一种重组胰蛋白酶纯化方法
【专利摘要】发明涉及生物【技术领域】，提供了一种重组胰蛋白酶的纯化方法，该方法首先对酵母发酵生产的重组胰蛋白酶原进行活化，然后采用大孔吸附树脂和阳离子交换层析纯化得到纯的胰蛋白酶，避免了直接从酵母发酵液中纯化胰蛋白酶原时需对发酵液进行稀释或超滤的过程，且不必单独对酶原进行酶切前处理，节省纯化步骤，操作简单，产量较高；另外，本发明采用的层析填料价格便宜，适合大规模生产。实验表明，本发明提供的重组胰蛋白酶纯度和活性皆较高，可作为工业生产原料。
【专利说明】一种重组胰蛋白酶纯化方法
[0001]本申请要求于2012年11月12日提交中国专利局、申请号为201210450131.0、发明名称为“一种重组胰蛋白酶纯化方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种重组胰蛋白酶的纯化方法。
【背景技术】
[0003]胰蛋白酶(Trypsin, EC3.4.21.4)属于丝氨酸蛋白酶,可特异性地切割碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸的羧基端肽键。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。其前体胰蛋白酶原在胰脏中合成并作为胰液的成分分泌，经肠激酶或胰蛋白酶的激活，成为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶还可以限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶。胰蛋白酶的主要商业用途是作为工业用酶用于重组人胰岛素的工业生产。
[0004]最初，胰蛋白酶的生产是由猪、牛、羊等动物的胰脏中直接提取，在提取时，首先对胰脏中胰蛋白酶原进行活化，然后利用70%乙醇沉淀胰蛋白酶提取粗酶。但是，采用70%乙醇沉淀不仅会浪费大量有机溶剂，且提取效率较低；另外，从胰脏直接提取得到的胰蛋白酶中往往混合有其他酶类，造成特异性的下降，因而自上世纪80年代以来，从不同生物中重组生产胰蛋白酶的方法被广泛的应用。
[0005]早期，人们采用大肠杆菌作为重组胰蛋白酶的表达载体，例如，国际专利W099/10503中就采用了这种方法，然而，由于原核生物外源基因的高表达特性，造成了包涵体的产生，从而使该产物的纯化过程中需加入变性和复性过程，增加了纯化的复杂性，不适合大规模工业化生产。
[0006]随后，在欧洲专利EP1399568B1提供的方法中，真核生物毕赤酵母作为表达载体的使用有效避免了包涵体的产生，该方法通过阳离子交换树脂对发酵液进行纯化得到胰蛋白酶原，然后调节PH值对酶原进行活化。但是毕赤酵母发酵液上清电导率较高，一般为15ms/cm~30ms/cm,而离子交换层析填料通常只有在料液电导率<5ms/cm条件下才能进行捕获。因此毕赤酵母发酵液需要进行稀释或超滤后才能使用阳离子交换树脂捕获酶原，但采用超滤的方法并不适合大规模生产，而纯化前的稀释过程会在进行大规模生产时造成极大的水资源浪费，而且稀释后体积增大，导致纯化时间的延长。
[0007]Macouzet M等人在重组胰蛋白酶原的C端融合了一段组氨酸标签，并通过对组氨酸标签的识别对重组胰蛋白酶原进行纯化，简化了纯化过程，且可避免在纯化过程中对发酵液进行稀释或超滤，但引入的组氨酸标签无法彻底去除，残留的组氨酸标签易对后期工业应用产生影响。
【发明内容】
[0008]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种重组胰蛋白酶纯化方法，本发明提供的方法产量高，所生产的胰蛋白酶主要用于工业用途，该方法操作简便，且简化了纯化步骤，适合大规模生产。
[0009]本发明提供了一种重组胰蛋白酶的纯化方法，该方法包括以下步骤:
[0010]步骤1:获得含有重组胰蛋白酶原的发酵液；
[0011]步骤2:取含有重组胰蛋白酶原的发酵液，分离得到上清液，活化，获得含有重组胰蛋白酶的溶液；
[0012]步骤3:取含有重组胰蛋白酶的溶液，经纯化、干燥，即得。
[0013]作为优选，对胰蛋白酶原的活化具体为:取上清液，加入CaCl2并调节pH至7.0~
8.5，室温下活化8小时~24小时。或在上清液中加入胰酶和/或肠激酶进行活化。本发明选择不加入胰酶和/或肠激酶进行活化。
[0014]优选地，CaCl2在重组胰蛋白酶的溶液中的终浓度为10mmol/L~100mmol/L。
[0015]本发明首先对发酵液进行分离和活化处理，不需要从发酵液中纯化重组胰蛋白酶原时需对发酵液进行稀释或超滤，也避免了先从发酵液中纯化胰蛋白酶原再活化胰酶后再次纯化的过程，简化了纯化步骤。
[0016]优选地，对含有重组胰蛋白酶的溶液的纯化包括大孔吸附树脂层析和阳离子交换层析的步骤。
[0017]优选地，大孔吸附树脂层析采用的的填料为Rohmhaas XAD4、Rohmhaas XAD1180、Rohmhaas XADI6 或 Rohmhaas XAD7HP。
[0018]优选地，大孔吸附树脂层析采用的洗脱液为乙醇、乙酸和水的混合液。
[0019]优选地，大孔吸附树脂层析洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:0.7~1.2的体积比混合，即得。
[0020]优选地，阳离子交换层析采用的填料为:GE SP-sepharose ff、GE SP-sepharoseHP、GE SP-sepharose XL、GE SP-sephadex C-25、GE SP-sephadex C-50、tosoh SP550、Bio-Rad UNOsphere s、Bio-Rad rapid s 或Bio-Rad high s。
