昆虫细胞High Five在培养柞蚕核型多角体病毒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种利用昆虫细胞High?Five进行柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)及其重组病毒的增殖培养和克隆筛选。High?Five细胞生长速度较快，贴壁较好，通过High?Five细胞筛选病毒，柞蚕蛹体内扩增病毒，可以较快速的实现重组病毒的筛选，在利用我国丰富的柞蚕蛹资源，开发生物、农业、医药卫生以及相关科研产品等方面有广阔的应用前景，且能够有效提高柞蚕业的产值，增加农民收益。
【专利说明】昆虫细胞H i gh Five在培养柞蚕核型多角体病毒中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，具体涉及利用昆虫细胞High Five进行柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)增殖培养和克隆筛选。
【背景技术】
[0002]我国是世界上柞蚕第一生产大国，柞蚕茧年产量在7万吨左右，生丝及制成品年出口创汇2亿美元。随着市场需求的变化和技术的不断进步，柞蚕的经济价值由过去单一的茧丝经济向茧丝+蚕蛹的经济模式转变。柞蚕以蛹期滞育越冬，可长期保存，并且蛹个体大，可开发成为高效、低廉的生物反应器，从而提高柞蚕蛹的利用价值，这对柞蚕产业的发展有重要意义。在前期的研究中，我们利用昨蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyimultinucleocapsid nucleopolyhedrovirus, ApNPV)建立了作香病毒表达载体系统，并在柞蚕蛹体中成功地表达了绿色荧光蛋白，为柞蚕蛹生物反应器的建立及开发应用奠定了基础。
[0003]利用柞蚕病毒表达载体系统进行基因表达及产品开发，其中一个重要的技术环节是使ApNPV病毒能够感染体外培养的昆虫细胞，并在细胞中增殖。因此，一个对ApNPV敏感的昆虫细胞株(系)对这一系统的应用是必不可少的。我们曾建立了对ApNPV敏感的樗蚕(Philosamia cynthia, Pc)细胞系Pc-Ol,并利用这一细胞系成功地筛选了可表达绿色突光蛋白的重组病毒ApNPV-Λ ph/egfp+。Pc-Ol是目前发表的唯一可以被ApNPV感染的细胞，属于半贴壁细胞，细胞分生速度慢，传代周期长[刘淑珊等，樗蚕蛹(Philosamia cynthia)精巢细胞系的建立。蚕业科学，1999]，影响重组病毒的筛选进程。因此，寻找可贴壁生长、分生速度较快、可被ApNPV感染的细胞是十分必要的，以解决表达系统存在的不足。
[0004]High Five(BT1-TN-5Bl-4)细胞是源自于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的昆虫细胞株(Davis et al.，1992`)，目前已商业化。High Five细胞可用无血清细胞培养基SF-900TM II SFM或完全TNM-FH培养基进行连续传代培养，群体倍增时间18-24小时，细胞可贴壁生长。High Five 可感染 AcNPV (Autographa califomica nuclear polyhedrosisvires, AcNPV)病毒，并形成病毒空斑，主要用于AcNPV表达载体的重组蛋白表达(Growthand Maintenance of Insect Cell Lines, user guide, Cat#B855_02, Invitrogen)。虽然病毒分类上认为AcNPV和ApNPV同属于昆虫杆状病毒，但它们的细胞宿主有很大差别。AcNPV可感染的细胞宿主较多，包括High Five、Sf9和Sf21等昆虫细胞，但并不感染Pc-Ol细胞，也不能感染柞蚕蛹；而ApNPV的细胞宿主专一，仅能够感染Pc-Ol细胞及柞蚕，对Sf9和Sf21细胞均不感染。目前尚没有High Five细胞用于ApNPV感染的相关研究报道。
【发明内容】
[0005]为了解决柞蚕核型多角体病毒表达载体系统存在的不足，本发明首次利用昆虫细胞High Five进行ApNPV的感染、增殖及克隆。High Five细胞生长速度较快，贴壁较好，有利于病毒的筛选。通过High Five细胞筛选病毒，柞蚕蛹体内扩增病毒，可以较快速的实现重组病毒的筛选。
