一种7α，15α双羟化DHEA P450酶基因的克隆及分析的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种来自于Colletotrichum?lini?ST-1的新型真菌细胞色素P450酶CYP?X完整的mRNA和DNA序列的克隆和分析方法，其核苷酸序列分别为SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2，相应的氨基酸序列命名为SEQ?ID?NO:3。该酶能高效转化DHEA为7α,15α-diOH-DHEA，该基因的获得为其异源表达及产业化生产奠定理论基础，有较大的应用潜力及经济价值，也为细胞色素P450酶的相关研究奠定了理论基础。
【专利说明】—种7α，15α双羟化DHEA P450酶基因的克隆及分析
【技术领域】
[0001]本发明设计来源于亚麻刺盘孢霉菌iColletotrichum lini)ST_1菌株的一种能对DHEA进行7 α，15 α -双羟化的Ρ450酶，包括其完整的mRNA和DNA序列的克隆和分析，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]自生物转化技术应用于甾体羟基化研究以来，人们已经发现了大量具有重要药理作用和药用价值的羟基留体化合物，留体羟化仍是目前研究留体药物的热点之一。以去氢表雄酮(DHEA)、胆固醇、孕留烯醇等一些3-羟基留体为主，其在人体的器官和组织中，会转化成为相应的羟基留体衍生物，并且具有重要的生物活性。其中，去氢表雄酮(DHEA)的双羟化产物7α，15 α -diOH-DHEA，可用于合成多种甾体激素类药物，如避孕药的主要成分屈螺酮，其市场需求量极大，合成方法受到广泛的关注。 [0003]目前，7 α，15 a -diOH-DHEA的合成方法主要有传统的化学合成法和生物法。化学法具有反应步骤多，立体选择性差以及环境污染等缺点，故生物转化法受到众多研究者的青睐。利用生物转化法合成甾体羟化物反应过程中起主要作用的是P450酶系中的细胞色素P450单加氧酶。而细胞色素P450介导的生物转化研究中，由于P450酶表达量不高且野生菌蛋白分离纯化困难，严重阻碍了对其代谢反应的研究。近些年来，随着分子生物学技术的发展，人们开始尝试在真菌中克隆P450基因，在大肠或酵母等工程菌中进行异源表达，以大量提高P450酶的表达量并为P450酶的酶学性质研究提供基础。本专利中采用的Clini ST-1在以DHEA为底物时，能大量生成7 α，15 a -diOH-DHEA,但其转化周期长，且全细胞催化易产生副产物。因此，C lini ST-1中P450酶基因信息的获取，对该基因的异源表达具有一定的理论研究和工业应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种来自于C lini ST-1的新型真菌细胞色素P450酶CYPX完整的mRNA和DNA序列的克隆和分析，该酶能高效转化DHEA为7 α，15 a -diOH-DHEA,该基因的获得为其异源表达及产业化生产奠定理论基础。
[0005]C.lini ST-1菌株由本实验室筛选，该菌于2012年4月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC N0.6501。
[0006]本发明的技术方案:
一种源自于C Uni ST-1的能对DHEA进行7 α，15 α双羟化的细胞色素Ρ450酶CYPX，其基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。获得完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。
[0007]所述的完整mRNA推导的CYP X氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。
[0008]所述的CYP X完整的mRNA和DNA序列的克隆和分析方法:(1)Colle to trichum lini ST-1 总 RNA 的提取
菌株在产酶培养基(葡萄糖15 g/L,酵母膏15 g/L,玉米浆3 g/L, NaCl 1.16 g/L, KH2P04 2.72 g/L, FeS04 0.03 g/L，)中培养2天，培养温度30°C。真空抽滤收集菌体，并用无菌水洗涤2-3次，将湿菌体置于预冷的研钵中，加入1 mL Trizol试剂，低温匀浆2min ;匀衆液转移至1.5 mL离心管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡30 s,室温放置3 min,12, 000 rpm 4 °C离心10 min ;吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍无水乙醇(v/v)，混匀；用移液器将混合液转至吸附柱中，室温下静置2 min, 12, 000 rpm离心3 min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入500 μ? RPE溶液，静置2 min,于10，000 rpm离心30 s，倒掉收集管中废液；重复该步骤一次；将吸附柱放回收集管中，10，000 rpm离心2 min ;将吸附柱置于干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入30-50 μ? DEPC处理水，静置5 min, 12, 000 rpm离心2 min，将所得到的RNA溶液用于后续试验。
[0009](2 ) CYP X 3 ’ 端 mRNA 序列的克隆
