一种表达脂肪酶的黑曲霉菌株的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种黑曲霉突变菌株黑曲霉WLlip1（Aspergillus?Niger?WLlip1），已于2013年10月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC?NO:M2013478。本发明提供的黑曲霉突变菌株能高效重组表达脂肪酶，其蛋白表达量比突变前菌株提高了约40%，其发酵液的脂肪酶酶活高达5482U/mL，比突变前提高了78%，且突变后重组表达的脂肪酶的酶学性质并未因突变发生变化，最适作用pH均为9.5，最适作用温度均为35℃。WLlip1突变株重组表达的脂肪酶对皮质类污垢具有很强的去污效果，因此可广泛应用于洗涤剂领域。
【专利说明】一种表达脂肪酶的黑曲霉菌株
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种高效重组表达脂肪酶的黑曲霉突变菌株。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是指水解羧酸甘油三酯中酯键的酶。脂肪酶能催化甘油三酯来生成甘油二脂、单甘脂、脂肪酸和甘油。脂肪酶具有催化疏水性的油脂变成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在无机溶剂中能保持高催化活力和极强稳定性。另外，脂肪酶对底物的广谱性/特殊专一性，赋予了脂肪酶在食品油脂加工工业、洗涤剂工业、酯键化合物的合成和手性药物合成等工业的巨大应用价值。脂肪酶已经成为蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工业用酶。
[0003]脂肪酶是生物体内一类重要的代谢酶，从催化特性看，它具有高度的化学选择性和立体异构性，且反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的另外一个特征是可以在异相系统(如油、水界面)或有机相中起作用，在水相中，脂肪酶通常催化水解反应的进行；而在有机相中，它却能催化多种合成反应:如酯化、酯交换、酯的醇解、酯的酸解等。月旨肪酶的这些特性使其成为在手性化合物合成中重要的生物催化剂，多被用来催化一些酯类合成和转化反应，在食品增香、脱脂加工、污水处理及化工产品中有着广泛的应用。然而，目前脂肪酶的生产效率仍然较低且生产成本也较高，因此需要对现有的脂肪酶的种类及生产技术进行改进。
[0004]脂肪酶广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，因此微生物来源的脂肪酶比动植物来源的脂肪酶具有更广的作用pH、作用温度范围；以及高稳定性、高活性和底物专一性。而且微生物脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品。已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌。但是，用来表达脂肪酶的重组菌株一直存在表达效率低下的问题。
【发明内容】
[0005]本发明为解决现有技术问题，提供了一种黑曲霉突变菌株，所述黑曲霉突变菌株是由构建得到的黑曲霉工程菌经紫外诱变获得的，其能大幅度提高脂肪酶的表达量，且不影响重组脂肪酶的酶学性质和应用效果。
[0006]本发明首先提供一种黑曲霉重组菌株，所述的重组菌株用于表达序列为SEQ IDNO:2的脂肪酶；
[0007]所述的黑曲霉重组菌株中转入了携带有序列为SEQ ID NO:1的表达质粒；
[0008]本发明一方面提供了一种黑曲霉突变菌株黑曲霉WLlipl (Aspergillus NigerWLlipl)，已于2013年10月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC N0:M2013478o[0009]本发明的黑曲霉突变株用于生产脂肪酶。
[0010]本发明提供的黑曲霉突变菌株能高效重组表达脂肪酶，其蛋白表达量比突变前菌株提高了约40%，其发酵液的脂肪酶酶活高达5482U/mL，比突变前提高了 78%，且突变后重组表达的脂肪酶的酶学性质并未因突变发生变化，最适作用PH均为9.5，最适作用温度均为35°C。WLlipl突变株重组表达的脂肪酶对皮质类污垢具有很强的去污效果，因此可广泛应用于洗涤剂领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:黑曲霉XUJ-2菌株发酵液SDS-PAGE电泳图；
[0012]其中，箭头所指32kD附近可以看到清晰的蛋白条带，即为重组脂肪酶。
[0013]图2:黑曲霉突变株WLlipl发酵液SDS-PAGE电泳图；
[0014]其中，泳道I为对照组XUJ-2菌株的脂肪酶表达情况，泳道2为突变株WLlipl的脂肪酶表达情况；箭头所指32kD附近可以看到清晰的蛋白条带，即为重组脂肪酶。
[0015]图3:显微镜下观察黑曲霉菌株形态变化；
[0016]其中，A为对照XUJ-2菌丝形态，B为突变株WLlipl菌丝形态。
[0017]图4:本发明突变前后黑曲霉菌株发酵液中脂肪酶相对酶活-pH变化曲线。
[0018]图5:本发明突变前后黑曲霉菌株发酵液中脂肪酶相对酶活-温度变化曲线。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实例对本发 明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。