[0006]本发明的一方面在于保护昆虫细胞High Five在培养柞蚕核型多角体病毒中的应用。所述的柞蚕核型多角体病毒不仅限于自然界分离的野毒株，还包括经过基因重组的柞蚕核型多角体病毒。
[0007]对于本发明所述的上述应用，优选的方案是,利用昆虫细胞High Five进行昨蚕核型多角体病毒或其重组病毒的感染、增殖；或利用昆虫细胞High Five筛选柞蚕核型多角体重组病毒。其具体方案如下:
[0008]本发明上文所述的技术方案中，所述的柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒在HighFive细胞中的增殖方法为:
[0009](1)High Five细胞用完全ΤΝΜ---培养基进行传代培养至对数生长期，然后用吸管轻轻吹打，制成约0.5~1XlO6Ail细胞悬液，再转至细胞培养板中，28°C培养1~2小时，使细胞密度占培养板的80%左右；
[0010](2 )将柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒样品，用昆虫无血清细胞培养基SF-900?II SFM,按1:100的体积比稀释，过滤除菌后获得柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒的病毒液；
[0011](3)将步骤(1)制备的High Five细胞中的培养基弃去,加入等体积的步骤(2)制备的柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒的病毒液；静置28°C培养箱中I小时；
[0012](4)将步骤(3)制备的病毒液弃去，加入二倍体积的完全ΤΝΜ---培养基，28°C培养72~96小时。
[0013]利用上述方法，本发明的实施例中的数据表明，柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒(ApNPV-Δ ph/egfp+)在High Five细胞中能够有效增殖，能够在显微镜下观察到被感染细胞中病毒包含体的形成，或在荧光显微镜下观察到被感染细胞中产生的绿色荧光。
[0014]本发明上文所述的技术方案中，所述的柞蚕核型多角体重组病毒在High Five细胞中的筛选方法为:
[0015](a)将有重组病毒和野生病毒混合感染的柞蚕蛹体液，用昆虫无血清细胞培养基SF-900? II SFM按照1:100的体积比稀释，过滤除菌；再将此无菌病毒液10倍梯度稀释，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7不同浓度病毒液；
[0016](b)分别取步骤(a)制备的梯度稀释的病毒液感染High Five细胞，1小时后弃去病毒液，加入等体积的2%的低熔点琼脂糖，待其凝固后，加入等体积的完全TNM-FH培养基，28°C培养4~5天，显微镜下观察病毒发生情况；
[0017](C)取出上层培养液，选最低病毒浓度感染的细胞孔，用玻璃吸管将个别感染有标记的野生病毒的细胞挑出。将其余的细胞悬浮在少量细胞培养基中，振荡离心后取上清，注射感染柞蚕蛹，每头50~lOOul，置22°C，10~12天。使重组病毒得到繁殖扩增，用显微镜观察或PCR检测方法分析筛选病毒的纯度。如需要，可重复此步骤再进行一轮病毒筛选。
[0018]本发明的实施例中，利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统进行犬干扰素基因的重组病毒的构建和表达，其试验结果有效的证明，经重组病毒感染后，不论是在柞蚕蛹体液，还是在柞蚕蛹组织中均可检测到犬干扰素基因的表达。证明昆虫细胞High Five可用于柞蚕核型多角体病毒及相关重组病毒的培养和筛选。也能够利用High Five细胞-柞蚕蛹或柞蚕幼虫实现柞蚕核型多角体病毒及其重组病毒较快速的扩增。在利用我国丰富的柞蚕蛹资源，开发生物、农业、医药卫生以及相关科研产品等方面有广阔的应用前景。一旦得到广泛应用，将有助于提高柞蚕业的产值，增加农民收益。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]本发明附图4幅:
[0020]图1:柞蚕核型多角体病毒感染昆虫细胞High Five，并形成病毒包含体，其中箭头所示为病毒包含体；
[0021]图2:ApNPV_Aph/egfp+病毒在High Five细胞中的增殖曲线；