[0021]优选地，阳离子交换层析采用的洗脱液为乙酸和NaCl的水溶液。
[0022]优选地，阳离子交换层析洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，分别以1:0.8~1.2的体积比混合，即得。
[0023]优选地，重组胰蛋白酶的纯化方法中的步骤I具体为:
[0024]步骤a:获得的编码胰蛋白酶原基因；
[0025]步骤b:取编码胰蛋白酶原基因，构建重组质粒；
[0026]步骤c:取重组质粒，构建重组毕赤酵母菌株；
[0027]步骤d:取重组毕赤酵母菌株，对重组胰蛋白酶原诱导表达，获得所述含有重组胰蛋白酶原的酵母发酵液。
[0028]与现有技术相比，本发明提供的纯化方法首先对酵母发酵生产的重组胰蛋白酶原进行活化处理后采用大孔吸附树脂和阳离子交换层析进行纯化得到纯的胰蛋白酶。避免了直接从酵母发酵液中纯化胰蛋白酶原时需对发酵液进行稀释或超滤的过程，且不必单独对酶原进行酶切前处理，节省了纯化步骤，操作简单，且产量较高；另外，本发明采用的层析填料价格便宜，适合大规模生产。检测结果表明，本发明提供的重组胰蛋白酶纯度和活性皆较高，可满足作为工业生产原料的需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1所示为本发明实施例5提供的重组胰蛋白酶的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为蛋白质低分子量Marker ;泳道I为重组胰蛋白酶标品，泳道2为本发明实施例5提供的
重组胰蛋白酶。
【具体实施方式】[0030]本发明提供了一种重组胰蛋白酶的纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0031]本发明提供了一种重组胰蛋白酶的纯化方法，该方法包括以下步骤:首先，获得含有重组胰蛋白酶原的发酵液；然后，取含有重组胰蛋白酶原的发酵液，分离得到上清液，活化，获得含有重组胰蛋白酶的溶液；然后，取含有重组胰蛋白酶的溶液，经纯化、干燥，即得。
[0032]其中，对胰蛋白酶原的活化具体为:取上清液，加入CaCl2并调节pH至7.0~8.5，室温下活化8小时~24小时。
[0033]获得上清液的方式为微滤、离心或过滤。
[0034]为提高活化效果，CaCl2在重组胰蛋白酶的溶液中的终浓度为10mmol/L~100mmol/Lo
[0035]为进一步提高活化效果，可在上清液中加入胰酶和/或肠激酶。
[0036]本发明首先对发酵液进行分离和活化处理，不需要从发酵液中纯化重组胰蛋白酶原时需对发酵液进行稀释或超滤，也避免了先从发酵液中纯化胰蛋白酶原再活化胰酶后再次纯化的过程，简化了纯化步骤。
[0037]为了在提高纯度的同时简化操作步骤，本发明提供的纯化方法中对含有重组胰蛋白酶的溶液的纯化包括大孔吸附树脂层析和阳离子交换层析的步骤。
[0038]具体地，大孔吸附树脂层析的步骤为:首先，取含有重组胰蛋白酶的溶液上样至大孔吸附树脂柱；然后，用Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线；然后，用乙醇、乙酸和水的混合液对大孔吸附树脂柱进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液。
[0039]为达到更好的纯化效果，大孔吸附树脂层析采用的的填料为Rohmhaas XAD4、Rohmhaas XAD1180、Rohmhaas XAD16 或 Rohmhaas XAD7HP。
[0040]其中，大孔吸附树脂层析采用的洗脱液为乙醇、乙酸和水的混合液。
[0041]大孔吸附树脂层析洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为15%的乙醇水溶液和体积分数为20%的乙酸水溶液，以1:0.7~1.2的体积比混合，即得。
[0042]另外，阳离子交换层析的具体步骤为:首先，取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱；然后，用乙酸水溶液冲洗阳离子交换层析树脂柱至基线；然后，用乙酸和NaCl的水溶液进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液。
[0043]阳离子交换层析采用的填料为:GESP-sepharose ff、GE SP-sepharose HP、GESP-sepharose XL、GE SP-sephadex C-25、GE SP-sephadex C-50、tosoh SP550、Bio-RadUNOsphere s、Bio-Rad rapid s 或Bio-Rad high s。
[0044]其中，阳离子交换层析采用的洗脱液为乙酸和NaCl的水溶液。
[0045]阳离子交换层析洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1:0.8~1.2的体积比混合，即得。
[0046]含有重组胰蛋白酶原的发酵液的获得方式为:首先，获得的编码胰蛋白酶原基因；然后，取编码胰蛋白酶原基因，构建重组质粒；然后，取重组质粒，构建重组毕赤酵母菌株；然后，取重组毕赤酵母菌株，对重组胰蛋白酶原诱导表达，获得含有重组胰蛋白酶原的酵母发酵液。
[0047]含有重组胰蛋白酶原的发酵液的获得方式具体为:首先，采用衔接PCR的方式合成的来自人、猪或牛的编码胰蛋白酶原基因；然后，将该基因连接入PPIC9K质粒载体，构建成重组质粒；然后，将该重组质粒转化入毕赤酵母感受态细胞，构建成重组毕赤酵母菌株；然后，取阳性重组毕赤酵母菌株，采用BMMY液体培养基进行大量培养，并采用甲醇作为诱导剂诱导重组胰蛋白酶原的表达，获得含有重组胰蛋白酶原的酵母发酵液。
