所述的PEG数均分子量在500~8000，优选分子量为4000。
[0010]所述的酰化酶为头孢菌素C酰化酶、去乙酰氧基头孢菌素C酰化酶、己二酰基-7-ACA酰化酶、己二酰基-7-ADCA酰化酶、戊二酰基-7-ACA酰化酶、戊二酰基-7-ADCA酰化酶、苯乙酰基-7-ACA酰化酶或苯乙酰基-7-ADCA酰化酶。
[0011]其中的头孢菌素酰化酶来源于大肠杆菌(Escherichi coli)、假单胞杆菌(pseudomonas sp.)、牙胞杆菌(Bacillus sp.)、无色杆菌(Achromobacter sp.)、三角酵母菌(Trigonopsis sp.)。
[0012]所述的成形固化工艺可以采用下述两种工艺中的任意一种:
[0013]I)直接把酰化酶的胶体水溶液滴入硬质玻璃或聚四氟乙烯器皿中，形成透镜状液滴，然后在真空干燥箱内以15-50°C的温度加热干燥脱水，并交联成形，可进一步切割成2-6mm2的不同形状凝胶颗粒，将凝胶颗粒转移到磷酸缓冲溶液中浸溃硬化I~2小时，用该缓冲溶液冲洗后得到聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶；
[0014]2)把酰化酶的胶体水溶液滴加至转速为100~300r/m搅拌的IWt.%至饱和的固化剂水溶液中进行固化，然后过滤得到球状固定化酶颗粒，用磷酸缓冲溶液浸溃I~2小时，用该缓冲溶液冲洗后得到聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶。
[0015]所述的磷酸缓冲溶液的浓度为5%~15%，pH值为不同酰化酶对应的最适pH值，一般 ρΗ=5.0 ~9.0。
[0016]所述的固化剂为硼酸、环氧氯丙烷、戊二醛、二甲基脲、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐或硫酸盐。
[0017]所述的硼酸以其 饱和水溶液为佳；所述的环氧氯丙烷、戊二醛、二甲基脲的水溶液以I~10%质量浓度为佳；所述的磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐或硫酸盐，可用其钠、钾和铵盐的水溶液，以5~15%质量浓度为佳，固化时间15min~60min，以30min为佳。
[0018]本发明所要解决的第二个技术问题是:提供一种聚乙烯醇固定化酰化酶在合成头孢类抗生素中间体7-ACA或7-ADCA中的应用
[0019]为解决第二个技术问题，本发明采用的技术方案为:聚乙烯醇固定化酰化酶在合成头孢类抗生素中间体7-ACA或7-ADCA中的应用，其步骤为:把质量浓度为2%_10%的7-ACA或7-ADCA相对应反应底物的水溶液加入或流过对应的聚乙烯醇固定化酰化酶，在釜式反应器中振荡或搅拌反应,或在填充床反应器中循环流动反应；反应完毕，过滤回收聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶，并从滤液中提取产物。
[0020]所述的反应底物为头孢菌素C、去乙酰氧基头孢菌素C、己二酰-7-ACA、己二酰-7-ADCA、戊二酰-7-ACA、戊二酰-7-ADCA、苯乙基-7-ACA 或苯乙酰-7-ADCA。
[0021]不同反应底物对应不同固定化酶，所述的头孢菌素C、去乙酰氧基头孢菌素C、己二酸-7-ACA、己二酸-7-ADCA、戍二酸-7-ACA、戍二酸-7-ADCA、苯乙基-7-ACA、苯乙酰-7-ADCA分别对应头孢菌素C酰化酶、去乙酰氧基头孢菌素C酰化酶、己二酰基-7-ACA酰化酶、己二酰基-7-ADCA酰化酶、戊二酰基-7-ACA酰化酶、戊二酰基-7-ADCA酰化酶、苯乙酰基-7-ACA酰化酶和苯乙酰基-7-ADCA酰化酶；
[0022]所述的反应底物浓度为5~200g/L，反应过程中溶液pH=5.0~9.0，反应温度为15~40°C，反应时间为I~48小时。
[0023]本发明有益效果:聚乙醇(PVA)是由乙烯醇衍生单体聚合而成的水溶性高分子化合物，使用广泛，价格低廉，对人体和环境无毒害，具有良好的生物相容性，容易成形且机械强度较高。使用PVA来固载生物酶可以使酶活回收达到80%以上，并且固定化酰化酶更加稳定，重复使用达50批次以上，大大降低了酰化酶在7-ADCA和7-ACA生产中的应用成本，
提高了生产效率和产品质量。
