一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，包括如下步骤：（1）提供抗菌肽LfcinB基因序列，α信号肽基因序列；（2）构建酵母细胞中表达抗菌肽LfcinB的重组质粒pYES2-α-LfcinB；（3）重组质粒pYES2-α-LfcinB转化酿酒酵母INVSC1细胞；（4）筛选转化菌，鉴定；（5）培养转化菌，获得抗菌肽LfcinB；（6）抗菌肽LfcinB的鉴定。本发明方法所表达的抗菌肽对大肠杆菌DH5α，和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果。
【专利说明】一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和基因工程领域，涉及酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法。
【背景技术】
[0002]目前，由于抗生素在临床中被大量使用，产生严重的耐药性问题。人类急需新型的药物来代替抗生素，抗菌肽是一类小分子两亲性多肽，长度一般小于50个氨基酸。来源于自然界中的各种细菌、植物和动物，分布广泛。因其抗菌机理独特，不易产生耐药性，并且有水溶性好，热稳定性强，抗菌谱广，有望成为传统抗生素的替代品。牛乳铁蛋白肽LfcinB是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶作用后从N-末端释放的大小为25个残基组成的结构域，是近年来发现的一种新型抗菌肽，具备抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和调节机体的免疫和提高肠道对铁离子的吸收等作用，其抗菌活性比乳铁蛋白高400多倍，具有重要的应用价值。LfCinB来源于动物本身，氨基酸序列为FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF，其中不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全的产品，LfeinB具有营养生理调节作用，提高幼龄动物的免疫机能，改善动物肠道微生态环境，促进动物健康的作用，它不会使细菌产生抗药性，也不会残留于畜产品中，具有替代抗生素的巨大潜能。其具有传统抗生素没有的作用效果。
[0003]抗菌肽的表达体系目前有以下几个来源。天然抗菌肽虽然来源广泛，但是在生物体内产量小，难于分离纯化，成本高。化学合成抗菌肽虽然周期短、工程量小、能随意组合氨基酸残基，但存在消旋化问题，并且生产成本昂贵。基因工程技术主要通过原核表达和真核表达途径，具有操作简单，易于分离和纯化，且生产成本低等特点，使其具有规模化、产业化生产的潜力，成为近些年来的研究热点。
[0004]原核表达体系以大肠杆菌表达体系为主，是目前掌握最为成熟的表达系统，其优点是生长周期短，表达产量较高，成本相对低廉。但表达抗菌肽具有以下缺点:原核表达需破碎细胞释放抗菌肽，增加了生产成本和分离纯化的难度；其持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，添加融合头融合表达虽然能够减少毒性，但需切割融合头，步骤繁琐；原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
[0005]酵母表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又有真核生物对蛋白质进行翻译后修饰的优点。酿酒酵母遗传背景清楚，易操作；酿酒酵母与日常生活密切，安全，无毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；工艺简单成本较低等特点。目前未见大量关于酿酒酵母分泌表达抗菌肽的报道，本方法对抗菌肽的真核表达研究具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽的方法。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，包括以下步骤:(1)提供抗菌妝LfcinB基因序列，α信号妝基因序列；
(2)构建酵母细胞中表达抗菌肽LfcinB的重组质粒pYES2-a -LfcinB ；
(3)重组质粒pYES2-a -LfcinB转化酿酒酵母INVSCl细胞；
(4)筛选转化菌，鉴定；
(5)培养转化菌，获得抗菌肽LfcinB；
(6)抗菌肽LfcinB的鉴定。
[0008]所述步骤(1)中，所述的抗菌肽LfcinB基因序列如SEQ ID Ν0:2所示。
[0009]所述步骤(1)中，所述的α信号肽基因序列是以质粒pPICZaA中α信号肽为模板，以 F2:5' CCCAAGCTTACGATGAGATTTCCTTCAAT3' (SEQ ID N0:5)和 R2:5' GCTCTAGAGAATTC AGCTTCAGCCTCTCTT3' (SEQ ID NO: 6 )为引物 PCR 获得。
[0010]所述步骤(3)中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-red公司电转化仪预设PIC程序。
[0011]所述步骤(4)中，筛选转化菌方法是用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培养基平板培养的方法筛选。
[0012]所述步骤(5)中，培养条件为30°C, 200rpm/min, 7-9天。
[0013]所述步骤(5)中，所述的抗菌肽LfcinB存在于培养酵母菌INVSCl的菌液上清。
[0014]所述步骤(6)中，所述的抗菌肽LfcinB的鉴定方法是Tricine-SDS-PAGE。
[0015]本发明的有益效果在于:I)通过酿酒酵母分泌表达获得抗菌肽LfcinB ;2)表达的抗菌肽对大肠杆菌σ，和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为重组质粒pYES2- a -LfcinB的构建过程示意图。
[0017]图2为a -factor基因的PCR产物的电泳图，其中，泳道M为DNA Marker D(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp )，泳道 I 为 a -factor 的 PCR 产物。
