一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法
【专利摘要】一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法，属于兽用生物制品【技术领域】。其每1000ml磷酸缓冲液中含有PPLO20～50g、酵母粉2～10g、葡萄糖3～15g、1%酚红0.5～4ml、氨基酸组合2～10g、复方中药多糖15～30g和猪血清50～100ml。本发明的猪肺炎支原体培养基，在培养猪肺炎支原体时可以提高猪肺炎支原体耐受力，降低猪肺炎支原体凋亡率；本发明的猪肺炎支原体培养基，可以提高猪肺炎支原体培养菌数，培养菌液浓度达1010-11/ml，比普通培养基提高5-10倍以上；本发明的猪肺炎支原体培养基，在培养猪肺炎支原体时可以同时抑制其他细菌生长，降低培养猪肺炎支原体培养的污染风险。
【专利说明】一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽用生物制品【技术领域】，具体涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002]猪支原体肺炎是猪场一种极为常见的呼吸道疾病，在全世界范围内流行，俗称猪气喘病，由猪肺炎支原体(Mhp)所导致，该病原在猪体内主要寄居在气管、支气管和细支气管的纤毛上，严重破坏猪呼吸道的物理防卫机制-防御粘膜，增加了猪群对其它呼吸性病原体的易感性，如猪流感病毒，猪繁殖和呼吸道综合征病毒，II型猪圆环病毒，支气管败血波氏杆菌，胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌等，所以常常造成多种病原的复合感染，引发猪呼吸道综合征(PRDC)或者其他疾病，肺炎支原体可降低猪生长率12.7%和降低饲料报酬13.8%，严重危害养猪业的发展。
[0003]猪肺炎支原体为兼性厌氧菌，生长需求极为苛刻，分离相当困难，它对营养要求比一般的支原体高。猪肺炎支原体虽然能够利用培养基中的营养合成自身生长繁殖所需的物质，但由于其基因组的分子量较小，携带的信息量不多，生物合成能力有限，因此需要从体外摄取胆固醇、氨基酸、脂肪酸、核酸前体及维生素等物质，这就促使支原体的培养基成分比较复杂，必须添加一些特殊营养物质。
[0004]由于猪肺炎支原体对营养要求比一般支原体高，培养基成分比较复杂，培养时间长，培养物浓度较低，大大地影响了人们对其进一步地研究，同时也阻碍了猪肺炎支原体疫苗开发与生产。目前不少学者 设计了多种培养基来供其生长，尽管它们各具特色，但总的说来都没有解决培养困难的问题。所以在猪肺炎支原体的培养上还要做进一步研究。
[0005]多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。此外，中药多糖对低等生物具有特殊的保护作用。中药多糖富含羟基，可以和低等活性生物活体结合，构建多维网络空间氢键结构，在活性生物活体表面形成保护膜，实现对活性生物的保护作用。
[0006]本发明基于上述技术背景，提出一种支原体培养基，具体是一种特别适用于猪肺炎支原体的培养基，提高了猪肺炎支原体菌液浓度。
【发明内容】
[0007]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法的技术方案，通过该培养基培养猪肺炎支原体，可提高猪肺炎支原体菌液浓度，提高猪肺炎支原体抗原产量。
[0008]所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分:PPLO20 ~50g
酵母粉2~IOg
葡萄糖3~15g
1%酚红0.5~4ml
氨基酸组合 2~IOg 复方中药多糖 15~30g 猪血清50~100ml ；
所述的氨基酸组合中含有L-精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、L-半胱氨酸和丝氨酸；
所述的复方中药多糖从以下中药组合物中提取得到:黄连、银杏叶、怀牛膝、党参、茯苓、枸杞、甘草和丹参。
[0009]所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分:
PPLO30 ~40g
酵母粉4~8g
葡萄糖5~IOg
1%酚红I~3ml
氨基酸组合 4~Sg 复方中药多糖 20~25g 猪血清60~80ml。
[0010]所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于所述的氨基酸组合含有L-精氨酸10~30%、甘氨酸5~15%、酪氨酸10~30%、L-半胱氨酸20~40%和丝氨酸10~30%。
[0011]所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于所述的复方中药多糖从以下中药组合物中提取得到:黄连5~15份、银杏叶10~30份、怀牛膝10~20份、党参10~30份、获茶5~50份、构祀10~30份、甘草10~20份和丹参5~15份。
[0012]所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于所述的复方中药多糖通过以下步骤制得:
a、称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上
清；
C、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖；
d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；
f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到复方中药多糖。
[0013]所述的一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤:
O配制磷酸缓冲溶液；
2)从黄连5~15份、银杏叶10~30份、怀牛膝10~20份、党参10~30份、茯苓5~50份、枸杞10~30份、甘草10~20份和丹参5~15份中提取得到复方中药多糖；
