快速检测猪嵴病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测猪嵴病毒的SYBRGreen?荧光定量试剂盒及应用，该试剂盒含有a)RNA裂解液，b)PrimeScript?RTEnzymeMixI，c)逆转录反应液，d)定量引物F及R，e)SYBR?PremixExTaqII，f)标准阳性模板，g)阴性对照品等。与之前的RT-PCR试剂盒相比，本发明简化了操作步骤，缩短了反应时间，减少了污染几率，并且能够提高检测的准确度和速度，一个样本检测可在3个小时内完成。荧光定量PCR在扩增完成后可以直接通过标准曲线定量起始病毒的拷贝数，能为流行病学提供可靠信息，该试剂盒还可以应用于（抗）猪嵴病毒药物的研究，对生物制品进行定量检测及质量监控；应用前景十分广泛。
【专利说明】快速检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及发明一种快速检测猪嵴病毒的SYBR Gree I实时荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒可高效方便地对临床样本中猪嵴病毒进行检测及定量，可以用于猪嵴病毒病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
【背景技术】
[0002]猪嵴病毒(Porcine kobuvirus, PKoV)是一种无囊膜正链RNA病毒，属小RNA病毒科，嵴病毒属。自2007年，猪嵴病毒在匈牙利被首次检测到后，很快在中国大陆、亚洲其他国家(包括泰国、日本、韩国)、南美的巴西及欧洲荷兰等国被发现，而且感染率均较高，从16.7%到99.0%不等。研究数据表明在具有腹泻症状的猪群中，阳性率明显高于无腹泻症状的猪群，可能暗示其对猪具有一定的致病性。
[0003]尽管如此，猪嵴病毒是否与肠道疾病有关，现在尚无定论，关于致病机制方面的研究成果也未见报道。但是在猪粪样品中检出率较高，长期处于隐性感染状态，可能对宿主产生不利影响。相关报道指出，在对仔腹泻猪粪便样品的病原分子检测中，常引起腹泻的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均为阴性，少数轮状病毒为阳性，而猪嵴病毒的阳性率最高，因此，推测该病毒可能与仔猪腹泻有关。
[0004]鉴于此，研发一种快速检测猪嵴病毒感染的荧光定量PCR试剂盒，可高效方便地对临床样本中猪嵴病毒 进行检测及定量，可用于猪嵴病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
[0005]国内学者徐志文、赵勤等发明了一种检测猪嵴病毒的RT-PCR试剂盒，RT-PCR用于病毒病的诊断虽然具有灵敏度高、快速、特异的特点。但是存在无法对检测样品进行准确定量、检测通量不高，并且电泳等PCR后的处理过程容易造成污染而出现假阳性，限制了该方法的应用。
[0006]荧光定量PCR技术作为PCR技术的发展，以其独特的优势广泛应用于众多领域的研究中。为了建立一种较为快速准确的检测猪嵴病毒的检测方法，本研究选择了 SYBRGreen I荧光染料法。与TaqMan探针法相比较，SYBR Green I荧光染料法操作简便，成本更为廉价。通过优化实时荧光定量PCR反应体系参数，我们发明了一种用于猪嵴病毒检测的SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒。该方法引A了特异性扩增引物以及SYBR GreenBuffer体系，使得检测的灵敏度和特异性得到了很大程度的增强，并避免了漏检和误检，该试剂盒能够达到快速准确检测的目的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪。该检测方法相对于传统的检测方法具有灵敏度高、效率高的优点。[0008]本发明试剂盒可以应用于(抗)猪嵴病毒药物的研究，可对生物制品进行定量检测及质量监控，可用于猪嵴病毒引起的流行病学的调查。总之，该试剂盒能够为相关的基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
[0009]为了达到以上目的，本发明采取以下技术方案:
试剂盒的组成及使用方法:
1.试剂盒的组成
a)RNA裂解液，b) PrimeScript? RT Enzyme Mix I, c)逆转录反应液，d)定量引物F及 R e) SYBR? Premix Ex Taq II, f) ROX Reference Dye, g)标准阳性模板，h)阴性对照品i)无菌双蒸水
所述逆转录反应液含有 5XPrimeScript? Buffer, Oligo dT Primer,Random 6 mers引物。
[0010]荧光定量引物F及R，分别为(SEQ IDNO I)和(SEQ IDNO 2)所示的核苷酸序列。
[0011]标准阳性模板是含有猪嵴病毒特异性目的片段的质粒，该质粒转化到大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，经过DNA纯化试剂盒纯化，分光光度计吸光值A260下定量，-20°C保存。
