一种Br-or-Indel分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种Br-or-Indel分子标记及其应用。本发明公开的一对引物，该对引物由（1）和（2）所示的两条引物组成：（1）Br-or-IndelF，该引物的序列如SEQ?ID?No.3所示；（2）Br-or-IndelR，该引物的序列如SEQ?ID?No.4所示。本发明公开的Br-or-Indel标记可以应用于提高橘红心大白菜的选育效率。
【专利说明】—种Br-or-lndel分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种Br-or-lndel分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002]番茄红素是植物中所含的一种天然色素，为类胡萝卜素的一种，是目前在自然界的植物中被发现的最强抗氧化剂之一。番茄红素清除自由基的功效远胜于其他类胡萝卜素和维生素E。它不仅可以有效的延缓衰老，还具有抗癌抑癌的功效，对增强人体免疫系统等也具有重要意义。
[0003]橘红心大白菜是大白菜的一种特色品种，其球内叶为橘红色。有研究表明，大白菜球心橘红色的形成与番茄红素的积累有着密切的关系。李娟(2007)研究表明橙色大白菜结球过程中番茄红素积累特点是先降低然后又回升，普通大白菜中没有检测到番茄红素。熊玉林(2002)、刘秀村(2008)也均研究证明橘红心大白菜结球期心叶含大量的番茄红素，而普通大白菜没有检测到番茄红素。因此，针对大白菜橘红心性状的研究将有利于选育出满足人们对大白菜高营养品质要求的品种。
[0004]张德双等(2003 )通过大白菜白心及橘红心分离群体的遗传分析表明，橘红色球色对白色为隐性，为质量性状，由一对隐性基因控制。刘秀村等(2003)找到了一个与橘红心球色基因连锁的RAPD分子标记，其遗传距离为3.8cM,但RAPD标记作为显性标记，不能区分杂合型和纯合型，而且易受环境影响重复性差。王琦等(2006)通过对大白菜橙色叶球性状连锁分子标记的筛选，得到了一个与橙色叶球基因的遗传距离为3.7cM的SCOR标记，但此SCOR标记同样是显性标记不能很好的区分杂合型和纯合型。张凤兰等(2008)和冯辉等(2010)通过分离群体筛选得到SCAR标记和共显性标记分别将橘红心球色基因or定位在8cM和13cM及1.3cM和3.3cM之间，但是其遗传距离还相对较远。张俊祥等(2013)利用两个Indel分子标记将or基因定`位在0.1cM和0.2cM的范围内，但仍然存在一定的重组率。
[0005]大白菜是人们经常食用的重要蔬菜之一，随着人民生活水平的提高，其消费模式也在悄然发生变化。大白菜的品质、色泽等日益受到消费者的青睐。橘红心大白菜品种叶心全部橘红色，菜型美观，营养元素丰富，对人体健康十分有益。大白菜橘红心or基因的研究将会推进品质育种的进程。利用与目标性状共分离的分子标记进行标记辅助选择是在遗传育种中十分有效的方法，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境影响等优点，可以在幼苗期进行选择，加快育种过程。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种Br-or-lndel分子标记及其应用。
[0007]本发明提供的一对引物，由(I)和(2)所示的两条引物组成:
[0008](I) Br-or-1ndelF,该引物的序列如 SEQ ID N0.3 所示;
[0009](2) Br-or-1ndelR,该引物的序列如 SEQ ID Νο.4 所示。
[0010]一种DNA分子也属于本发明的保护范围，该分子的序列如SEQ ID N0.5所示。[0011]—种DNA分子也属于本发明的保护范围，该分子的序列如SEQ ID N0.6所不。
[0012]一种辅助鉴定待测大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒由上述的两条引物、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和ddH20组成；[0013]所述试剂盒中包括使用说明书，使用说明书中记载如下内容:以待测大白菜的基因组DNA为模板，以上述的两条引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物为长度为261bp的DNA分子，则待测大白菜为纯合白心大白菜；如果PCR扩增产物为长度为286bp的DNA分子，则待测大白菜为纯合橘红心大白菜；如果PCR扩增产物为长度为261bp的DNA分子和长度为286bp的DNA分子，则待测大白菜为杂合白心大白菜。
[0014]上述试剂盒中，所述待测大白菜的基因组DNA为待测大白菜的叶片的基因组DNA ；
[0015]所述261bp的DNA分子为SEQ ID N0.5所示的DNA分子；
[0016]所述286bp的DNA分子为SEQ ID N0.6所示的DNA分子；
[0017]所述纯合白心大白菜具体为白心大白菜91-112 ；
[0018]所述纯合橘红心大白菜具体为橘红心大白菜T12-9 ；
[0019]所述杂合白心大白菜具体为白心大白菜91-112与橘红心大白菜T12-9的杂交F1代。
[0020]一种辅助检测大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜的方法也属于本发明的保护范围，该方法是利用上述的两条引物和/或上述任一所述的试剂盒进行的，包括如下步骤:
[0021](I)提取待测大白菜的基因组DNA ；
