一种启动子OsP005、制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种启动子OsP005、制备方法及应用。所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、Seq?ID?No.1所示的核苷酸序列；b、与Seq?ID?No.1互补的核苷酸序列；c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。本发明启动子能够在单子叶中调控基因表达，从而为研究植物中目的基因的表达提供了一种新的工具和选择。
【专利说明】—种启动子0sP005、制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，特别涉及一种启动子0sP005，含有该启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、植物愈伤组织，该启动子的制备方法以及利用该启动子来调控植物中基因表达的方法。
【背景技术】
[0002]启动子是基因的一个组成部分，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合,活化RNA聚合酶,启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。
[0003]根据启动子的转录模式可将其分为3类:组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。双子叶植物中的一些强效启动子如CsVMV(Cassava VeinMosaic Virus)启动子、番爺E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vstl启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果(Plantbiotechnology,2002，19(I):19-26)。
[0004]单子叶植物基因中常见的启动子有:Ubi启动子(Plant ubiquitinpromoter)、Actin 启动子(Plant Actin promoter)和 Adh-1 启动子(Maize alcoholdehydrogenaselpromoter)。
[0005]Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的Ubil-1启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbBl启动子、烟草泛素Ubil.U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubil-1启动子，大麦泛素Mubl启动子。玉米泛素Ubil-1启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。
[0006]Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现,属于强组成型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。
[0007]Adh-1启动子调控ADH(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-1启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比CaMV (花椰菜花叶病毒CaMV) 35S启动子提高10-50倍。Adh-1启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调控效果都很有限。
[0008]本发明人通过对水稻基因组的深入研究，提供一种新的单子叶植物启动子，该启动子能够用于调控单子叶植物中目的基因的表达，同时为研究单子叶植物中目的基因表达提供一种新的工具和选择。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种新的启动子，能够在植物中调控基因的表达。
[0010]本发明的另一目的在于提供含有上述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、植物愈伤组织、植物外植体及植物。
[0011]本发明的再一目的在于提供一种制备上述启动子的引物、制备方法，以及利用该启动子来调控植物中基因表达的方法。
[0012]本发明的再一目的在于提供一种制备转基因植物的方法，以及上述启动子在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。
[0013]为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0014]本发明公开了一种启 动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列:
[0015]a、Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0016]b、与Seq ID N0.1互补的核苷酸序列；
[0017]C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
[0018]d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；
[0019]e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90 %同一性的核苷酸序列。
[0020]本发明还公开了一种核酸构建体，包含上述启动子，以及与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。
[0021]本发明还公开了一种载体，所述载体含有上述启动子或核酸构建体，优选地，该载体为上述启动子或核酸构建体与pMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体。
[0022]本发明进一步公开了一种重组细胞，所述细胞含有上述启动子、核酸构建体或载体，优选地，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。
[0023]本发明进一步公开了含有上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞的植物愈伤组织、植物外植体或植物，优选地，所述植物为单子叶植物，再优选地，所述植物为稻属，更优选地，该植物为水稻，更优选地，该植物为水稻日本晴。
[0024]本发明进一步公开了一组引物对，用于扩增得到上述启动子，所述引物对的两条引物分别含有Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列，优选地，所述两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基，更优选地，所述引物对的两条引物分别具有Seq ID No:4 和 Seq ID No:5 所不的序列。
[0025]本发明还公开了制备SEQ ID No:1所示启动子的方法，包括:以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO:1在水稻日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计，优选是上述的引物对。
[0026]本发明进一步公开了一种调控植物中基因表达的方法，包括，将上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞导入植物细胞；优选导入植物愈伤组织；进一步优选地，启动子或核酸构建体导入植物细胞是利用农杆菌转化植物愈伤组织，所述植物优选为单子叶植物，所述植物再优选为稻属，所述植物更优选为水稻，所述植物进一步优选为水稻日本晴。
[0027]本发明还公开了一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养上述的重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体或植物。