[0012]阴性对照样品由SPF猪粪便样品中提取RNA，经过逆转录获得的cDNA样品。
[0013]SYBR? Premix Ex Taq II 液含有 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+, TliRNaseH, SYBR? Green I，购自大连宝生物公司。
[0014]ROX Reference Dye购自大连宝生物公司，其使用于Life Technologies等公司的Real Time PCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。Applied Biosystems7300 Real-Time PCR System 和 StepOnePlus? 使用 ROX Reference Dye, 7500 Real-TimePCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 使用 ROX Reference Dye II。ThermalCycler Dice Real Time System I1、 LightCycler?/ LightCycIer?480 System(RocheDiagnostics)或 CFX96Real_Time PCR Detection System (Bio-Rad)等 Real Time PCR扩增仪不必使用。
[0015]本发明通过优化反应体系，如引物浓度、退火温度等的优化，建立了检测猪嵴病毒的定性及定量的试剂盒，该试剂盒的灵敏度达到7.02 X IO1 copies/iil，完全可以满足猪嵴病毒的快速检测及定量的要求。
[0016]该试剂盒的使用方法:
1)RNA裂解法从待测样本中提取RNA，进行逆转录反应，反应产物于_20°C保存；
2)将标准阳性模板稀释到不同浓度的标准样品，待用；
3)取I)步中的cDNA和2)步中的标准品作为模板，添加定量引物F及R、SYBR?PremixEx Taq II反应液进行荧光定量PCR反应对样品核酸含量进行定量。
[0017]本发明与其它常规的检测方法具有以下优点及效果:
1、高灵敏度，最低的检测限度能够达到7.02X101 copies/U I ；
2、省时、高效，整个反应过程包括核酸提取和cDNA制备、定量检测仅需3个小时；
3、适用于大批量样品检测；
4、该试剂盒可以应用于(抗)猪嵴病毒药物的研究，可对生物制品进行定量检测以及质量监控，适用范围较广。【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1:PKoV SYBR Green 荧光定量 RT-PCR 融解曲线；
图2:PKoV SYBR Green荧光定量RT-PCR标准曲线；
? 3:PkoV SYBR Green 荧光定量 RT-PCR 特异性检验扩增图；1-4:PEDV、PRV、TGEV、NTC ；5:PkoV ；
图4 =PKoV SYBR Green荧光定量RT-PCR敏感性检验扩增图;1_10:7.02 X IO9,
7.02 X 108、7.02 X 107、7.02 X 106、7.02X 105、7.02X 104、7.02X 10\7.02 X 102、7.02X10\7.02X10° ；11 =NTC0
[0019]
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0021 ] 实施例1猪嵴病毒荧光定量试剂盒组成
1试剂盒组成
按照每个试剂盒检测30个样品计，每次检测样品时设阳性、阴性对照，试剂盒组成: RNA裂解液30ml，每个样品用Iml。
[0022]逆转录酶共30 U I,每个样品用I Pi。
[0023]逆转录反应液共90 ii I,每个样品用I。
[0024]荧光定量上、下游引物各200 iU，每个反应各用lul。
[0025]上游引物F: 5 ’ -TGATGCGGAGCCTACTGAAC-3 ’
下游引物 R:5’ -GCTATGATGGTAAGGACGAAAC-3’
SYBR? Premix Ex Taq II 液共 2.5ml，每个反应添加 12.1。
[0026]标准阳性模板(7.02 X IO9Copies/U I)共 20iU。
[0027]阴性对照品:用PBS液将样品按照1:10的比例稀释SPF猪粪便样品，涡旋振动5min。在4°C条件12000r/min离心15min,取上清液提取RNA,逆转录获得cDNA,共30 y I,每次用1U l。
[0028]自备试剂:氯仿、异丙醇、DEPC处理的无菌双蒸水、DEPC处理过的无菌双蒸水配置的75%乙醇。
[0029]实施例2对临床样本的检测
1)标准曲线的制作:将阳性模板进行10倍系列稀释制成阳性标准品，取阳性标准品2 u l, SYBR? Premix Ex Taq II 12.5 U l,灭菌蒸懼水 8.5 u I, Primer F lul, Primer RI U l,FTC-2000荧光定量基因扩增仪上平行做PCR检测，每个阳性标准品做三个平行对照。反应条件为95°C变性30sec ;95°C变性30sec，55°C退火25sec，72°C延伸20sec，40个循环；溶解曲线分析。以阳性标准品稀释度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线。从标准曲线可以看出，该荧光定量方法在PSV核酸为7.02 X IO1-?.02 X IO9拷贝/反应之间呈现良好的线性关系，扩增效率为99%，标准方程为:Ct=-3.3507x+39.186 (R2=0.9975)。