[0022](2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以上述的两条引物为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0023](3)如果步骤(2)得到的PCR产物为261bp的DNA分子，则待测大白菜为纯合白心大白菜；如果PCR产物为286bp的DNA分子，则待测大白菜为纯合橘红心大白菜；如果PCR产物为261bp的DNA分子和286bp的DNA分子，则待测大白菜为杂合白心大白菜。
[0024]上述方法中，所述待测大白菜的基因组DNA为待测大白菜的叶片的基因组DNA ；
[0025]所述26Ibp的DNA分子为SEQ ID N0.5所示的DNA分子；
[0026]所述286bp的DNA分子为SEQ ID N0.6所示的DNA分子；
[0027]所述纯合白心大白菜具体为白心大白菜91-112 ；
[0028]所述纯合橘红心大白菜具体为橘红心大白菜T12-9 ；
[0029]所述杂合白心大白菜具体为白心大白菜91-112与橘红心大白菜T12-9的杂交F1代。
[0030]上述任一所述的方法中，所述PCR的体系如下:
[0031]2.0 u L PCR 扩增缓冲液、0.8 u L dNTPs (每种 2.5mM)、浓度均为 10 u mol/L的上述的两条引物各1.0 u L、浓度为5U/ u L的DNA聚合酶0.2 u L、所述模板LOuL(200ng/ u L)和 14 u LddH2O ；
[0032]所述PCR扩增缓冲液的商品名称为10XPCR Buffer，购自TaKaRa公司，产品目录号为9151A ；
[0033]所述dNTPs购自TaKaRa公司，产品目录号为D4030A ；[0034]所述DNA聚合酶的商品名称为Taq DNA polymerase,购自TaKaRa公司，产品目录号为ROOl ；
[0035]所述PCR的程序如下:
[0036]940C 5min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin0
[0037]上述引物在辅助鉴定大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜中的应用也属于本发明的保护范围；
[0038]和/ 或，
[0039]上述任一所述的DNA分子在辅助鉴定大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜中的应用也属于本发明的保护范围；
[0040]和/ 或，
[0041]上述任一所述的试剂盒在辅助鉴定大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜中的应用也属于本发明的保护范围；
[0042]所述纯合白心大白菜具体为白心大白菜91-112 ；
[0043]所述纯合橘红心大白菜具体为橘红心大白菜T12-9 ；
[0044]所述杂合白心大白菜具体为白心大白菜91-112与橘红心大白菜T12-9的杂交F1代。
[0045]上述引物、上述任一所述的DNA分子或上述任一所述的试剂盒在选育橘红心大白菜中的应用也属于本发明的保护`范围。
[0046]本发明提供的Br-or-lndel分子标记可以应用于提高橘红心大白菜的选育效率。【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1为BC1分离群体的16株白菜的叶片基因组DNA电泳结果。
[0048]图2为Br-or-lndel分子标记在三种不同基因型的大白菜中的PCR扩增结果。
[0049]图3为Br-or-lndel分子标记在BC1分离群体的PCR扩增结果。
【具体实施方式】
[0050]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0051]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]白心大白菜91-112和橘红心大白菜T12-9在文献“Fenglan Zhang, GuochenWang,Mei Wang, Xiucun Liuj Xiuyun Zhao，Yangjun Yu，Deshuang Zhang，ShuancangYu.1dentification of SCAR markers linked to or, a gene inducing beta—caroteneaccumulation in Chinese cabbage.Euphyticaj November2008, Volumel64, Issue2, pp463-471”中公开过，公众可从北京市农林科学院获得。
[0053]10XPCR Buffer 购自 TaKaRa 公司，产品目录号为 9151A。
[0054]dNTPs购自TaKaRa公司，产品目录号为D4030A。
[0055]Taq DNA polymerase 购自 TaKaRa 公司，产品目录号为 R001。
[0056]实施例1、Br-or-lndel分子标记的获得
[0057]一、人工合成如下引物:
[0058]Br-or-HF:5’ -AATCCCGTAACGTGTGCTGAT-3，；(SEQ ID N0.1)[0059]Br-or-HR:5，-CCATAGTGCCTGTCACATAAAACC-3，。(SEQ ID N0.2)
[0060]二、提取父本白心大白菜91-112和母本橘红心大白菜T12-9叶片的基因组DNA。
[0061]三、分别以两种白菜的基因组DNA为模板，以Br-or-HF和Br-or-HR为引物进行PCR扩增。
