制备鼠李糖脂发酵液的方法
【专利摘要】本发明属于微生物制剂的制备，特别是指制备鼠李糖脂发酵液的方法。将扩培后含有铜绿假单胞菌CGMCC?NO.8377（Pscudomonas?acruginosa）的种子液按照质量百分比为8%-10%的接种量接入到灭菌后的发酵罐培养基中，发酵培养基中含有碳源、必要的氮源及营养物质，调节发酵培养基的pH值进行通气发酵，在发酵过程中向发酵培养基中补入碳源、营养物质、增稠剂，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液。本发明解决了现有技术存在的生产成本高、产品得率低等问题，具有产品得率高、菌种代谢正常、生产成本低、工艺易于实现等特点。
【专利说明】制备鼠李糖脂发酵液的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物制剂的制备，特别是指制备鼠李糖脂发酵液的方法。
【背景技术】
[0002]鼠李糖脂是一种新型生物表面活性剂，具有乳化、增溶和降低界面张力等功能，且低毒、易生物降解，在石油化工、生物医药、食品卫生及环境保护等领域有良好应用前景。通常的生产方法是利用铜绿假单胞菌以葡萄糖、蓖麻油等不同碳源为基础原料合成鼠李糖月旨。上述现有技术存在的问题是以葡萄糖、蓖麻油等基础原料生产鼠李糖脂成本较高；同时由于工艺设计的不合理，存在着产品得率低(发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为55 g /L)，发酵过程中由于鼠李糖脂的产生发酵液中的泡沫增多，使发酵过程中通风量量小，导致菌种由于供氧量的不足，影响发酵过程中的菌种代谢速度等。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供产品得率高、生产成本低的制备鼠李糖脂发酵液的方法。
[0004]本发明的整体技术构思是:
[0005]制备鼠李糖脂发酵液的方法，包括如下工艺步骤:
[0006]A、将扩培后含有铜绿假单胞菌 CGMCC N0.8377 (Pscudomonas aeruginosa)的种子液按照质量百分比为8%-10%的接种量接入到灭菌后的发酵罐培养基中，发酵培养基中含有碳源、必要的氮源及营养物质，调节发酵培养基的pH值；
[0007]B、进行通气发酵；
`[0008]C、在发酵过程中向发酵培养基中补入碳源、营养物质、增稠剂，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液。
[0009]本发明中用于生产鼠李糖脂发酵液的菌种铜绿假单胞菌(Pscudomonasaeruginosa)已于2013年10月23日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC N0.8377，该保藏单位位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0010]本发明的具体技术内容还有:
[0011]所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成:
[0012]玉米油1%-2% ;废糖蜜1%_2% ;硫酸铵0.2%-0.3% ;黄原胶或温轮胶0.1%_0.15% ;磷酸氢二钠0.2%-0.3% ;磷酸二氢钾0.1%-0.2% ;余量为无菌水；发酵培养基的pH=7.0-7.2。
[0013]所述的步骤C中的发酵条件为:
[0014]6-8小时:补料玉米油0.5%-1%，黄原胶或温轮胶0.05%-0.08%,风量0.4-0.6vvm ；
[0015]14-16 小时:补入玉米油 0.5%-1.0%,硝酸铵 0.1%-0.2%,风量 0.4-0.6vvm ；
[0016]28-30小时:补入玉米油2%-3%，黄原胶或温轮胶0.02%_0.05%,风量0.4-0.6vvm ；
[0017]36-40 小时:补入玉米油 0.5-1%,风量 0.4-0.6vvm ；
[0018]41 小时-放罐:风量 0.6-0.7vvm ；[0019]所补入的物料为质量百分数。
[0020]为便于工业化生产的需要，优选且较为常见的技术方案是，所述的步骤A中扩培过程包括:
[0021]A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
[0022]A2、将摇瓶种子制成一级种子；
[0023]A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐培养基进行发酵。
[0024]所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为35°C -39°C、转速为200-250转/分钟、培养周期为20-25小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种:种子液的质量比=1:200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成:
[0025]葡萄糖1_2%，蛋白胨0.2-0.4%，酵母膏0.2-0.3%，琼脂2-2.5%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2;
[0026]摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成:
[0027]葡萄糖1-2%，硝酸钠0.4-0.7%,酵母膏0.1-0.3%,胰蛋白胨0.15-0.3%,余量为无菌水，pH=7.0-7.3。
[0028]所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为35 V -39 V >通风量0.2vvm-0.35vvm、培养周期为24-26小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成:
[0029]葡萄糖1_2%，磷酸氢二胺0.7-0.9%，硫酸铵0.1-0.2%，大豆分离蛋白0.1-0.3%，酵母膏0.01-0.02%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
[0030]所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%_10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为350C _39°C、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期为10-15小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成:
[0031]玉米油1-2%，废糖蜜1-2%，硝酸铵0.6-0.8%，硫酸铵0.2-0.3%，黄原胶或温轮胶0.05-0.1%，酵母膏 0.01-0.02%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