[0024]升级为固定化酶反应器后又可进一步实现7-ADCA和7-ACA连续化、自动化和环境友好型绿色生产。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]固定化头孢菌素C酰化酶:配制含IOg PVA(聚乙烯醇，聚合度2000)、6gPEG(聚乙二醇，分子量4000)、80g去离子水的水溶液，加入IOmL头孢菌素C酰化酶(含量25mg/mL的粗酶液)，得到酰化酶浓度达到2.5g/L，在室温下搅拌均匀，然后把如此制备的孢菌素C酰化酶-PVA混合水溶液滴到硬质平板上，室温空气流吹干，并在35 °C下减压脱水成形。随后收集片状凝胶化产物，转移到8%的(w/w)磷酸二氢钠水溶液中浸溃硬化I小时，过滤备用。
[0027]实施例2
[0028]固定化头孢菌素C酰化酶:配制含5g PVA(聚乙烯醇，聚合度2000)、5gHPMC(羟丙基甲基纤维素，粘度为5)、100g去离子水的水溶液，加入IOmL头孢菌素C酰化酶(含量25mg/mL的粗酶液)，酰化酶浓度达到2.4g/L，在室温下搅拌I小时，然后把制备的头孢菌素C酰化酶-PVA混合水溶液滴加到不断搅拌的2%的戊二醛水溶液中，滴加完毕，过滤并用水冲洗至无残留戊二醛，随后转移到10%的(w/w)磷酸二氢钾水溶液中浸溃硬化I小时，过滤备用。
[0029]实施例3
[0030]固定化头孢菌素C酰化酶:配制含15g PVA (聚乙烯醇，聚合度2000)、100g去离子水的PVA水溶液，加入IOmL头孢菌素C酰化酶(含量25mg/mL的粗酶液)，得到酰化酶浓度为5g/L，在室温下搅拌均匀，然后把制备的头孢菌素C酰化酶-PVA混合水溶液滴加到不断搅拌的含有5%(w/w)硼酸和10%(w/w)的磷酸二氢钾100g水溶液中，浸溃硬化I小时，过滤，水洗备用。
[0031]实施例4
[0032]固定化己二酰基-7-ADCA酰化酶:配制含15g PVA(聚乙烯醇，聚合度3000)、100g去离子水的PVA水溶液，加入15mL 二酰基-7-ADCA酰化酶(含量20mg/mL的粗酶液)，得到酰化酶浓度为2.8g/L，在室温下搅拌均匀，然后把制备的二酰基-7-ADCA酰化酶-PVA混合水溶液滴加到不断搅拌的3%(w/w) 二甲基脲水溶液中，均匀碎片化后，加入到10%pH=7.5的磷酸缓冲溶液中浸溃硬化2小时，过滤，水洗备用。
[0033]实施例5
[0034]固定化戊二酰基-7-ACA酰化酶:配制含5g PVA(聚乙烯醇，聚合度2000)、5gHPMC(羟丙基甲基纤维素，粘度为50)、150g去离子水的PVA水溶液，加入IOmL戊二酰基-7-ACA酰化酶(含量25mg/mL的粗酶液)，得到酰化酶浓度为2.4g/L，在室温下搅拌I小时，然后升温至40oC，真空干燥成形，切割成2-3mm2碎片，随后转移到10%的(w/w)磷酸二氢钾水溶液中浸溃硬化2小时，过滤，水洗备用。
[0035]实施例6
[0036]固定化苯乙酰-7-ADCA酰化酶:配制含IOg PVA(聚乙烯醇，聚合度2000)、6gPEG (聚乙二醇，分子量3000)、80g去离子水的PVA水溶液，加入IOmL苯乙酰-7-ADCA酰化酶(含量25mg/mL的粗酶液)，得到酰化酶浓度为2.5g/L，在室温下搅拌均匀，然后把如此制备的苯乙酰-7-ADCA酰化酶-PVA混合水溶液滴到硬质平板上，在梯度为60-25°C空气流中交联成形，随后收集片状凝胶化产物，转移到10%的(w/w)磷酸二氢钾水溶液(pH=7.0)中浸溃硬化1.5小时，过滤，保存在添加了 5%的乙醇的磷酸盐缓冲溶液中(pH=7.0)，4°C条件下备用。
[0037]实施例7
[0038]利用实施例1制备的固定化头孢菌素C酰化酶催化水解去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)生成7-ADCA:取IOOmL DAOC发酵液(21000u/mL)，树脂脱色、层析分离和纳滤浓缩，得到50mL DAOC水溶液，调节pH=7.5，加入5g实施例1制备的固定化头孢菌素C酰化酶，反应温度保持在30°C，用酸或碱保持体系pH=7.5，震荡反应8小时至体系pH值不再变化，HPLC分析7-ADCA占92%，结束反应，过滤得到7-ADCA溶液，回收固定化头孢菌素C酰化酶。将滤液用冰浴降温至5°C，低速搅拌，产生晶体，过滤收集晶体，真空干燥，得到1.5g7-ADCA晶体粉末。固定化头孢菌素C酰化酶回收重复使用5批次，活力仅下降5%。
[0039]实施例8
[0040]利用实施例2制备的固定化头孢菌素C酰化酶催化水解头孢菌素C(CPC)生成7-ACA:取IOOmL CPC发酵液(41000u/mL)，树脂脱色、层析分离和纳滤浓缩，得到50mL CPC水溶液，调节pH=7.5，加入6g实施例2制备的固定化头孢菌素C酰化酶，反应温度保持在30°C，用酸或碱保持体系pH=7.5，以200~400转/分的速度，搅拌反应6小时至体系pH值不再变化，HPLC分析7-ACA占98%，结束反应，过滤得到7-ACA溶液，回收固定化头孢菌素C酰化酶。将滤液用冰浴降温至5°C，低速搅拌，产生晶体，过滤收集晶体，真空干燥，得到2.8g7-ACA晶体粉末。固定化头孢菌素C酰化酶回收重复使用5批次，活力仅下降小于10%。