[0022]图3:重组病毒 ApNPV- Δ ph/ Δ egfp/Caifn- α + 的 PCR 鉴定；
[0023]图4:蛋白质免疫印迹方法检测Caifn-α +基因在柞蚕蛹体中的表达。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实例对本发明做进一步说明，可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实例中所涉及的试验方法如无特殊说明，均为常规方法或制造商所建议方法；所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
[0025]High Five?细胞可从Invitrogen公司购得。无血清细胞培养基SF-900? IISFM可从Invitrogen公司购买，完全TNM-FH培养基由昆虫培养基Grace’ s InsectMedium, Supplemented补加 10%FBS 配制而成，其中 Grace’s Insect Medium, Supplemented和FBS均可从Invitrogen公司购买。低熔点琼脂糖(Amresco)为进口分装产品,可从国内各试剂经销公司购买。ApNPV病毒株为本实验室分离、并通过感染柞蚕蛹保存于-80°C [FanQjet al.The genome sequence of the multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus ofthe Chinese oak silkworm, Antheraea perny1.Virology，2007]，本领域的研究人员也可以从自然感染ApNPV的柞蚕蛹中分离获得该病毒。柞蚕蛹可从市场上购得。感染ApNPV的柞蚕蛹是通过将ApNPV穿刺接种至新鲜柞蚕蛹，并在室温中培养两周制备而成。
[0026]实施例1
[0027]ApNPV 感染昆虫细胞 High Five
[0028](I)High Five细胞用完全ΤΝΜ-Π1培养基进行传代培养。将对数生长期的HighFive贴壁细胞用吸管轻轻吹打，制成约0.5~IXlO6Ail细胞悬液。取细胞悬液加入到6孔细胞培养板中，每孔约1ml，静置28°C培养箱中I~2小时，使细胞密度占培养板的80%左右。
[0029](2)ApNPV取自感染ApNPV的柞蚕蛹。取感染ApNPV的柞蚕蛹体液，用昆虫无血清细胞培养基SF-900? II SFMl: 100 (v: v)稀释，过滤除菌，备用。
[0030](3)将步骤(1)制得的6孔细胞培养板培养的High Five细胞中的培养基取出，在每孔中加入Iml稀释的步骤(2)制得的病毒液，静置28°C培养箱中I小时。
[0031](4)将步骤(3)制得的感染的病毒液取出，更换2ml完全ΤΝΜ---培养基，28°C培养箱继续培养4~5天。显微镜下观察被ApNPV感染的High Five细胞中病毒包含体的形成，如图1，结果首次证明ApNPV对昆虫细胞High Five具有感染性。
[0032]实施例2[0033]柞蚕核型多角体病毒(ApNPV-Λ ph/egfp+)在High Five细胞中的增殖
[0034](I)High Five细胞用完全ΤΝΜ-Π1培养基进行传代培养。将对数生长期的HighFive贴壁细胞用吸管轻轻吹打，制成约0.5~IXlO6Ail细胞悬液。取细胞悬液加入到6孔细胞培养板中，每孔约1ml，静置28°C培养箱中I~2小时，使细胞密度占培养板的80%左右。
[0035](2)取感染ApNPV-Λ ph/egfp+病毒[王林美等，利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白。《蚕业科学》，2010]的柞蚕蛹体液，用昆虫无血清细胞培养基SF-900? II SFMl: 100 (v: v)稀释，过滤除菌，备用。
[0036](3)将6孔细胞培养板培养的High Five细胞中的培养基取出，在每孔中加入Iml稀释的ApNPV-Λ ph/egfp+病毒液，静置28°C培养箱中I小时。
[0037](4)将感染的病毒液取出，更换2ml完全TNM-FH培养基，28°C培养箱继续培养，此时开始计算病毒感染时间。
[0038](5)按病毒感染后8、16、24、48、72、96和120小时分别收集感染病毒的High Five细胞，提取细胞的基因组DNA，用于分析病毒的增殖情况。