[0020]实施例1:重组质粒的构建
[0021]根据NCBI公布的脂肪酶基因序列SEQ ID NO:1 (GeneBank AF054513)，在其起始密码子ATG前增加9个碱基CTTAAGAGG(下划线所示为AflII酶切位点)，在其终止密码子TGA后增加AGGTCTAGA(下划线所示为XbaI酶切位点)，然后将此序列交由上海生工根据黑曲霉密码子偏好性进行密码子优化,并由上海生工合成。
[0022]用限制性内切酶AfIII和XbaI (Fermentas)对脂肪酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶AflII和XbaI对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5 α大肠杆菌(Transgen),用氨节青霉素进行选择。为确保准确,对若干克隆进行测序(Invitrogen)。
[0023]使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得I个重组质粒，测序结果显示获得的DNA序列为SEQ ID NO: 1，其编码的蛋白序列为SEQ ID Ν0:2。从而说明重组质粒构建成功，命名为pGm-Lip。
[0024]实施例2:黑曲霉工程菌株的构建
[0025]吸取黑曲霉Gl孢子悬浮液于CMA平板，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200mL CMA液体培养基中，在30°C、200rpm下培养14~16h。
[0026]用无菌Miracloth滤布收集菌丝体,并用溶液A清洗一次,在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体转化溶液中，在30°C、200rpm的条件下温浴I~2h,用显微镜观察原生质体。
[0027]用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL,在4000rpm条件下离心8min以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于IOmL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在I X IO7 个/mL。
[0028]在冰上，将100 μ L上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化反应用I管，再加入10 μ g重组质粒pGm-Lip, 12.5 μ L溶液C,温和混匀后再冰上放置20min。
[0029]将丽SA顶层琼脂试管熔化并保持在55°C。从冰中移出上述15mL离心管，并向管中加入ImL溶液C和2mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入ImL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上，并将平板在30°C下培养7~10d。
[0030]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLIM KH2PO4,48.156g MgSO4，加入 dlH20 至终体积500mL,用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0031]溶液B:5mLlM Tris (pH7.5),2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至终体积500mL,用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0032]溶液C:250g PEG4000,2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至终体积500mL,用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
`[0033]CMA培养基:20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，Ig蛋白胨，15g琼脂，加入dlH20至终体积1000mL,高压蒸气灭菌。
[0034]实施例3:黑曲霉工程菌株验证
[0035]将培养IOd后的转化子接种于30mL TSB发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下培养5d ; 14000 X g，离心lOmin，收集上清液；SDS_PAGE电泳验证脂肪酶基因是否表达。结果如图1所示，在32kD附近可以看到清晰蛋白条带，说明黑曲霉工程菌株构建成功，命名为黑曲霉 XUJ-2 (Aspergillus niger XUJ-2)。
[0036]实施例4:黑曲霉工程菌株XUJ-2诱变筛选
[0037]将黑曲霉工程菌株XUJ-2接种于CMA斜面，30°C培养3_4d，使用0.l%Tween-80洗孢子悬浮液，稀释至6 X IO6个/mL，紫外灯(40W)照射2_10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板。30°C培养40h。