[0048]本发明提供的纯化方法首先对酵母发酵生产的重组胰蛋白酶原进行活化处理后采用大孔吸附树脂和阳离子交换层析进行纯化，对纯化过程进行了简化，且可保证较高的产量；另外，本发明采用的层析填料价格便宜，适合大规模生产。所得产品适合工业化生产的使用。
[0049]本发明所采用的溶剂和试剂为普通市售品，皆可由市场购得。
[0050]实施例1含有重组胰蛋白酶原的发酵液的制备
[0051]通过衔接PCR合成编码猪胰蛋白酶原基因的核苷酸序列，将PCR片断用Xho I和EcoR I进行双酶切，插入表达载体pPIC9K质粒，构建重组质粒pPIC9K-trypsin。在该重组质粒中，目的基因表达是在AOXl启动子控制下进行的，目的基因前有α信号肽，可以使重组表达的胰蛋白酶原分泌到培养基中。
[0052]将构建好的重组质粒用Sac I酶切后，采用电转化的方式将重组质粒转化入感受态的酵母细胞中，构建重组菌株。将构建好的重组菌株接种于含有G418的YPD固体培养基上，进行阳性菌株筛选，筛选得到的阳性菌株用于胰蛋白酶原表达。
[0053]挑取阳性菌株，接种至IOml液体YH)培养基中，29°C~30°C，250r/min培养过夜。按1:100的比例将过夜培养的菌液接种至100ml的BMGY液体培养基，于29°C~30°C，250r/min培养，并用分光光度计监测OD6c?值。当0D_值达到2~6之间时停止培养。室温下，1500g离心5min收集菌体，然后用100ml pH为3~5的BMMY液体培养基重悬细胞，然后置于体积为IL摇瓶中，29°C、250r/min用甲醇诱导重组胰蛋白酶原的表达。之后每隔24h补加500 μ I的甲醇，诱导培养96小时后停止诱导，取发酵液并进行分析。
[0054]实施例2重组胰蛋白酶原的活化
[0055]取本发明实施例1提供 的发酵液进行微滤并取上清液，在上清液中加入CaCl2至其终浓度为lOmmol/L，并调节发酵液pH至7.0，室温下，低速搅拌活化24小时，获得含有重组胰蛋白酶的溶液。
[0056]实施例3重组胰蛋白酶原的活化
[0057]取本发明实施例1提供的发酵液进行微滤并取上清液，在上清液中加入CaCl2至其终浓度为50mmol/L，并调节发酵液pH至8.0,室温下，低速搅拌活化8小时，获得含有重组胰蛋白酶的溶液。
[0058]实施例4重组胰蛋白酶原的活化
[0059]取本发明实施例1提供的发酵液进行微滤并取上清液，在上清液中加入CaCl2至其终浓度为lOOmmol/L，并调节发酵液pH至8.5，室温下，低速搅拌活化6小时，获得含有重组胰蛋白酶的溶液。
[0060]实施例5重组胰蛋白酶的纯化
[0061]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填料采用Rohmhaas XAD4，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用pH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率91.5%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:0.7的体积比混合。
[0062]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用GESP-sepharose ff，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率92.9%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1:0.8的体积比混合。
[0063]实施例6重组胰蛋白酶的纯化
[0064]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填 料采用Rohmhaas XAD1180，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用PH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率90.5%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:1的体积比混合。
[0065]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用SP-1^pharoseHP，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率94.5%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1:0.9的体积比混合。
[0066]实施例7重组胰蛋白酶的纯化
[0067]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填料采用Rohmhaas XAD16，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用pH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率88.6%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1: 1.2的体积比混合。