[0041]实施例9
[0042]利用实施例3制备的固定化头孢菌素C酰化酶催化水解去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)生成7-ADCA:取IOOmL DAOC发酵液(21000u/mL)，树脂脱色、层析分离和纳滤浓缩，调节pH=7.5，得到50mL DAOC水溶液，用柱塞泵把DAOC溶液循环注入填充有实施例3所制备的固定化头孢菌素C酰化酶的循环流式填充床反应器，流速5mL/min，循环反应8小时至体系PH值不再变化，HPLC分析7-ADCA占98%，结束反应，过滤得到7-ADCA溶液，回收固定化头孢菌素C酰化酶。将滤液用冰浴降温至5°C，低速搅拌，产生晶体，过滤收集晶体，真空干燥，得到1.8g7-ADCA晶体粉末。固定化头孢菌素C酰化酶循环使用5批次，活力仅下降5% ο
[0043]实施例10
[0044]利用实施例5制备的固定化戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶催化水解戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)制备7-ACA:取100mLGL-7-ACA反应液(40g/L)，调节pH=7.5，加入8g实施例4制备的固定化戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶，反应温度保持在30°C，用酸或碱保持体系pH=7.5，以100-300转/分的速度，搅拌反应6小时至体系pH值不再变化，HPLC分析7-ACA占98%，结束反应，过滤得到7-ACA溶液，回收固定化戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶。将滤液用冰浴降温至5°C，低速搅拌，产生晶体，过滤收集晶体，真空干燥，得到2.5g7-ACA晶体粉末。固定化戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶回收重复使用5批次，活力仅下降小于10%。
[0045]实施例11
[0046]利用实施例4制备的固定化己二酰基-7-ADCA酰化酶催化水解己二酰基_7_氨基去乙酰氧基头孢烷酸(adipyl-7-ADCA)生成7-ADCA:取100mLadipyl-7-ADCA发酵液(18000u/mL)，树脂脱色、层析分 离和纳滤浓缩，得到50mL adipyl-7-ADCA水溶液，调节pH=7.5，加入5g实施例4制备的己二酰基头孢菌素C酰化酶，反应温度保持在30°C，用酸或碱保持体系PH=7.5，以200-400转/分的速度，搅拌反应5小时至体系pH值不再变化，HPLC分析7-ADCA占96%，结束反应，过滤得到7-ADCA溶液，回收固定化己二酰基-7-ADCA酰化酶。将滤液用冰浴降温至5°C，低速搅拌，产生晶体，过滤收集晶体，真空干燥，得到1.5g7-ADCA晶体粉末。固定化己二酰基-7-ADCA酰化酶回收重复使用5批次，活力仅下降10%。
[0047]实施例12
[0048]利用实施例6制备的固定化苯乙酰-7-ADCA酰化酶(青霉素G酰化酶)催化水解苯乙酰-7-ADCA制备7-ADCA:取IOOmL苯乙酰-7-ADCA水溶液(80g/L)，加入IOg实施例6制备的固定化苯乙酰-7-ADCA酰化酶，反应温度保持在30°C，用酸或碱保持体系pH=7.5，以200-400转/分的速度，搅拌反应6小时至体系pH值不再变化，HPLC分析7-ADCA占98%，结束反应，过滤得到7-ADCA溶液，回收固定化苯乙酰-7-ADCA酰化酶。将滤液用冰浴降温至5oC，低速搅拌，产生晶体，过滤收集晶体，真空干燥，得到4.8g7-ADCA晶体粉末。固定化苯乙酰-7-ADCA酰化酶回收重复使用5批次，活力仅下降5%。
【权利要求】
1. 一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法，其步骤为:将聚乙烯醇、交联剂配置成混合水溶液，把酰化酶加入到上述聚乙烯醇与交联剂的混合水溶液中搅拌均匀，得酰化酶聚乙烯醇凝胶水溶液，经成形固化工艺处理得到聚乙烯醇固定化酰化酶。
