用于检测h4亚型禽流感病毒的rt-lamp引物组应用及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及禽流感病毒的检测，尤其涉及用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组、该引物组的应用以及检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒。一种用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，所述的RT-LAMP引物组其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。本方案的有益效果是，本发明所提供的用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，具有简单、快速、敏感性和特异性强的特点。
【专利说明】用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组应用及试剂
合
Si
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及禽流感病毒的检测，尤其涉及用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组、该引物组的应用以及检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒。
【背景技术】
[0002]流感病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科流感病毒属,根据NP蛋白和M蛋白的不同可将其分为甲、乙和丙三型。流感病毒基因组是由8条负链RNA节段组成，编码11或12个蛋白，其中两个糖蛋白血凝素蛋白HA和神经氨酸酶蛋白NA较为重要，二者位于病毒粒子表面。病毒RNA与核糖核蛋白及三个RNA依赖的RNA聚合酶亚基PB2、PB1和PA相连。已知甲型流感病毒已在多种动物体内分离到，包括人、猪、马、鲸、海豹和鸟类等。根据其血清学检测，现已经鉴定出17个HA亚型(H1-17)和9个NA亚型(N1-9)。
[0003]根据毒力大小的不同，流感病毒可分为低致病性禽流感(LPAI)和高致病性禽流感(HPAI)，已知的17个HA和9个NA亚型均能在水禽中分离到，其中仅H5和H7亚型的部分毒株属于HPAI，其余均属于LPAI。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感。禽流感病毒中，H5、`H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。2005年，中国西部青海湖地区发生了水禽感染HPAI的H5N1，导致野鸟大面积死亡，所以要注意到迁徙鸟中的HPAI H5N1流感病毒的潜在危险。随后，在东南亚不同地区都出现了基因型和抗原性不同的新型HPAI H5N1，并在家禽中广泛流行。同时亦不能忽视家禽转运和鸟类迁徙过程在HPAI H5N1的远距离传播中的作用，这也解释了欧洲、中东和非洲地区等地区频繁暴发禽流感的可能原因。
[0004]流感病毒的HA蛋白对受体的特异性和亲和力是决定宿主嗜性和传播能力的关键因素之一。1918年HlNl流感病毒会受HA蛋白上190和225位氨基酸的影响；D225G突变体下降了 α2，6唾液酸结合的亲和力，导致与人气管中杯状细胞的结合力下降，从而使病毒在雪貂中的传播能力下降。同时Η5Ν1病毒在识别不同的受体结合特性是由不同的氨基酸残基引起的。同样，在受体结合位点附近的残基差异使其它禽或流行的流感病毒的受体结合特性变得更加复杂，表明在不同的HA亚型中受体的特异性是不同的。
[0005]我国一直被认为是禽流感的高发和易发地，经常是多种亚型AIV并存的情形。LPAIV不像HPAIV可引起野鸟和家禽的大面积死亡，但仍然存在较多的潜在危险，如重组变异形成新的病毒等。因此LPAIV仍然需要相当的重视。
[0006]Η4亚型AIV属于LPAIV，国内分离到的毒株较少，因此对之研究较少。国际上目前有韩国、俄罗斯等国家均报道分离到该亚型。哺乳动物分离到的该病毒是1999年在加拿大猪体内分离到一株Η4Ν6病毒，序列分析表明，其各病毒节段均为禽源，但HA基因的226L的特征使该病毒具有了感染猪的能力，由此暗示Η4亚型病毒可能在哺乳动物体内逐渐适应。[0007]目前，H4流感病毒检测主要依赖病毒分离和分子生物学检测，但是不能进行敏感特异快速的检测方法。所以目前为止还没有确定一种最具有临床使用价值的基层分子生物学诊断方法。
【发明内容】
[0008]为了解决上述的技术问题，本发明提供了用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，还提供了上述的用于检测H4亚型禽流感病毒RT-LAMP的试剂盒。
[0009]用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，该RT-LAMP引物组其核苷酸序列分别如 SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4 所示。
[0010]上述的RT- LAMP引物组在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途、在制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用也是本发明所要保护的范围。
[0011]用于检测H4亚型禽流感病毒RT-LAMP的试剂盒，包括反应混合液、酶混液和蒸馏水，该试剂盒还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。
[0012]H4亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的应用、制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用也是本发明所要保护的范围。
[0013]反转录-环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)技术是一种等温核酸扩增新技术,其特点是针对祀基因的6个区域设计3对特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63 °C左右)保温30~60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，由于不依赖任何专门的 仪器设备可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，目前这一技术已经被用于多种病原微生物的检测。
[0014]LAMP技术具有一下特征:
1.引物设计
针对靶基因6个特异序列(3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的B1、B2和B3区)设计4条引物:上游内部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游内部引物(BIP)、下游外部引物(B3)。后来添加了 2条环状引物，上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)。国外已建立了LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/),只要导入祀基因就能自动生成成组引物。挑选最优组合即可。
[0015]2.扩增原理
60-65°C是双链DNA复性及延伸的中间温度，是一种动态活性温度，因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。
[0016]扩增分两个阶段。第I阶段为起始阶段，上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换DNA聚合酶作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链，FIP上的Flc与此单链上的Fl为互补结构，自我碱基配对形成环状结构，以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链，迅速以3’末端的Fl区段为起点.以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构，该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段.以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，迅速以3’末端的BI区段为起点，以自身为模板.进行DNA合成延伸及链置换.形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
[0017]3.产物检测
(I)电泳检测=LAMP的产物可以用琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，由于产物是混合物，故呈现出特异的梯状条带，经限制性内切酶酶切之后呈现单一靶序列条带III。
[0018](2)荧光检测:SYBR Green I荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，肉眼观察荧光染料由橘黄色变为绿色，紫外线下可以发出荧光。在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量，荧光强度检测可以用实时定量PCR仪进行。
[0019](3)浊度检测:是其特有也是最常用最便捷的检测方法。在核酸大量合成时.从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀，其具有极高的特异性。只要用肉眼观察或浊度仪在400 nm光下检测浊度就能够判断扩增与否，并对起始模板定量，达到实时定量的检测。
[0020]LAMP 引物
【权利要求】
1.一种用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，所述的RT-LAMP引物组其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所/Jn ο
2.如权利要求1所述的RT-LAMP引物组在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。
3.如权利要求1所述的RT-LAMP引物组在制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用。
4.一种用于检测H4亚型禽流感病毒RT-LAMP的试剂盒，包括反应混合液、酶混液和蒸馏水，其特征在于，所述的试剂盒还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。
5.权利要求4所述的H4亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的应用。
6.权利要求4所述的H4亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒在制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103614490SQ201310499617
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】王友令, 杨金兴, 袁小远, 徐怀英, 张玉霞, 刘军河, 韩晓珺, 董伟峰 申请人:山东省农业科学院家禽研究所