[0028]本发明还公开了上述启动子、核酸构建体、载体、重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途，优选植物是单子叶植物，再优选地植物为稻属，更优选植物为水稻，进一步优选植物为水稻日本晴。
[0029]由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于: [0030]本发明提供的新的启动子能够在植物中调控基因表达，并且，在单子叶植物如水稻幼苗的根、幼苗、水稻花药、水稻颖壳中具有启动子功能，能够调控外源基因的表达，从而为研究单子叶植物中目的基因的表达提供了一种新的工具和选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为用于构建p8质粒的pGAMBIA-1301质粒示意图。
[0032]图2为p8质粒示意图。
[0033]图3为经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P005序列的重组根癌农杆菌P8+P005转化的水稻愈伤组织(左)经⑶S染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8质粒的水稻愈伤组织(对照，右)经⑶S染色后颜色未发生变化。
[0034]图4为经转化的水稻幼苗的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P005序列的重组根癌农杆菌P8+P005转化的水稻幼苗(右)经⑶S染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8质粒的水稻幼苗(对照，左)经GUS染色后颜色未发生变化。
[0035]图5为经转化的水稻根的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P005序列的重组根癌农杆菌P8+P005转化的水稻根(右)经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8质粒的水稻根(对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。
【具体实施方式】
[0036]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]本发明公开了一种启动子，该启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列:
[0038]a、Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；[0039]b、与Seq ID N0.1互补的核苷酸序列；
[0040]C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
[0041]d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；
[0042]e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
[0043]在本发明中，所述的高等严紧条件下与Seq ID N0.1所示或与其互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与Seq ID N0.1所示核苷酸序列相同或相似的启动子活性。
[0044]在本发明中，所述对Seq ID N0.1或与其互补的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5 '端和/或3 ’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或不超过3-20个，或不超过4-15个，或不超过5-10个，或不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。
[0045]在本发明中，所述对Seq ID N0.1或与其互补的核苷酸序列进行如上述行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，具有与Seq ID N0.1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。
[0046]通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列，例如与Seq ID N0.1的参考核苷酸序列至少90%同一性是指:在Seq ID N0.1的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达10个核苷酸的不同外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。即为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少90%相同的多核苷酸，参考序列中多达10%的核苷酸可以被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列总核苷酸的10% ;或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合。
[0047]在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法，以BLAST和BLAST2.0 算法为例，它们分别描述在 Altschul 等(1977) Nucl.Acid.Res.25:3389-3402和Altschul等(1990) J.Mol.Bi0.215:403-410。采用文献中所述或默认参数，BLAST和BLAST2.0可用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
[0048]在本发明中，所述与Seq ID N0.1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列，包括与Seq ID N0.1或与其互补的核苷酸序列所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如，当采用标准参数的BLAST分析时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的那些序列。在本发明中，所述与Seq ID N0.1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列具有与Seq ID N0.1所不核苷酸序列相同或相似的启动子活性。
[0049]本发明还公开了一种核酸构建体，包括上述启动子，以及与该启动子可操作连接的基因序列。“可操作连接”是指两个或多个核苷酸区域或核苷酸序列的功能性空间排列。在本发明的核苷酸构建体中，启动子被置于基因核酸序列的某个特定位置，所述基因一般是需要提高转录水平的任何核酸序列，或者，可设计本发明所述启动子和基因以便下调特定核酸序列。即通过将启动子与反义方向基因相连来实现。在本发明一个具体的实施方式中，所属基因优选为GUS基因。[0050]本发明还涉及一种含有上述启动子或上述核酸构建体的载体。本发明的载体可以是通过将上述启动子或上述核酸构建体插入到克隆载体或表达载体而得到的重组载体。适于构建本发明所述重组载体的表达载体。在本发明【具体实施方式】中，本发明含有所述启动子的载体为上述启动子与PMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体，优选地，本发明的重组载体为PMD18-T+P005重组载体或者p8+P005重组载体。
[0051]本发明进一步涉及含有本发明所述启动子的重组细胞。本发明的重组细胞可以通过将上述含有本发明所述启动子的重组载体转化宿主细胞而得到的。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如:大肠杆菌细胞，根癌农杆菌细胞等。在本发明一个具体的实施方式中，所述重组细胞为重组根癌农杆菌。