[0068]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用SP-1^pharoseXL，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率90.4%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1: 1.2的体积比混合。
[0069]实施例8重组胰蛋白酶的纯化
[0070]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填料采用Rohmhaas XAD7HP，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用pH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率90.7%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:1的体积比混合。
[0071]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用SPsephadexC-25，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率91.1%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1:0.9的体积比混合。
[0072]实施例9重组胰蛋白酶的纯化
[0073]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填料采用Rohmhaas XAD7HP，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用pH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率90.3%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:1的体积比混合。
[0074]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用SPsephadexC-50，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率90.7%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1:1的体积比混合。
[0075]实施例10重组胰蛋白酶的纯化
[0076]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填料采用Rohmh aas XAD16，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用pH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率90.0%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1: 1.1的体积比混合。
[0077]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用toSohSP550，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率93.0%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1:0.9的体积比混合。
[0078]实施例11重组胰蛋白酶的纯化
[0079]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填料采用Rohmhaas XAD1180，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用PH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率89.6%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:1的体积比混合。
[0080]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用Bio-RadUNOsphere S，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率92.3%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，分别以1:0.9的体积比混合。
[0081]实施例12重组胰蛋白酶的纯化
[0082]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填料采用Rohmhaas XAD1180，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用PH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率89.0%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:1的体积比混合。