[0018]图3为抗菌肽LfcinB基因的PCR产物的电泳图，其中，泳道M为DNA Marker D(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道 I 为抗菌肽 LfcinB 的 PCR 产物。
[0019]图4为工程菌诱导上清Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为ProteinMarker (66kDa, 45kDa, 35kDa, 27kDa, 20kDa, 14.4kDa, 9.5kDa, 6.5kDa, 4.1kDa),泳道 I 为诱导上清25ul，泳道2为未诱导上清25ul。
[0020]图5为工程菌诱导上清对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌活性检测图，其中，5A中培养皿上的菌株为大肠杆菌DH50.，5B中培养皿上的菌株为枯草芽孢杆菌，图中I为IOug氨苄青霉素，2为工程菌诱导96 200ul上清，3为工程菌未诱导96h 200ul上清，4无菌ddH20。
【具体实施方式】
[0021]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步说明，但并不局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
[0022]实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京:科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
[0023]实施例中所用大肠杆菌(Escherichia coli )/--"σ ,枯草芽孢杆菌为本实验室保存。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVScl 购自 Invitrogen 公司。pYES2 表达载体购自Invitrogen公司。pPICZ a A表达载体(Invitrogen公司)为本实验室保存。
[0024]实施例:
1.抗菌肽LfcinB序列的获得:
抗菌肽 LfcinB 氨基酸序列为:FKCRRWQWRMKK LGA PSITCVRRAFCSEQ ID NO: 1)，依照酿酒酵母密码子偏好性，优化后的碱基序列:TTTAAATGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAAAAATTGGGTGCTCCATCTATTACT TGTGTTAGAAGAGCTTTT (SEQ ID NO: 2)，设计模板和上下游引物。
[0025]引物和模板序列如下:
LfcinB Fl:5’ CCGCTCGAGAAAAGATTTAAATGTAG 3’ (SEQ ID NO:3),
LfcinB Rl:3’ GGAATTCTTAAAAAGCTCTTCTAACACAAG 5’(SEQ ID NO:4)。
[0026]LfcinB 模板:5，TTTAAATGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAAAAATTGGGTGCTCCATCTATTACT TGTGTTAGAAGAGCTTTT3’ (SEQ ID NO:2)。
[0027]上游引入通ο /限制性酶切位点，下游弓丨入EcoR I限制性酶切位点。
[0028]PCR 扩增抗菌肽 LfcinB 基因，PCR 反应条件:94°C 5min，94°C 30s ~62°C 30s -72°C lmin，30个循环，72°C IOmin0 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。扩增产物经回收纯化后_20°C保存备用。
[0029]2.α信号肽序列的获得:
以本实验室保存的pPICZ a A质粒为模板,设计上下游引物；
F2:5/ CCCAAGCTTACGATGAGATTTCCTTCAAT3' (SEQ ID NO:5)
R2:5/ GCTCTAGA GAATTC AGCTTCAGCCTCTCTT3; (SEQ ID NO:6)
上游引入历III限制性酶切位点，下游部分引入油a I和及^7? I限制性酶切位点，同时为了避免信号肽切割不完全的现象出现，去除了 Stel3切割位点，仅保留Kex2切割位点。
[0030]PCR 扩增 α 信号肽:PCR 反应条件:94°C 5min，94°C 30s - 60°C 30s - 72°Clmin，30个循环，72°C IOmin0 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。扩增产物经回收纯化后-20°C保存备用。
[0031]3.分泌表达载体pYES2 - α的构建:
将PYES2质粒和PCR扩增后回收的α信号肽进行Hind III和Xba I双酶切反应，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，Τ4连接酶，16°C Ih进行连接反应后，转化大肠杆菌DH5 α菌株，转化菌落经菌液PCR鉴定后测序验证。
[0032]4.分泌表达型重组质粒pYES2- a -LfcinB的构建
将抗菌肽LfcinB PCR回收产物与pYES2-a表达载体进行沿ο I和及^7? I双酶切反应，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，Τ4连接酶，16°C，Ih进行连接反应后，转化大肠杆菌DH5 α菌株，转化菌落经菌液PCR鉴定后测序验证。
[0033]5.重组质粒pYES2- a - LfcinB转化酿酒酵母INVScl (I)制备酿酒酵母INVScl感受态细胞①接种30 μ I酿酒酵母INVScl冻存甘油菌至3 ml YB)液体培养基中，30°C，200 rpm，过夜震荡活化。
[0034]②转接500 μ I过夜活化的酿酒酵母INVScl菌液到50 mlYH)液体培养基中，300C，200 rpm,震荡培养至OD600为1.1左右。
