一个基因kt525在提高植物耐逆性上的应用的制作方法

一个基因kt525在提高植物耐逆性上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个来源于水稻的与耐逆性相关的基因及其应用。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对干旱、盐胁迫的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物（特别是禾谷类作物）的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
【专利说明】一个基因KT525在提高植物耐逆性上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物耐逆性相关的基因与其应用，特别涉及来源于水稻的与抗逆相关的基因KT525在提高植物耐逆性上的应用。
【背景技术】
[0002]水稻、玉米和小麦是我国重要的粮食作物，三大作物的产量、品质对于我国的粮食生产和粮食安全都至关重要。干旱、盐碱、高温和冻害等非生物逆境会直接影响粮食作物的正常生长和产量。利用现代农业生物技术，如转基因技术培育具有耐逆性和广泛适应性的农作物新品种，可以使农作物在逆境条件下保持稳定高产。随着转基因研究的深入，已经陆续分离克隆了一些与抗逆相关的基因，包括代谢过程中的关键调控基因、渗透调节蛋白、小分子物质，还有参与调控各种逆境应答途径的转录因子等。
[0003]转录因子是调控基因表达的关键基因，对作物的生长发育起着重要的调节作用。多年以来，转录因子的克隆和功能研究一直是科学研究的热点之一，科学家们利用不同的研究路线分离鉴定了大量的转录因子，也从中发现了一些与农艺性状相关的调控因子，为农作物的性状改良提供了重要基因资源。在水稻基因组测序工作完成后，许多数据库对水稻基因组进行了分析。据预测，在籼稻和粳稻中分别包含2，025个和2，384个转录因子，分属于63个转录因子基因家族，如WRKY (111/113，籼稻/粳稻)、bZIP (88/109)、AP2/EREBP (174/182),AUX/IAA (30/46),MYB (136/138),HB (84/103)等。根据以往的文献报道与数据库的功能注释，这里既包含植物所特有的转录因子家族，如WRKY，也包含与植物生长发育、抗逆性等密切相关的其它一些转录因子家族，如bZIP、AP2/EREBP、MYB等。利用这些数据库，结合基因芯片杂交、EST序列等基因表达信息，从基因组水平预测和分离水稻转录因子全长cDNA，并利用已经建立的高效的水稻转化系统使其在水稻中过量表达，对其进行规模化功能验证，进一步 通过研究转基因水稻的表型变化及抗逆性能的改变等推断转录因子的功能；在大量的重复性的植物转化、表型分析、功能鉴定等工作的基础上，寻找在改良农作物中具有实用价值的植物重要调节因子，并应用于作物的性状改良，对有效解决农业生产中的实际问题，具有重要的理论意义和应用价值。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一段与水稻耐逆性相关的核苷酸序列，命名为KT525基因，以用于提高植物的耐逆性能。
[0005]发明所提供的与耐逆性相关的KT525基因，来源于稻属水稻sativa L.)，编码具有序列表中的SEQ ID NO:1所不氣基酸序列的蛋白质。
[0006]序列表中的SEQ ID NO:1由263个氨基酸残基组成，为蛋白KT525。本发明中KT525的编码基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组DNA序列，或者是与所述基因具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的编码基因，可以具有序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列。[0007]含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
[0008]扩增KT525任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码本发明与耐逆性相关的KT525基因导入植物组织、细胞或器官，植物耐逆性获得提高。
[0010]在上述提高植物耐逆性的方法中，本发明中水稻与耐逆性相关的KT525基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
[0011]本发明水稻与耐逆性相关KT525基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如PBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、Gateway?系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。
[0012]使用本发明中水稻与耐逆性相关的KT525基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子,玉米Ubiquitin启动子或水稻actinl启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号:NM_118848.2，G1:30687489)和 NapinA (GenBank 号:M64633.1，G1: 349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0013]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。
[0014]其中，本发明以pCAMBIA1300为出发载体，构建的含有本发明水稻与耐逆性相关的KT525基因的植物表达载体命名为pCactF-KT525。携带有本发明水稻与耐逆性相关的KT525基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。[0015]此外，通过将转化有本发明水稻与耐逆性相关的KT525基因或其同源序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的耐逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。