[0039](6)采用荧光实时定量PCR(Real-Time PCR，RT-PCR)方法，按绿色荧光蛋白基因(egfp)序列设计特异性引物，Pegfp-f:5’ -GGAGCGCACCATCTTCTTC-3’ (SEQ ID N0.1)；Pegfp-r:5’-AGTTCACCTT GATGCCGTTCTT-3’(SEQ ID N0.2)。扩增并克隆目的片段，构建定量标准质粒，建立定量的标准曲线。Real-Time PCR反应采用SYBRr Premix EX Taq GC试剂盒进行，反应体系为:总体积20ul，包括SYBRa Premix EX Taq GC (2X ),10.0ul ；PCRForward Primer (IOuM),0.4ul ；PCR Reverse Primer (IOuM)0.4ul ；R0X Reference Dye(50X)，0.4ul ;模板 2ul (50ng);无菌水 6.8ul。反应条件:95°C，30 秒，一个循环；95°C，5秒，60°C，30秒，40个循环。
[0040](7)以感染ApNPV-Λ ph/egfP+不同时间的High Five细胞基因组DNA为模板，用绿色荧光蛋白基因(egfp)特异性引物进行荧光实时定量PCR反应。根据检测结果，参照制定的标准曲线，计算病毒的拷贝数，并绘制病毒增殖曲线，如图2。图2的结果显示随着感染时间增加，柞蚕核型多角体病毒在High Five细胞中不断增值，感染72小时后，病毒增殖进入平台期，以后略有增加。实验结果证明High Five细胞不仅能够被柞蚕核型多角体病毒感染，而且病毒能够在该细胞中增殖。这为利用High Five细胞进行昨蚕重组病毒的培养和筛选提供了依据。
[0041]实施例3
[0042]利用High Five细胞进行犬干扰素基因的重组病毒的筛选
[0043](I)利用柞蚕病毒表达载体pApM748BE[王林美等，利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白。《蚕业科学》，2010]构建N-端带有6xHis标签的犬干扰素成熟肽段(interferon-alpha, CaIFN- α，GenBank:Μ28624.1)基因表达质粒pApM748BE/CaIFN- α。具体方法是:根据编码6xHis短肽碱基序列和犬干扰素成熟肽段基因序列，设计一对特异性引物。序列如下:上游引物序列、J、j 55-CACGOATCCATGCACCATCATCATCATCATTGCCACCTGCCCGACACCCA^5(SI'Q ID NO:3)(引物序列中上游5’端前三个碱基为保护碱基，下划线部分为限制性内切酶BamH I识别序列，随其后的部分为ATG和编码6xHis短肽碱基序列，最后黑体部分为犬干扰素成熟肽段基因5’端上游序列)；下游引物序列为5-CTCGAATTCTCATTTCCTCCTCCTGATTCT-3 (seq ID NO:4)(引物序列中
上游5’端前三个碱基为保护碱基，下划线部分为限制性内切酶EcoR I识别序列，后面黑体部分为犬干扰素成熟肽段基因终止序列和3’端下游序列)。利用这组引物，以犬白细胞组织cDNA为模板，进行常规PCR扩增；特异性PCR产物经过序列分析确认后，用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切，纯化回收酶切产物，与同样经BamH I和EcoR I双酶切的表达载体质粒pApM748BE进行连接；连接产物经细菌转化和重组质粒鉴定，获得犬干扰素表达质粒pApM748BE/CaIFN- α。提取质粒DNA，紫外分光光度计定量，供转染用。
[0044](2)将提取的质粒DNA与带有荧光蛋白基因的柞蚕病毒基因组DNA (ApNPV-Λ ph/egfp+DNA)等量混合，用转染试剂Cellfectin将混合的DNA直接转染至昨蚕蛹中，室温15-20天。待蛹体发病后，取发病蛹体液，再次转接感染新的柞蚕蛹，使病毒得到扩增，用于后续的重组病毒的分离筛选。
[0045](3)将有重组病毒和野生病毒混合感染的柞蚕蛹体液，用昆虫无血清细胞培养基SF-900? II SFMl:100 (V: V)稀释，过滤除菌。再将此无菌病毒液10倍梯度稀释，配制成10'10'10'10'10'Kr6和10〃不同浓度病毒液。取Iml不同浓度病毒液感染High Five细胞，I小时后，取出病毒液，加入Iml2%的低熔点琼脂糖，待琼脂糖凝固后，加入Iml完全TNM-FH培养基，28°C培养箱继续培养4~5天，荧光显微镜下观察病毒发生情况。