3)称取PPLO 20~50g、酵母粉2~10g、葡萄糖3~15g、氨基酸组合2~10g、复方中药多糖15~30g，溶解于步骤I)制得的1000mL磷酸缓冲溶液中，加入1%酚红0.5~4ml充分混匀，用酸或碱调节pH至7.4~7.8之间，无菌条件下通过0.22 μ m滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用，使用前添加健康猪血清50~100ml，得到猪肺炎支原体培养基。
[0014]所述的一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中复方中药多糖通过以下步骤制得:
a、称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上
清；
C、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖；
d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；
f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到复方中药多糖。
[0015]所述的一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中所述的氨基酸组合含有L-精氨酸10~30%、甘氨酸5~15%、酪氨酸10~30%、L_半胱氨酸20~40%和丝氨酸10~30%。
[0016]所述的一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中称取PPLO 30~40g、酵母粉7~8g、葡萄糖5~10g、氨基酸组合4~8g、复方中药多糖20~25g，溶解于步骤I)制得的1000mL磷酸缓冲溶液中，加入1%酚红I~3ml充分混匀，用酸或碱调节pH至7.4~7.8之间，无菌条件下通过0.22 μ m滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用，使用前添加健康猪血清60~80ml。
[0017]本发明中PPLO为PPLO培养基由森贝伽(南京)生物科技有限公司购得。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
(I)本发明所制备的猪肺炎支原体培养基，在培养猪肺炎支原体时可以提高猪肺炎支原体耐受力，降低猪肺炎支原体凋亡率。
[0019](2)本发明所制备的猪肺炎支原体培养基，可以提高猪肺炎支原体培养菌数，培养菌液浓度达IOich11AiI (ccu计数法)，比普通培养基提高5_10倍以上。
[0020](3)本发明所制备的猪肺炎支原体培养基，在培养猪肺炎支原体时可以同时抑制其他细菌生长，降低培养猪肺炎支原体培养的污染风险。
【具体实施方式】
[0021]为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0022]实施例1
一种猪肺炎支原体培养基，该培养基每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分:
PPLO20g
酵母粉6g
葡萄糖8g
1%酌.红4ml
氨基酸组合 4g 复方中药多糖 15g 猪血清50ml
一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其步骤是:
(I)磷酸缓冲溶液的配制:准确称取氯化钠Sg，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钙0.1g,含6个结晶水的氯化镁0.1g溶于1000ml双蒸水中，无菌条件下通过0.22 μ m滤膜,过滤除菌备用。
[0023](2)复方中药多糖的制备
按黄连15份、银杏叶30份、怀牛膝10份、党参10份、茯苓20份、枸杞10份、甘草10份和丹参15份称取各中药原 料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；
b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上
清；
C、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖；
d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；
e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；
f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到复方中药多糖。
[0024](3)猪肺炎支原体培养基的配制:按比例称取PPLO 20g、酵母粉6g、葡萄糖8g、l%酚红4ml、氨基酸组合4g (L-精氨酸0.Sg、甘氨酸0.4g、酪氨酸1.0g、L_半胱氨酸1.2g和丝氨酸0.6g)、复方中药多糖15g，溶解于步骤(1)制得的磷酸缓冲溶液中，加入1%酚红4mL充分混匀，用酸或碱调节pH至7.4~7.8之间，无菌条件下通过0.22 μ m滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用，使用前添加健康猪血清50ml。
[0025]实施例2
一种猪肺炎支原体培养基，该培养基每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组
分:
PPLO35g
酵母粉2g
葡萄糖15g
1% 酚红0.5ml
氨基酸组合 IOg 复方中药多糖 30g 猪血清80ml。[0026]一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其步骤同实施例1。其中复方中药多糖从黄连10份、银杏叶20份、怀牛膝15份、党参20份、茯苓50份、枸杞20份、甘草15份和丹参5份中提取得到。
[0027]实施例3