[0016]本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。
[0017]本发明提供了一个与耐逆性相关的基因KT525。实验证明，将本发明的基因转化水稻可提高水稻对干旱、盐胁迫的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
[0018]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】

【附图说明】
[0019]图1为表达载体pCactF的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界山yg表示潮霉素抗性；p35S表示CaMV35S基因的启动子；T35S表示CaMV35S基因的终止子；pActl表示Actin基因的启动子；3flag表示3倍的flag标签序列；0CS表示OCS基因的终止子'HindlW、Kpn1、SpeI ,Xbal,Sail和分别表示限制性内切酶的酶切位点。
[0020]图2为KT525转基因株系的耐旱性分析:A:干旱处理前苗生长状态；B:干旱处理后苗生长状态；C:正常培养一周后苗生长状态；D:干旱处理后的存活率统计。
[0021]图3为KT525转基因株系的土壤耐旱性分析:A:第一次旱筛前苗生长状态；B --第一次旱筛后苗生长状态；C:第二次旱筛前苗生长状态；D:第二次旱筛后苗生长状态。
[0022]图4为KT525转基因株系生长周期的耐旱性分析:A:水稻植株旱筛结束时苗的生长状态:旱筛结束后水稻穗的状态。
[0023]图5为.KT525转基因株系的盐筛分析:A:盐筛处理前苗生长状态；B:盐筛处理后苗生长状态；C:正常培养一周后苗生长状态；D:盐筛处理后的存活率统计。
【具体实施方式】[0024]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成,测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，PEASY-Tl连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1300。
[0025]1、KT525基因的分离
从KT525基因的编码起始位点ATG开始设计5’端引物，于终止密码子处设计3’端引
物:
引物 1:5’ GCACGCtctagaATGAACCCCACCACCGCCGCC 3’
引物 2:5，GCACGCgtcgacTTATGGCTCGGCCTTCATGTGG 3，
引物I中tctaga序列为限制性内切酶XbaI的酶切位点，下划线标识的序列为激基因的编码序列；引物2中gtcgac序列为限制性内切酶SalI的酶切位点，下划线标识的序列为KT525基因的编码序列。引物I的序列如SEQ ID No:3所不，引物2的序列如SEQ IDNo:4所示。
[0026]提取幼苗期的日本晴水稻的总RNA，通过反转录得到cDNA作为模板，用以上引物扩增KT525基因的全长，其大小为792bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所编码的蛋白质氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:1所示。
[0027]具体反应为:取约2 ii g 的总 RNA，加入 I ii I IOXDNase buffer, I yl 的 DNase,补DEPC处理过的水至IOiil体系，混匀，37°C温育30min后，加入I yl的RQ DNase stopsolution, 65 °C 温育 IOmin 以终止反应后，加入 2 ii I Oligo (dT) 18 primer (0.1 U g/y I)， 4 u I 5 X First-strand buffer, Iul Ribonuclease inhibitor (40U/ U I), 2 U I4XdNTP (各 IOmM)，I ii I MMLV Reverse Transcriptase (200U/y I)，小心混匀，37°C保温 I小时。然后90°C处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cDNA。将得到的cDNA稀释10倍，取I ill作为PCR反应的模板，上、下游引物(IOiiM)各lyl，LA Taq酶(5U/ u I )0.l，4XdNTPs (各 IOmM) I u I, 2XGC buffer (Mg2+) 25 u 1,H20 20.5 u 10PCR反应条件为预热 95°C 5min，变性 94°C lmin，退火 56°C 30sec，延伸 72°C lmin50sec，34个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，获得了大小分别与预期结果相符的DNA片段。分别回收并纯化上述片段，将其连接入载体pEASY-Tl (全式金公司)中，通过热激法转化大肠杆菌(E.coli)T0P10菌株,挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm的摇床中培养12-16小时，提取质粒，分别得到含有目的片段的重组质粒，测序验证正确后，用XbaI和SalI双酶切切下目的片段KT525，连入进行相同双酶切的PCactF植物表达载体，构建得到载体pCactF-KT525。挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落进行测序验证。植物表达载体PCactF的T-DNA区图谱如图1所示。
[0028]2.农杆菌共转化
用农杆菌介导法将按【具体实施方式】I获得的与耐逆性相关的基因KT525转化水稻，具体方法如下:
利用热激法将上述重组载体PCactF- KT525转入农杆菌AGLO菌株(中国科学院遗传与发育生物学研究所赠送)，利用农杆菌对水稻进行共转化。
[0029]将获得的水稻转基因植株的部分叶片，按常规方法提取总DNA，在正向引物5’ -ACTCACCGCGACGTCTGT -3’ 和反向引物 5’ - TTCCTTTGCCCTCGGACG -3’ 的引导下，PCR 扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得828 bp DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果表明用上述方法获得了转化有PCactF- KT525的转基因水稻。
[0030]3、KT525转基因T1代植株的耐旱性分析