[0062]四、对PCR扩增产物进行测序，用DNAMAN软件比对两种PCR产物的序列差异，根据差异序列的两端设计如下引物:
[0063]Br-or-1ndelF:5，-TTGCTCTCGTAAAGACTCTCCCT-3，；(SEQ ID N0.3)
[0064]Br-or-1ndelR:5’ -ATCTCACGACCAACTGCCTTCA-3，。(SEQ ID N0.4)
[0065]五、分别以步骤二得到的两种白菜的基因组DNA为模板，以Br-or-1ndelF和Br-or-1ndelR为引物进行PCR扩增。
[0066]六、以父本白心大白菜91-112的基因组DNA为模板扩增得到的DNA片段长度为261bp，该片段的序列如SEQ ID N0.5所示。以母本橘红心大白菜T12-9的基因组DNA为模板扩增得到的DNA片段长度 为286bp，该片段的序列如SEQ ID N0.6所示。将此种具有差异的标记命名为Br-or-lndel。
[0067]以上PCR反应体系均为:
[0068]2.0 u LlOXPCR Buffer (Mg2+)、0.8 u L dNTPs (每种 2.5mM)、1.0 u L 各引物(10 u mol/L)、0.2 u L Taq DNA polymerase (5U/ u L)> 1.0 u L 模板 DNA (共 200ng)、14u LddH2O0
[0069]以上PCR程序均为:
[0070]94°C 5min ；94°C 30s,55°C 30s, 72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin0
[0071]实施例2、BC1分离群体的Br-or-lndel分析
[0072]一、BC1群体的构建和表型鉴定
[0073]以白心大白菜91-112作为父本，橘红心大白菜T12-9作为母本，杂交产生的F1代(白心)作为父本，与橘红心大白菜T12-9回交产生回交一代，即为BC1分离群体。对BC1分离群体进行橘红心和白心表型鉴定，卡方分析法验证，结果表明表型(大白菜菜心颜色)的分离符合孟德尔1:1分离规律。
[0074]二、采用CTAB法提取亲本(即白心大白菜91-112、橘红心大白菜T12-9和以白心大白菜91-112作为父本，橘红心大白菜T12-9作为母本杂交产生的F1代大白菜)及BC1分离群体成熟植株叶片的基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行检测。
[0075]BC1分离群体的16株白菜叶片的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
[0076]图1中，M为Marker ;1_16为BC1分离群体的16株白菜的叶片的基因组DNA。
[0077]三、亲本的Br-or-lndel分子标记分析
[0078]白心大白菜91-112、橘红心大白菜T12-9和以白心大白菜91-112作为父本、橘红心大白菜T12-9作为母本杂交产生的F1代的大白菜菜心颜色分别为白色、橘红色和白色。
[0079](一)分别以步骤二得到的白心大白菜91-112、橘红心大白菜T12-9和以白心大白菜91-112作为父本，橘红心大白菜T12-9作为母本，杂交产生的F1代成熟植株叶片的基因组DNA为模板，以fc-or-1ndelF和fc-or-1ndelR为引物进行PCR扩增。
[0080]PCR反应体系为:
[0081]2.0 u LlO XPCR Buffer(Mg2+)>0.8 u L dNTPs(每种 2.5mM)、1.0 u L 各引物(10u mol/L)、0.2 u L Taq DNA polymerase (5U/ u L)> 1.0 u L 模板 DNA、14 u LddH2O0
[0082]PCR 程序为:
[0083]94°C 5min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin0
[0084]将PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
[0085]图2中，I为纯合白心大白菜(白心大白菜91-112);2为纯合橘红心大白菜(橘红心大白菜T12-9) ;3为杂合白心大白菜(以白心大白菜91-112作为父本，橘红心大白菜T12-9作为母本，杂交产生的F1代)；M为Marker。
[0086]图2表明，纯合白心大白菜仅能扩增出261bp的条带，纯合橘红心大白菜仅能扩增出286bp的条带,杂合白心大白菜能扩增出261bp和286bp的条带。 [0087](二)BC1分离群体的Br-or-lndel分子标记分析
[0088]BC1分离群体经过橘红心和白心表型鉴定，卡方分析法验证，结果表明表型(大白菜菜心颜色)的分离符合孟德尔1:1分离规律。
[0089]以BC1分离群体成熟植株叶片的基因组DNA为模板，以Br-or-1ndelF和Br-or-1ndelR为引物,按照步骤(一)的方法进行BC1分离群体的Br-or-1ndel分子标记分析。
[0090]经过连锁分析发现，Br-or-lndel分子标记在BC1分离群体中的1320株大白菜中与大白菜橘红心or基因共分离。
[0091]部分结果如图3所示。
[0092]图3中，1，2，5,6,8, 11，12，15，16为BC1分离群体中的白心大白菜杂合单株；3，4，7，9，10，13，14为BC1分离群体中的橘红心大白菜纯合单株;M为Marker。
[0093]图3表明，BC1分离群体中的杂合白心大白菜1，2，5，6，8，11，12，15，16可以扩增出261bp和286bp的条带，而BC1分离群体中的纯合橘红心大白菜3，4，7，9，10，13，14只能扩增出286bp的条带。