[0083]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用Bio-Radrapid s，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率92.0%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1:0.9的体积比混合。
[0084]实施例13重组胰蛋白酶的纯化
[0085]取本发明实施例2~4提供的含有重组胰蛋白酶的溶液进行过滤，然后上样至大孔吸附树脂柱，填料采用Rohmhaas XAD1180，上样流速不大于300cm/h，上样结束后用PH8.0的20mmol/L的Tris-HCl水溶液冲洗大孔吸附树脂柱至基线，然后，用洗脱液进行洗脱，获得重组胰蛋白酶粗品溶液，层析回收率88.5%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为10%的乙酸水溶液和体积分数为90%的乙醇水溶液，以1:1的体积比混合。
[0086]取重组胰蛋白酶粗品溶液上样至阳离子交换层析树脂柱，填料采用Bio-Rad highs，用体积分数为2%的乙酸水溶液冲洗至基线后，进行梯度洗脱，获得重组胰蛋白酶溶液，层析回收率91.5%。其中，洗脱液的配制方法为:分别取体积分数为4%的乙酸水溶液和摩尔浓度为lmol/L的NaCl溶液，以1:0.8的体积比混合。
[0087]实施例14本发明提供的重组胰蛋白酶纯度检测
[0088]对本发明实施例5~13提供的重组胰蛋白酶纯度进行检测，检测采用SDS-PAGE电泳，其中，实施例5提供的重组胰蛋白酶电泳结果如图1所示，其中，泳道M为蛋白质低分子量Marker ;泳道I为重组胰蛋白酶标品，泳道2为本发明实施例5提供的重组胰蛋白酶。实施例6至13提供的重组胰蛋白酶的电泳结果与上述结果一致。
[0089]结果显示，本发明实施例5~13提供的重组胰蛋白酶条带大小与标品一致，符合预期值，条带清晰，明亮，泳道中没有出现其他条带，表明了以本发明实施例提供的方法制备的重组胰蛋白酶纯度良好。
[0090]实施例15本发明提供的重组胰蛋白酶活性检测
[0091]对本发明实施例5~13提供的重组胰蛋白酶活性进行检测，同时取市售重组胰蛋白酶纯品进行酶活性检测，将结果作为对照。
[0092]检测通过使重组胰蛋白酶与苯甲酰L-精氨酸乙酯(benzoyl L-arginineethylester, BAEE)进行反应，在紫外分光光度计上测量OD253值随时间的增加量并进行计算 ο
[0093]结果表明，重组胰蛋白酶的活性为12000BAEEU/(mg pro)，市售重组胰蛋白酶纯品的活性为7500BAEEU/(mg pro)，证明以本发明提供的方法纯化的重组胰蛋白酶具有较高的活性。
[0094]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种重组胰蛋白酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1:获得含有重组胰蛋白酶原的发酵液； 步骤2:取所述含有重组胰蛋白酶原的发酵液，分离得到上清液，活化，获得含有重组胰蛋白酶的溶液； 步骤3:取所述含有重组胰蛋白酶的溶液，经纯化、干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述活化具体为:取所述上清液，加入CaCl2并调节pH至7.0~8.5，室温下活化8小时~24小时。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CaCl2在所述重组胰蛋白酶的溶液中的终浓度为 10mmol /I,~100mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述纯化包括大孔吸附树脂层析和阳离子交换层析的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂层析采用的的填料为Rohmhaas XAD4、Rohmhaas XADII80、Rohmhaas XAD16 或 Rohmhaas XAD7HP。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂层析采用的洗脱液为乙醇、乙酸和水的混合液。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析采用的填料为:GESP-sepharose ff>GE SP-sepharose HP、GE SP-sepharose XL、GE SP-sephadex C-25、GESP-sephadex C_50、tosoh SP550、Bio_Rad UNOsphere s、Bio_Rad rapid s或Bio-Rad highSo
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析采用的洗脱液为乙酸和NaCl的水溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤I具体为: 步骤a:获得的编码胰蛋白酶原基因； 步骤b:取所述编码胰蛋白酶原基因，构建重组质粒； 步骤c:取所述重组质粒，构建重组毕赤酵母菌株； 步骤d:取所述重组毕赤酵母菌株，对重组胰蛋白酶原诱导表达，获得所述含有重组胰蛋白酶原的酵母发酵液。
【文档编号】C12N9/76GK103805584SQ201310557286
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2012年11月12日
【发明者】高相雷, 陈小锋, 李利佳, 林树珊, 张鸿, 徐军 申请人:宜昌长江药业有限公司