3.1 KT525转基因T1代植株的实验室耐旱性分析
收获KT525的Tl代转基因水稻种子，选取5个以上的株系进行干旱筛选。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3: I的株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期(第3片叶完全舒展)，其生长状态如图2A。改用含有20% PEG的Hoagland溶液进行旱筛，约3天，对照出现叶尖发黄泛白，叶片下垂或半卷甚至全卷时(图2B)，洗去PEG溶液，正常培养。期间每1.5天更换一次PEG溶液。三角瓶中的营养液两天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。一周后照相(图2C)，统计成活苗数，计算耐旱苗比例，结果如图2D (横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐旱苗百分比)。由苗的生长状态和数据统计可以得知KT525转基因植株具有耐旱性。
[0031]3.2实验室土壤旱筛分析
除上述的筛选外还进行了土壤旱筛，培养至三叶期的小苗转移至小花盆中，适应生长一周。苗浇水至饱和，去除多余水分，干旱处理约两周，对照出现叶片卷曲后照相复水处理，以同样的方法旱筛两次。实验结果见图3，经干旱处理后，KT525转基因水稻T1代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，野生型对照中花11 (ZHll)和转空载体对照(469)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(图3D)。土壤两次次旱筛结果显示，同等条件下对照植株叶片卷曲、发黄、干枯，而KT525转基因植株生长良好(图3B、D)。
[0032]3.3 KT525转基因株系生长周期的耐旱性分析
我们将符合抗性比3:1的幼苗移栽到如图4A的容器中培养，待植株生长到抽穗阶段开始干旱直到生长结束。由实验结果可知，在自然条件下未浇水KT525转基因植株比对照组水稻更具有耐旱性(图4A，4B)。上述结果显示T1代转基因水稻植株对干旱的耐受能力明显高于未转基因水稻植株。
[0033]4、KT525转基因Tl代植株的耐盐性分析
收获KT525 Tl代转基因水稻种子，选取5个以上的株系进行盐胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3: I的株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期(第3片叶完全舒展)，其生长状态如图5A。改用含有200mM NaCl的Hoagland溶液进行盐筛，约3天左右，对照出现叶尖发黄泛白，叶片下垂或半卷甚至全卷时(图5B)，洗去盐溶液，正常培养。期间每1.5天更换一次盐溶液。复水第二天再更换一次营养液，以去除剩余的盐分。三角瓶中的营养液
2天更换一次， 以保持营养液的新鲜状态。一周后照相(图5C)，统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比)。实验结果显示，Tl代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，KT525转基因水稻Tl代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，转空载体的中花11对照(CK)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(图5C)。
[0034]此实 验说明KT525基因具有增强水稻耐盐性的作用。
【权利要求】
1.一个基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
2.含有权利要求1所述基因的表达载体、表达盒。
3.权利要求1所述的基因编码的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
5.权利要求1所述的基因及其编码的蛋白质在培育耐逆性转基因植物中的应用。
6.权利要求5所述的应用，所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。
7.权利要求5或6所述的应用，其特征在于:将植物耐逆基因插入表达载体，获得含有植物耐逆基因的植物表达载体，然后将该植物表达载体导入目的植物，从表达所述植物耐逆性的植株筛选得到耐逆性增强的植株。
8.权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于:所述植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为单子叶植物，尤其优选为水稻。
9.权利要求8所述的应用，其中所述表达载体的特征是:用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。
10.权利要求8所述的应用，其特征在于:在所述植物表达载体中加入选择性标记基因，所述选择性标记基因包括但不限于:可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶、发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物、抗化学试剂标记基因。
11.权利要求9所述的应用，其中所述出发载体为pCAMBIA系列载体。
12.权利要求11所述的应用，其中所述出发载体为pCAMBIA1300。
13.—种培育转基因植物的方法，是将权利要求1所述的基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于:所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于:所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为单子叶植物，尤其优选为水稻。
【文档编号】C12N15/29GK103614385SQ201310565967
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2012年11月28日
【发明者】周君莉, 吴洁芳, 赵静, 卫静 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司