[0046](4)取出上层培养液，选最低病毒浓度感染的细胞孔，用玻璃吸管将个别有绿色荧光蛋白基因表达的病毒感染的细胞挑出。将其余的细胞悬浮在少量细胞培养基中，振荡离心后取上清，注射感染柞蚕蛹，每头50~lOOul，置22°C，10~12天。使重组病毒得到繁殖扩增，用显微镜观察或PCR检测方法分析筛选病毒的纯度。如需要，可重复此步骤再进行一轮的病毒筛选。克隆的重组病毒应带有犬干扰素基因，而没有绿色荧光蛋白基因，ApNPV-Aph/Λ egfp/Caifn-α+`，如图3。图3的结果显示，用PCR方法鉴定经过纯化的重组病毒ApNPV- Δ ph/ Δ egfp/Caifn- α +只含有犬干扰素基因，没有绿色荧光蛋白基因。
[0047](5)将重组病毒感染柞蚕蛹，室温10-15天后，分别取病毒蛹体液和组织进行蛋白质凝胶电泳，并采用蛋白质免疫印迹方法，用抗His标签抗体检测犬干扰素基因的表达，如图4。图4的结果显示经重组病毒感染后，不论是在柞蚕蛹体液，还是在柞蚕蛹组织中均可检测到犬干扰素基因的表达。证明昆虫细胞High Five可用于柞蚕核型多角体病毒及相关重组病毒的培养和筛选。
【权利要求】
1.昆虫细胞HighFive在培养柞蚕核型多角体病毒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用为利用昆虫细胞HighFive进行柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒的感染、增殖；或利用昆虫细胞High Five筛选基于柞蚕核型多角体病毒而产生的相关重组病毒。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒在High Five细胞中的增殖方法为: (1)HighFive细胞用完全ΤΝΜ---培养基进行传代培养至对数生长期，然后制成0.5~IXlO6Ail细胞悬液，再转至细胞培养板中，26-28°C培养I~2小时，使细胞密度占培养板的 70-80% ； (2)将柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒样品，用昆虫无血清细胞培养基SF-900?IISFM，按1:100的体积比稀释，过滤除菌后获得柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒的病毒液； (3)将步骤(1)制备的HighFive细胞中的培养基弃去,加入等体积的步骤(2)制备的柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒的病毒液；静置28°C培养箱中I小时； (4)将步骤(3)制备的病 毒液弃去，加入二倍体积的完全ΤΝΜ---培养基，28°C培养72~96小时。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的柞蚕核型多角体重组病毒在HighFive细胞中的筛选方法为: (a)将有重组病毒和野生病毒混合感染的柞蚕蛹体液，用昆虫无血清细胞培养基SF-900? II SFM按照1:100的体积比稀释，过滤除菌获得无菌病毒液，将无菌病毒液进行10倍梯度稀释； (b)分别取步骤(a)制备的梯度稀释的病毒液感染HighFive细胞，I小时后弃去病毒液，加入等体积的2%的低熔点琼脂糖，待其凝固后，加入等体积的完全TNM-FH培养基，280C培养4~5天，显微镜下观察病毒发生情况； (c)取出上层培养液，选最低病毒浓度感染的细胞孔，用玻璃吸管将个别感染有标记的野生病毒的细胞挑出；将其余的细胞悬浮在细胞培养基中，振荡离心后取上清，注射感染柞蚕蛹，每头50~IOOul，置22 °C条件10~12天，使重组病毒繁殖，用显微镜观察或PCR检测方法分析筛选病毒的纯度。
5.根据权利要求2~4中任一项所述的应用，其特征在于:所述的柞蚕核型多角体重组病毒是柞蚕核型多角体病毒ApNPV- Δ ph/egfp+，或柞蚕核型多角体病毒ApNPV- Δ ph/Δegfp/Caifn-α +。
【文档编号】C12N7/00GK103555675SQ201310562776
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】范琦, 赵振军, 王林美, 叶博, 岳冬梅, 张波, 李树英 申请人:辽宁省农业科学院大连生物技术研究所