2.根据权利要求1所述的一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法，其特征在于:所述的聚乙烯醇，其聚合度为1000-4000，所述的聚乙烯醇在聚乙烯醇与交联剂的混合水溶液中质量百分含量为2%-20%。
3.根据权利要求1所述的一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法，其特征在于:所述的交联剂为:羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、羧甲基纤维素或微晶纤维素；所述的聚乙烯醇与交联剂质量比为2:1~1:1 ;所述的聚乙二醇数均分子量为500~8000 ;所述的羟丙基甲基纤维素的粘度为2-50cps。
4.根据权利要求1所述的一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法，其特征在于:所述的酰化酶为头孢菌素C酰化酶、去乙酰氧基头孢菌素C酰化酶、己二酰基-7-ACA酰化酶、己二酰基-7-ADCA酰化酶、戊二酰基-7-ACA酰化酶、戊二酰基-7-ADCA酰化酶、苯乙酰基-7-ACA酰化酶或苯乙酰基-7-ADCA酰化酶。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法，其特征在于:所述的成形固化工艺可以采用下述工艺中的任意一种: 第一种工艺:直接把酰化酶的凝胶水溶液滴入硬质玻璃或聚四氟乙烯器皿中，形成透镜状液滴，然后在真空干燥箱内以15~50°C的温度加热干燥脱水，并交联成形，进一步切割成2~6mm2的凝胶颗粒状的聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶； 第二种工艺:把酰化酶的胶体水溶液滴加至以转速为100~300r/m搅拌的IWt.%至饱和的固化剂水溶液中进行固化，然后过滤得到球状固定化酶颗粒，用磷酸缓冲溶液浸溃I~2小时，并用该缓冲溶液冲洗后得到聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶。
6.根据权利要求5所述的一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法，其特征在于:所述的磷酸缓冲溶液的质量百分含量为5%~15%，pH=5.0~9.0。
7.根据权利要求5所述的一种聚乙烯醇固定化酰化酶的制备方法，其特征在于:所述的固化剂为硼酸、环氧氯丙烷、戊二醛、二甲基脲、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐或硫酸盐。
8.权利要求1所述的聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶在合成头孢类抗生素中间体7-ACA或7-ADCA中的应用，其步骤为:把浓度为2Wt.%-10fft.%的7-ACA或7-ADCA相对应反应底物的水溶液加入或流过对应的聚乙烯醇固定化酰化酶，在釜式反应器中振荡或搅拌使其反应，或在填充床反应器中循环流动反应；反应完毕，过滤回收聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶，并从滤液中提取产物。
9.根据权利要求8所述的聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶在合成头孢类抗生素中间体7-ACA或7-ADCA中的应用，其特征在于:所述的反应底物为头孢菌素C、去乙酰氧基头孢菌素C、己二酸-7-ACA、己二酸-7-ADCA、戍二酸-7-ACA、戍二酸-7-ADCA、苯乙基-7-ACA或苯乙酰-7-ADCA ;所述的底物浓度为5~200g/L。
10.根据权利要求9所述的聚乙烯醇凝胶固定化酰化酶在合成头孢类抗生素中间体7-ACA或7-ADCA中的应用，其特征在于:所述的不同反应底物对应不同固定化酶，反应底物头孢菌素C、去乙酰氧基头孢菌素C、己二酰-7-ACA、己二酰-7-ADCA、戊二酰-7-ACA、戊二酰-7-ADCA、苯乙基-7-ACA、苯乙酰-7-ADCA分别对应头孢菌素C酰化酶、去乙酰氧基头孢菌素C酰化酶、己二酰基-7-ACA酰化酶、己二酰基-7-ADCA酰化酶、戊二酰基-7-ACA酰化酶、戊二酰基-7-ADCA酰化 酶、苯乙酰基-7-ACA酰化酶和苯乙酰基-7-ADCA酰化酶。
【文档编号】C12N11/08GK103525800SQ201310496942
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】胡惜朝, 葛忠平, 王小兵 申请人:江苏辉腾生物医药科技有限公司