[0035]③4°C、1500 g、5 min，离心收集细胞，用50 ml预冷的无菌水轻轻吹吸悬浮细胞。
[0036]④4°C、1500 g、5 min,离心,用25 ml预冷的无菌水悬浮细胞。
[0037]⑤4°C、1500 g、5 min，离心，用25 ml预冷的山梨醇轻轻吹吸悬浮细胞。
[0038]⑥4°C、1500 g、5 min，离心，用2 ml预冷的山梨醇悬浮细胞。
[0039]⑦4°C、1500 g、5 min，离心，用200 μ I预冷的山梨醇悬浮细胞，分装到两管2 ml的EP管中，每管100 μ I。
[0040](2)转化pYES2 - a -LfcinB质粒质粒到酿酒酵母INVScl感受态细胞中: ①吸取10 μ I pYES2 - α - LfcinB质粒加入到100 μ I酿酒酵母INVScl感受态
细胞中，混合均匀，加至预冷的电击杯中。
[0041]②冰上放置5 min。
[0042]③根据电击仪推荐的酿酒酵 母参数设置，进行点击。
[0043]④立即向电击杯中加入500 μ I预冷的山梨醇溶液，混合均匀。
[0044]⑤全部吸出均匀涂于SC- U平板。
[0045]⑥置于30°C恒温培养箱中，直至长出单克隆。
[0046](3)菌落PCR反应筛选阳性菌落。从SC- U平板上选5个单菌落做编号标记，用枪头挑取少量菌体加到PCR体系中，PCR反应条件:94°C 5min，94°C 30s - 62°C 30s - 72°Clmin, 30个循环，72°C IOmin0 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，筛选出阳性菌落。
[0047]6.抗菌肽LfcinB酿酒酵母工程菌的表达:
(I)诱导工程菌表达重组LfcinB结构域，具体步骤如下:
①转接200 μ?抗菌肽LfcinB酿酒酵母工程菌至20 ml SC- U液体培养基中，30°C，200 rpm,过夜活化。
[0048]②测量菌液的0D_值(Y)，按公式X=(Y*20)/0.4，计算将菌液的0D_稀释到0.4所需的SC- U诱导培养基量(X)。
[0049]@4°〇、1500父8、离心5 min，弃上清，按第二步中计算出的X值加入SC- U诱导培
养基，吹吸悬浮，混合均匀。
[0050]④30°C, 200 rpm,振荡培养 7-9 天。取 I ml 菌液,4°C、1500X g、离心 5 min,留上清。
[0051](2)丙酮沉淀浓缩重组LfcinB结构域,具体步骤如下:
①取I ml上清加入5 ml _20°C预冷的丙酮。
[0052]②静置-20 V冰箱中2 h。
[0053]③4°C,12000 rpm,离心10 min,轻轻弃去上清。
[0054]④沉淀置于通风处自然风干。
[0055](3) Tricine - SDS - PAGE 电泳检测表达结果.7.抗菌肽LfcinB结构域的活性检测:
E.coli DH5a和枯草芽孢杆菌于37°C，180 rpm，过夜培养。测菌液的0D_值，将其稀释到0.5个麦氏单位(1.5X IO8 CFU/ml)。
[0056]吸取200 μ?菌液，均匀涂布于没有抗生素的LB平板上，轻轻放置牛津杯。
[0057]吸取诱导上清200ul加入牛津杯中，对照为无菌水、SC-U诱导培养基、未诱导上清、AMP，置于37°C恒温培养箱中过夜培养，次日观察抑菌效果。由图5可见，本发明表达的抗菌肽对大肠杆菌σ，和枯草芽孢杆菌`有明显的抑菌效果。
【权利要求】
1.一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfCinB的方法，包括以下步骤: (1)提供抗菌妝LfcinB基因序列，α信号妝基因序列； (2)构建酵母细胞中表达抗菌肽LfcinB的重组质粒pYES2-a -LfcinB ； (3)重组质粒pYES2-a -LfcinB转化酿酒酵母INVSCl细胞； (4)筛选转化菌，鉴定； (5)培养转化菌，获得抗菌肽LfcinB； (6)抗菌肽LfcinB的鉴定。
2.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述的抗菌肽LfcinB基因序列如SEQ ID Ν0:2所示。
3.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述的α信号肽基因序列是以质粒pPICZaA中α信号肽为模板，以F2:5/ CCCAAGCTTACGATGAGATTTCCTTCAAT3' (SEQ ID Ν0:5)和 R2:5' GCTCTAGA GAATTCAGCTTCAGCCTCTCTT3' (SEQ ID NO: 6 )为引物 PCR 获得。
4.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤(3)中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-red公司电转化仪预设PIC程序。
5.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤(4)中，筛选转化菌方法是用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培养基平板培养的方法筛选。
6.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤e中，培养条件为30°C, 200rpm/min, 7-9天。
7.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤(5)中，所述的抗菌肽LfcinB存在于培养酵母菌INVSCl的菌液上清。
8.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤(6)中，所述的抗菌肽LfcinB的鉴定方法是Tricine-SDS-PAGE。
【文档编号】C12R1/865GK103555756SQ201310521629
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】查向东, 马利娟, 赵大伟, 余忠丽, 车媛媛, 徐雪娇 申请人:湖北希普生物科技有限公司