[0032]所述的废糖蜜中蔗糖的质量百分含量不低于45%。
[0033]所述的温轮胶为河北鑫合生物化工有限公司生产。
[0034]本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于:
[0035]1、本发明以铜绿假单胞菌CGMCC N0.8377作为原始菌种，采用玉米油及废糖蜜作为二级扩大培养及发酵的主要碳源，有效利用了工业废料，降低了生产成本，发酵过程中菌种代谢正常，生产工艺合理易于实现，产品得率高(发酵结束发酵液中鼠李糖脂的浓度为65-70 g / L)。
[0036]2、在发酵过程中补料加入增稠剂黄原胶、温轮胶或玉米油，可有效提高对于发酵液的粘度控制，稳定控制发酵过程中泡沫的产生。
[0037]鼠李糖脂评价方法(参照《微生物学通报》2006年33 (4)鼠李糖脂快速定量分析方法及其影响因素研究)
[0038]鼠李糖脂的测定——蒽酮比色法[0039]一、仪器、试剂和材料
[0040]1、仪器:电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等
[0041]2、试剂:
[0042]( I)鼠李糖标准液:100 ii g/ml ；
[0043](2)浓硫酸；
[0044](3)蒽酮试剂:0.2g蒽酮溶于100ml浓H2SO4中。当日配制使用。
[0045]3、材料:铜绿假单胞菌WJ-1的发酵液；
[0046]二、操作步骤
[0047]1、鼠李糖标准曲线的制作
[0048]取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的鼠李糖溶液:
[0049]
【权利要求】
1.制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于包括如下工艺步骤: A、将扩培后含有铜绿假单胞菌CGMCCN0.8377 (Pscudomonas aeruginosa)的种子液按照质量百分比为8%-10%的接种量接入到灭菌后的发酵罐培养基中，发酵培养基中含有碳源、必要的氮源及营养物质，调节发酵培养基的pH值； B、进行通气发酵； C、在发酵过程中向发酵培养基中补入碳源、营养物质、增稠剂，经通气发酵得到含有鼠李糖脂的发酵液。
2.根据权利要求1所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A中的发酵培养基由下列质量百分数的组分组成: 玉米油1%_2% ;废糖蜜1%_2% ;硫酸铵0.2%-0.3% ;黄原胶或温轮胶0.1%-0.15% ;磷酸氢二钠0.2%-0.3% ;磷酸二氢钾0.1%-0.2% ;余量为无菌水；发酵培养基的pH=7.0-7.2。
3.根据权利要求2所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤C中的发酵条件为: 6-8小时:补料玉米油0.5%-1%，黄原胶或温轮胶0.05%-0.08%，风量0.4-0.6vvm ； 14-16 小时:补入玉米油 0.5%-1.0%，硝酸铵 0.1%-0.2%，风量 0.4-0.6vvm ； 28-30小时:补入玉米油2%-3%，黄原胶或温轮胶0.02%-0.05%，风量0.4-0.6vvm ； 36-40小时:补入玉米油0.5-1%，风量0.4-0.6vvm ； 41小时-放罐:风量0.6-0.7vvm ； 所补入的物料为质量百分数。
4.根据权利要求1所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A中扩培过程包括: A1、将斜面菌种制成摇瓶种子； A2、将摇瓶种子制成一级种子； A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐培养基进行发酵。
5.根据权利要求4所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A1是将斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养基中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为35°C -39°C、转速为200-250转/分钟、培养周期为20-25小时的条件下振荡培养，接种量为斜面菌种:种子液的质量比=1:200，斜面菌种培养基采用如下单位质量百分数的组分组成: 葡萄糖1-2%，蛋白胨0.2-0.4%，酵母膏0.2-0.3%，琼脂2-2.5%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2; 摇瓶培养基采用如下单位质量百分数的组分组成: 葡萄糖1_2%，硝酸钠0.4-0.7%,酵母膏0.1-0.3%,胰蛋白胨0.15-0.3%,余量为无菌水，pH=7.0-7.3。
6.根据权利要求4所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A2是将摇瓶种子按照质量百分比为1%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为`35°C -39°C、通风量0.2vvm-0.35vvm、培养周期为24-26小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量百分数的组分组成: 葡萄糖1_2%，磷酸氢二胺0.7-0.9%，硫酸铵0.1-0.2%，大豆分离蛋白0.1-0.3%，酵母膏·0.01-0.02%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
7.根据权利要求4所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为35°C -39°C、通风量0.4vvm-0.6vvm、培养周期为10-15小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量百分数的组分组成: 玉米油1-2%，废糖蜜1-2%，硝酸铵0.6-0.8%，硫酸铵0.2-0.3%，黄原胶或温轮胶0.05-0.1%，酵母膏 0.01-0.02%，余量为无菌水，pH=7.0-7.2。
8.根据权利要求1所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的废糖蜜中蔗糖的质量百分含量不低于45%。
9.根据权利要求1、3或7中任一项所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的温轮胶为河北鑫合生物化工有限公司生产。
10.根据权利要求7所述的制备鼠李糖脂发酵液的方法，其特征在于所述的废糖蜜中蔗糖的质量百分含量不低于45·%。
【文档编号】C12P19/44GK103589765SQ201310559717
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】张禹, 乞峰辉, 张少华, 杨晓民 申请人:河北鑫合生物化工有限公司