[0030]2)病毒RNA提取:采集临床样本，加适量PBS缓冲液悬浮适量的猪粪样品，4°C离心机中12 OOO r/min 离心15 min, 取上层液相200 u L转移到另一无RNase的1.5ml离心管中，并加入ImL Trizol试剂,混合均匀后,静置5min ;再加入200 y L的氯仿,混合均匀，静置5min ;同样4°C离心机中12 000 r/min离心15 min,取上层液相750 y L,加入等体积的异丙醇，混合均匀，室温静置IOmin ; 4°C条件下12 000 r/min离心IOmin,弃掉上清液，加入Iml 使用DEPC水配置的75%的乙醇溶液，4°C 12000 r/min离心5min 弃掉乙醇溶液，待残余乙醇溶液挥发完全后，加入30 ill的DEPC水溶解核酸物质，置于-80°C条件下保存备用。
[0031]3)逆转录反应:反应体系:PrimeScript? RT Enzyme Mix I 1.0ii L、逆转录反应液3iiL、RNA 6 ii L ;反应条件:42 V 15 min，85°C 5s，cDNA置于_20°C保存备用或立即进行荧光定量扩增反应。
[0032]4)荧光定量检测反应:反应体系:cDNA 1.0u L, SYBR? Premix Ex Taq II (2x)12.5 u L、Primer Flu L、Primer Rlu 1、灭菌双蒸水 9.5 u 1 ;反应条件:95°C变性 30sec ；95°C变性3086(3，551:退火25sec，72°C延伸20sec，40个循环；溶解曲线分析。
[0033]5)PCR反应结束后，将获得的Ct值代入标准方程，换算得出临床样本中病毒核酸的拷贝数。
[0034]6)特异性分析:以猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核酸物质作为模板，并设置NTC (No Template Control)及阳性对照，采用本研究建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法进行检测。结果(见图3)显示该试剂盒能够特异性地扩增猪嵴病毒基因。
[0035]7)敏感性检验:重组质粒进行10倍倍比稀释，稀释后的各浓度为7.02X IO9、7.02X IO8、7.02X 107、7.02X 106、7.02X 105、7.02X 104、7.02X 103、7.02X 102、
7.02X101、7.02X10° copies/μL。结果(见图4)显示本方法可以有效检测出猪嵴病毒最低核酸量拷贝量为7.02 X 101 copies/u L
8)重复性检验分析:选取7.02 X 109、7.02 X 107、7.02 X 105拷贝/ y L三个浓度作为模板，每个浓度做3次重复，在同一反应参数下进行检测，反应结束后，计算Ct值的变异系数(标准偏差/平均数)，评价重复性。结果为:
【权利要求】
1.一快速定量检测猪嵴病毒的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒包括: a)RNA裂解液，b) PrimeScript? RT Enzyme Mix I, c)逆转录反应液，d)定量引物F及 R e) SYBR? Premix Ex Taq II, f) ROX Reference Dye, g)标准阳性模板，h)阴性对照品i)无菌双蒸水 所述逆转录反应液含有 5XPrimeScript? Buffer, Oligo dT Primer,Random 6 mers引物， 标准阳性模板是含有猪嵴病毒特异性目的片段的质粒，阴性对照样品由SPF猪粪便样品中提取RNA，经过逆转录获得的cDNA样品，SYBR? Premix Ex Taq II液含有TaKaRa ExTaq HS, dNTP Mixture, Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I。
2.根据权利要求1所述的猪嵴病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:所述引物F序列为 5’ -TGATGCGGAGCCTACTGAAC-3’，R 序列为 5’ -GCTATGATGGTAAGGACGAAA-3’。
3.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于灵敏度达到7.02 X IO1 copies/U 1，完全可以满足猪嵴病毒的快速检测及定量的要求。
【文档编号】C12Q1/70GK103602758SQ201310521544
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】兰道亮, 陈亚冰, 李键, 熊显荣, 符梅, 王长松, 华修国 申请人:西南民族大学