首先随机挑选Colletotrichum属的P450酶的氨基酸序列进行同源比对,发现在P450酶特征序列F--G—C-G的上游有一段保守序列。然后以该保守序列设计上游简并引物P1，以M13 Primer M4为下游通用引物，筛选含有特征序列F—GC-G的目的片段。
[0010]FP1:5，-CCNGAGAGNTGGCTN-3，
M13 Primer M4:5’ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3’
\>XC.lini ST-1 总 RNA 为模板，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增。将PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PMD 19-T载体连接(PMD19-T — CYP`X-3’)，转化JM109，经酶切鉴定分析正确后送上海生工测序，得到CYPX 3’端mRNA序列，包括3’端转录终止区序列。
[0011](2) CYPX 5’ 端 mRNA 序列的克隆
基于上述得到的CYPX 3’端mRNA序列，设计两条反向引物RP1，RP2。
[0012]RP1:5’ -TCCATCCAAGCAATGTAGCGGCCCA-3’
RP2:5’ -TTCGTACGCT CCTCGCTCTCAAGCC-3’
按照 Clontech 的 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 说明书进行 5’-RACE。将两轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PMD19-T连接(PMD19-T-CYPX5’ )转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到CYPX 5’端mRNA序列，包括5’端转录起始区序列。
[0013](3)CYPX编码区DNA序列的测定
基于上述得到的CYPX 5’和3’端mRNA序列，设计一对引物CYPX-P1，CYPX-P2。
[0014]CYPX-P1:ATGGCCATCCTCACCGTCGGCACYPX-P2:TCACACACGCTGTACCTGCGGC
以C lini 31'-1基因组0嫩为模板，0￥?乂-?1和0￥?乂-?2为引物进行？0?。？0?产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PMD19-T连接(PMD19-T-CYPX-DNA)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到CYPX编码区DNA序列。
[0015](4)CYPX基因的生物信息学分析
将CYPX的5’端和3’端mRNA序列进行拼接，得到子转录起始位点至Poly (A)完整的mRNA序列；在从^1上对整个开放阅读框(ORF)进行分析，进而推导出CYPX的氨基酸序列，进行信号肽预测。将CYPX的编码区DNA序列与cDNA序列进行比对，分析其外显子和内含子并对5’端启动子区域和3’转录终止区的功能进行预测。该基因与来源于沿的黄酮类3’，5’-酶(Sequence ID: CCF46441.1 的同源性比较高，由于隶属于不同的菌属，基因的功能完全不一样，故判定此酶为一种新型的P450酶，命名为CYPX。
[0016]本发明的有益效果:
本发明提供了一种能对DHEA进行7 α，15 α -双羟化的真菌细胞色素Ρ450酶CYPX的基因，包括CYPX完整mRNA和DNA序列的克隆和分析，为该基因的异源表达和产业化生产奠定了理论基础。
[0017]
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1:获取C.lini ST-1完整mRNA和DNA序列的流程图。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]实施例1亚麻刺盘孢霉colletrichcum lini) ST-1总RNA的提取
C.lini ST-1在产酶培养基中于30°C，220 rpm条件下培养2天。真空抽滤收集菌体，并用无菌水洗涤2-3次，将湿菌体置于预冷的研钵中，加入1 mL Trizol试剂，低温匀浆2 min ;匀浆液转移至1.5 mL离心管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡30 s，室温放置3min, 12, 000 rpm 4 °C离心10 min ;吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍无水乙醇(v/v)，混匀；用移液器将混合液转至吸附柱中，室温下静置2 min, 12, 000 rpm离心3 min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入500 μ? RPE溶液，静置2 min,于10，000 rpm离心30 s，倒掉收集管中废液；重复该步骤一次；将吸附柱放回收集管中，10，000 rpm离心2 min ;将吸附柱置于干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入30-50 μ? DEPC处理水，静置5 min, 12, 000 rpm离心2 min，将所得到的RNA溶液用于后续试验。
[0021]实施例2亚麻刺盘孢霉ST-1 3’端mRNA序列的克隆
以C.lini ST-1总RNA为模板，使用AMV反转录酶进行反转录反应合成cDNA第一条链。反转录反应按如下条件进行:42~60 °C保温15~30 min, 99°C 下5 min灭活AMV反转录酶，然后于5°C保存5 min。