【权利要求】
1.一对引物，该对引物由(I)和(2)所示的两条引物组成: (1)Br-or-1ndelF,该引物的序列如SEQ ID N0.3所示; (2)Br-or-1ndelR,该引物的序列如SEQ ID N0.4所示。
2.—种DNA分子，该分子的序列如SEQ ID N0.5所示。
3.一种DNA分子,该分子的序列如SEQ ID N0.6所不。
4.一种辅助鉴定待测大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜的试剂盒，该试剂盒由权利要求1所述的两条引物、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和ddH20组成； 所述试剂盒中包括使用说明书，使用说明书中记载如下内容:以待测大白菜的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的两条引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物为长度为261bp的DNA分子，则待测大白菜为纯合白心大白菜；如果PCR扩增产物为长度为286bp的DNA分子，则待测大白菜为纯合橘红心大白菜；如果PCR扩增产物为长度为261bp的DNA分子和长度为286bp的DNA分子，则待测大白菜为杂合白心大白菜。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:所述待测大白菜的基因组DNA为待测大白菜的叶片的基因组DNA ； 所述261bp的DNA分子为权利要求2所述的DNA分子； 所述2 86bp的DNA分子为权利要求3所述的DNA分子； 所述纯合白心大白菜具体为白心大白菜91-112 ； 所述纯合橘红心大白菜具体为橘红心大白菜T12-9 ； 所述杂合白心大白菜具体为白心大白菜91-112与橘红心大白菜T12-9的杂交F1代。
6.一种辅助检测大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜的方法，该方法是利用权利要求1所述的两条引物和/或权利要求4或5所述的试剂盒进行的，包括如下步骤: (1)提取待测大白采的基因组DNA； (2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的两条引物为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物； (3)如果步骤(2)得到的PCR产物为261bp的DNA分子，则待测大白菜为纯合白心大白菜；如果PCR产物为286bp的DNA分子，则待测大白菜为纯合橘红心大白菜；如果PCR产物为261bp的DNA分子和286bp的DNA分子，则待测大白菜为杂合白心大白菜。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述待测大白菜的基因组DNA为待测大白菜的叶片的基因组DNA ； 所述261bp的DNA分子为权利要求2所述的DNA分子； 所述286bp的DNA分子为权利要求3所述的DNA分子； 所述纯合白心大白菜具体为白心大白菜91-112 ； 所述纯合橘红心大白菜具体为橘红心大白菜T12-9 ； 所述杂合白心大白菜具体为白心大白菜91-112与橘红心大白菜T12-9的杂交F1代。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述PCR的体系如下: ·2.0 u L PCR扩增缓冲液、0.8 u L dNTPs (每种2.5mM)、浓度均为10 u mol/L的权利要求I所述的两条引物各1.0 u L、浓度为5U/ u L的DNA聚合酶0.2 u L、所述模板1.0u L (200ng/ u L)和 14 u LddH2O ； 所述PCR扩增缓冲液的商品名称为10XPCR Buffer，购自TaKaRa公司，产品目录号为9151A ； 所述dNTPs购自TaKaRa公司，产品目录号为D4030A ； 所述DNA聚合酶的商品名称为Taq DNA polymerase,购自TaKaRa公司，产品目录号为ROOl ； 所述PCR的程序如下:
94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin0
9.权利要求1所述的引物在辅助鉴定大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜中的应用； 和/或， 权利要求2和3所述的DNA分 子在辅助鉴定大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜中的应用； 和/或， 权利要求4或5所述的试剂盒在辅助鉴定大白菜是纯合白心大白菜、纯合橘红心大白菜还是杂合白心大白菜中的应用； 所述纯合白心大白菜具体为白心大白菜91-112 ； 所述纯合橘红心大白菜具体为橘红心大白菜T12-9 ； 所述杂合白心大白菜具体为白心大白菜91-112与橘红心大白菜T12-9的杂交F1代。
10.权利要求1所述的引物、权利要求2和3所述的DNA分子或权利要求4或5所述的试剂盒在选育橘红心大白菜中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103540590SQ201310551618
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】王姣, 于拴仓, 张凤兰, 余阳俊, 张德双, 赵岫云, 卢桂香, 苏同兵, 汪维红 申请人:北京市农林科学院