[0052]本发明进一步公开了一种植物愈伤组织或植物外植体或植物，所述愈伤组织、植物外植体或植物含有本发明的上述启动子。本发明的植物愈伤组织是单子叶植物愈伤组织，如水稻愈伤组织。 [0053]本发明还进一步涉及用于PCR扩增得到本发明所述启动子的一组引物对，该组引物对含有序列表中Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列。为了便于操作，通常优选在引物的5’端还设计连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。在本发明【具体实施方式】中，所述引物对的两条引物分别具有Seq ID No:4和Seq ID No:5所示的序列。
[0054]采用上述引物，以水稻日本晴基因组DNA为模板进行PCR扩增，能够制备得到本发明的启动子。
[0055]本发明还进一步公开了一种调控植物中基因表达的方法，该方法包括:将上述启动子导入植物细胞。优选地是通过将同时含有外源基因以及本发明启动子的核酸构建体导入植物细胞来达到调控基因表达的目的。所述核酸构建体中，外源基因与本发明所述的启动子可操作地连接。在本发明优选地实施方式中，可利用含有目的外源基因与本发明启动子的重组载体转化农杆菌，再将得到的重组农杆菌转化植物愈伤组织，从而实现将所述外源基因与本发明启动子一起导入植物细胞的目的。在本发明一个具体的实施方式中，外源基因优选为GUS基因。本发明的植物为单子叶植物。
[0056]在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因及所述启动子插入到植物基因中，包括农杆菌介导转化、病毒介导转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物的基因转化，但其转化技术也可用于本发明启动子和外源基因的导入。当然，适于本发明的启动子和外源基因导入的另一种方法是粒子轰击，(即显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化植物细胞的方法是原生质体转化。经转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。
[0057]主发明的启动子及调控植物中基因表达的方法，可以应用于植物品种的选育。例如，可用于水稻的育种。在本发明的一个【具体实施方式】中，所述水稻为日本晴。
[0058]本发明所述的启动子可称为一种新的启动子，作为植物(特别是单子叶植物)转基因的工具启动子，为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究提供便利，从而极大地缩短优良品种的选育时间。
[0059]主发明中，单子叶植物具体可以为禾本科植物，更具体的，可为稻属植物，例如水稻，包括但不限于日本晴。[0060]下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0061]实施例1:P005启动子片段的PCR扩增及pMD18_T+P005重组载体的构建。
[0062](一)、P005启动子片段的PCR扩增
[0063]使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号:DP320-02)提取水稻日本晴(已在申请号为200910238992.0、发明名称为“一种启动子Bg1sP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏，并于2010年9月22日公开，保藏编号为CCTCC NO:P200910)的基因组DNA，根据该启动子在水稻日本晴gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1，加限制性酶切位点EcoR I和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点KpnI和保护碱基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA为模板，使用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。
[0064]表1基因启动子扩增的PCR体系
[0065]
【权利要求】
1.一种启动子，其特征在于，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列: a、SeqID N0.1所示的核苷酸序列； b、与SeqID N0.1互补的核苷酸序列； C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列； d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列； e、与上述a或b所不核苷酸序列具有至少90%同一'丨生的核苷酸序列。
2.—种核酸构建体，其特征在于，包含如权利要求1所述的启动子，以及与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的启动子或如权利要求2所述的核酸构建体，优选地，所述载体为如权利要求1所述的启动子或如权利要求2所述的核酸构建体与PMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞含有如权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或如权利要求3所述的载体，优选地，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。
5.一种含有如权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或如权利要求3所述的载体或如权利要求4所述的重组细胞的植物愈伤组织、植物外植体或植物，优选地，所述植物为单子叶植物，更优选地，所述植物为稻属，还优选地，所述植物为水稻，进一步优选地，所述植物为水稻日本晴。
6.一组引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增得到上述启动子，所述引物对的两条引物分别含有Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列，优选地，所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和\或保护碱基，更优选地，所述引物对的两条引物分别具有Seq ID No:4和Seq ID No:5所示的序列。
7.一种制备SEQ ID No:1所示启动子的方法，其特征在于，包括:以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO:1在水稻日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计，优选是如权利要求6所述的引物对。
8.—种调控植物中基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括，将如权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或如权利要求3所述的载体或如权利要求4所述的重组细胞导入植物细胞；优选地导入植物愈伤组织；进一步优选地，所述启动子或所述核酸构建体导入植物细胞是利用农杆菌转化植物愈伤组织，所述植物优选为单子叶植物，所述植物再优选为稻属，所述植物更优选为水稻，所述植物进一步优选为水稻日本晴。
9.一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养如权利要求4所述的重组细胞或如权利要求5所述的植物愈伤组织或植物外植体或植物。
10.如权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或如权利要求3所述的载体或如权利要求4所述的重组细胞或如权利要求5所述的植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途，优选地，所述植物是单子叶植物，再优选地，所述植物为稻属，更优选地，所述植物为水稻，进一步优选地，所述植物为水稻日本晴。
【文档编号】C12N5/10GK103627708SQ201310521511
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】汪杰, 黄刚, 闫智慧, 焦伟刚, 范明君, 辛宜, 田伯瑞, 廖加涛, 杨爽 申请人:华大基因杨凌创新研究院有限公司