[0038]实施例5:黑曲霉突变株验证及酶活测定
[0039]挑选小菌落按照实施例2所述方法进行发酵，以XUJ-2菌株为对照。SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况。结果如图2所示，与突变前的XUJ-2菌株相比，突变后的菌株中重组脂肪酶的表达量明显增加，将该突变菌株命名为黑曲霉WLlipKAspergillus niger
WLlipDo
[0040]采用考马斯亮蓝方法检测上述菌株中的蛋白含量，对照组XUJ-2菌株中蛋白含量为1.19g/L，而突变株WLlipl菌株中蛋白含量为1.79g/L，比突变前蛋白表达量提高约40%。
[0041]根据《GB/T23535脂肪酶制剂》所述方法检测黑曲霉发酵液酶活。结果显示，对照组XUJ-2菌株发酵液酶活为3083U/mL，而突变株WLlipl的发酵液酶活高达5482U/mL，比突变前提高了约78%。结果表明同样的发酵条件下，突变株WLlipl中目的脂肪酶的表达量明显提闻。
[0042]将上述突变菌株黑曲霉WLlipl (Aspergillus Niger WLlipl)于 2013 年 10月18日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，菌株编号为CCTCCN0:M2013478。
[0043]实施例6:黑曲霉突变株重组表达脂肪酶的酶学性质与菌丝形态分析
[0044]1、最适作用pH值
[0045]分别配制pH值为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲
液。将黑曲霉XUJ-2和WLlipl的发酵液分别用上述缓冲液稀释至合适的浓度，然后按照GB/T23535所述方法测定发酵液中重组脂肪酶的酶活力。以发酵液原始酶活为100%，计算不同pH条件下重组脂肪酶的相对酶活。结果如图4所示，黑曲霉XUJ-2和WLlipl发酵液中重组脂肪酶相对酶活-pH变化曲线相同，最适作用pH均为9.5。
[0046]2、最适作用温度
[0047]将黑曲霉XUJ-2和WLlipl的发酵液用上述pH9.5的缓冲液稀释至合适的浓度，按照制造商的说明书，分别在25°C、30 V、35°C、40 V、45°C、50 V、55°C、60 V条件下，按照GB/T23535所述方法测定发酵液中脂肪酶的酶活力。以发酵液原始酶活为100%，计算不同温度条件下重组脂肪酶的相对酶活。结果如图5所示，黑曲霉XUJ-2和WLlipl发酵液中重组脂肪酶相对酶活-温度变化曲线相同，其最适作用温度均为35°C。
[0048]综上所述，突变后的黑曲霉重组表达的脂肪酶的酶学性质与突变前相同，最适作用pH均为9.5，最适作用温度均为35°C。
[0049]3、黑曲霉菌丝形态变化
[0050]通过显微镜观察黑曲霉XUJ-2和WLlipl的菌丝形态发现，与对照菌XUJ-2相比，突变株WLlipl的菌丝分支较多，并且明显变短，突变株的这种菌丝形态更有利于后期进行高密度发酵培养。
[0051]实施例7:重组脂肪酶在洗涤剂中的应用测试
[0052]对比测试加与不加XUJ-2、WLlipl菌株重组表达脂肪酶的洗衣液对国标皮脂污布(JB-03)的去污效果。
[0053]1、实验方法:参照GB/T13174-2008《衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定》中的方法进行。
[0054]2、脂肪酶测试样品:
[0055]I)脂肪酶XUJ-2，为本发明构建的黑曲霉工程菌XUJ-2重组表达的脂肪酶，酶活10000U/mL ；
[0056]2)脂肪酶WLlipl，为黑曲霉突变株WLlipl重组表达的脂肪酶，酶活10000U/mL。
[0057]3、实验条件:
[0058]洗涤设备:RHQL-1II型立式去污机(中国日用化学工业研究院)
[0059]转速:120转/分[0060]洗涤试验温度:分别为30oC (国标洗涤温度)
[0061]洗涤实验水硬度:250ppm(Ca27Mg2+=3/2)
[0062]浸泡/洗涤时间:放污布前预先溶解20分钟/洗涤时间20分钟
[0063]白度计型号:WSD_3C (北京康光仪器有限公司)
[0064]R457蓝光白度:Wr (不含荧光白度)
[0065]污布种类JB-03 (国家标准GB/T13174-2008附录D)
[0066]4、实验结果:
【权利要求】
1.一种黑曲霉重组菌株，所述的重组菌株用于表达序列为SEQ ID N0:2的脂肪酶。
2.如权利要求1所述的黑曲霉重组菌株，其特征在于，所述的黑曲霉重组菌株中转入了携带有序列为SEQ ID NO:1的表达质粒。
3.一种黑曲霉突变菌株，所述的突变菌株是由权利要求1所述的重组菌株突变获得的。
4.如权利要求3所述的黑曲霉突变菌株，其保藏编号为CCTCCN0:M2013478。
5.权利要求4所述的黑曲霉突变菌株在生产序列为SEQID N0:2的脂肪酶中的应用。
【文档编号】C12N1/15GK103555596SQ201310512640
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】王华明, 徐娟, 闫真, 黄亦钧 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司