[0022]在反转录管中加入位Taq? HS酶，同时以M13 Primer M4和FP1为引物进行第一轮 PCR，其反应条件为 94°C 2 min，30 个循环(94°C 30s,52°C 30s,72°C 45s)，72°C lOmin。将PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PMD19-T连接(PMD19-T-CYPX)，转化JM109，酶切鉴定正确后送上海生工测序。
[0023]实施例3亚麻刺盘孢霉ST-1 5’端mRNA序列的克隆
以5’端RACE Outer Primer和RP1为引物进行第一轮扩增，其反应条件为:94°C 3min，30 个循环(94°C 30s,65°C 30 s,72°C 90s),72°C 10 min ;以 Inner Primer 和 RP2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为:94°C 3 min，30个循环(94°C 30s，55°C 30s，72°C90s，72°C 10 min。将两轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PMD19-T连接(PMD19-T-CYPX5’)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生共测序。[0024]实施例4亚麻刺盘孢霉iColletotrichum lini ) ST-1编码区DNA序列的测定以C.lini的基因组为模板，CYPX-P1和CYPX-P2为引物进行PCR，其反应条件为:94°C3 min，30 个循环(94°C 30s，55°C 30 s，72°C 90 s)，72°C 10 min。将 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析条带，割胶回收目的条带并与PMD19-T连接(PMD19-T-CYPX-DNA)，转化JM109,经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
【权利要求】
1.一种来源于保藏编号为CGMCC N0.6501的亚麻刺盘孢霉菌(Cb77eioiricA應lini )ST-1菌株P450酶CYPX，其完整的mRNA和DNA的核苷酸序列分别对应于序列表中的SEQ IDNO: 1和SEQ ID NO: 1，该酶能对DHEA进行7 α，15 α位双羟化。
2.权利要求1所述的7α，15 α -双羟化Ρ450酶CYPX，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。
3.C.lini ST-1 CYPX完整mRNA和DNA序列的获取方法:(1)C.lini ST-1 CYPX 3’ 端 mRNA 序列的克隆:挑选属的 P450 酶的氨基酸序列进行同源比对，发现在P450酶特征序列F--G—C-G的上游有一段保守序列；然后以该保守序列设计上游简并引物P1，以M13 Primer M4为下游通用引物，筛选含有特征序列F--G—C-G的目的片段；FP1:5’ -CCNGAGAGNTGGCTN-3’M13 Primer M4:5’ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3’以C.lini ST-1总RNA为模板，使用AMV反转录酶进行反转录反应合成cDNA第一条链；以M13 Primer M4和FP1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为94°C 2 min，30个循环:94。。30s，52°C 30s，72°C 45s，72°C lOmin ;目的条带经克隆、测序得到C 7i/?i ST-1 CYPX3’端序列； (.2)0.lini ST-1 CYPX 5’端mRNA序列的克隆:基于上述得到的CYPX 3’端mRNA序列，设计两条反向引物RP1，RP2 ;RP1:5’ -TCCATCCAAGCAATGTAGCGGCCCA-3’RP2:5’ -TTCGTACGCT CCTCGCTCTCAAGCC-3’将反转录合成的cDNA第一条链为模板、5’ RACE Outer Primer和RP1为引物进行第一轮 PCR 扩增(94°C 2 min ;30 个循环，94°C 30s，65°C 30s，72°C 90s ；72°C 10 min);以5’RACE Inner Primer 和 RP2 为引物，进行第二轮 PCR 扩增:94°C 3 min ;30 个循环，94°C30s，55°C 30s，72°C 90s ；72°C 10 min ;目的条带经克隆、测序得到 C 7i/?i ST-1 CYPX 5’端序列；(3)C lini ST-1 CYPX编码区DNA序列的测定:基于上述得到的C lini ST-1 CYPX5’和3’端mRNA序列，设计一对引物CYPX-P1，CYPX-P2 ；CYPX-P1:ATGGCCATCCTCACCGTCGGCACYPX-P2:TCACACACGCTGTACCTGCGGC以C.lini ST-1基因组DNA为模板，CYPX-P1和CYPX-P2为引物进行PCR扩增:4°C 2min ;30个循环，94°C 30s，55°C 30s，72°C 90s ；72°C 10 min ;目的条带经克隆、测序得到C.lini ST-1 CYPX 编码区 DNA 序列。
【文档编号】C12N15/10GK103642763SQ201310570323
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月16日 优先权日:2013年11月16日
【发明者】许正宏, 史劲松, 李会, 李恒, 张旦旦, 许鸿瑜, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:江南大学