一种猪肺炎支原体培养基，该培养基每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分:
PPLO50g
酵母粉IOg
葡萄糖3g
1% 酚红2.5ml
氨基酸组合 2g 复方中药多糖 25g 猪血清100ml。
[0028]一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其步骤同实施例1。其中复方中药多糖从黄连5份、银杏叶10份、怀牛膝20份、党参30份、茯苓5份、枸杞30份、甘草20份和丹参10份中提取得到。
[0029]比较例I本发明所制备的培养基与常用培养基比较试验
IMhp菌株和培养条件
将购自ATCC的猪肺炎支原体J株分别接种实施例1的猪肺炎支原体培养基和现有技术的2种猪肺炎支原体培养基，按5% (V/V)的比例接种猪肺炎支原体于各培养基中，37°C培养，当培养基颜色变黄，PH降至6.4-6.8时，无菌取出培养物。
[0030]2活菌计数(CCU法)
每个菌株培养物取14只无菌试管，每管装4.5ml含猪肺炎支原体培养基，在第I管加入0.5ml生长良好的培养物，混合均匀后，吸取0.5ml加入第2只管，如此进行10倍系列稀释至最后一管，同时设未加菌液的猪肺炎支原体培养基作为阴性对照。试验管作三个重复。系列稀释后将试管放置37°C恒温培养箱中静止培养，每日观察一次，主要观察培养基的颜色变化和浑浊度，连续观察时间为14日，最后发生颜色变化的小管稀释度即为该培养物的CCU滴度。
[0031]3 结果
3.1猪肺炎支原体Z株接种3种培养基3次生长实验CCU测定结果见表1。
[0032]表1猪肺炎支原体Z株接种3种培养基3次生长实验CXU测定结果
【权利要求】
1.一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分: PPLO20 ~50g 酵母粉2~IOg 葡萄糖3~15g 1%酚红0.5~4ml 氨基酸组合 2~IOg 复方中药多糖 15~30g 猪血清50~100ml ； 所述的氨基酸组合中含有L-精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、L-半胱氨酸和丝氨酸； 所述的复方中药多糖从以下中药组合物中提取得到:黄连、银杏叶、怀牛膝、党参、茯苓、枸杞、甘草和丹参。
2.如权利要求1所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于每1000ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分: PPLO30 ~40g`` 酵母粉4~8g 葡萄糖5~IOg 1%酚红I~3ml 氨基酸组合 4~Sg 复方中药多糖 20~25g 猪血清60~80ml。
3.如权利要求1或2所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于所述的氨基酸组合含有L-精氨酸10~30%、甘氨酸5~15%、酪氨酸10~30%、L_半胱氨酸20~40%和丝氨酸10~30%。
4.如权利要求1或2所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于所述的复方中药多糖从以下中药组合物中提取得到:黄连5~15份、银杏叶10~30份、怀牛膝10~20份、党参10~30份、获茶5~50份、构祀10~30份、甘草10~20份和丹参5~15份。
5.如权利要求1所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于所述的复方中药多糖通过以下步骤制得: a、称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次； b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖； d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到复方中药多糖。
6.一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤: O配制磷酸缓冲溶液； 2)从黄连5~15份、银杏叶10~30份、怀牛膝10~20份、党参10~30份、茯苓5~.50份、枸杞10~30份、甘草10~20份和丹参5~15份中提取得到复方中药多糖； 3)称取PPLO20~50g、酵母粉2~10g、葡萄糖3~15g、氨基酸组合2~10g、复方中药多糖15~30g，溶解于步骤I)制得的1000mL磷酸缓冲溶液中，加入1%酚红0.5~4ml充分混匀，用酸或碱调节pH至7.4~7.8之间，无菌条件下通过0.22 μ m滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用，使用前添加健康猪血清50~100ml，得到猪肺炎支原体培养基。
7.如权利要求6所述的一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于所述的步骤.2)中复方中药多糖通过以下步骤制得: a、称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次； b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖； d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到复方中药多糖。
8.如权利要求6所述的一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于所述的步骤.3)中所述的氨基酸组合含有L-精氨酸10~30%、甘氨酸5~15%、酪氨酸10~30%、L_半胱氨酸20~40%和丝氨酸10~30%。
9.如权利要求6所述的一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于所述的步骤.3)中称取PPLO 30~40g、酵母粉7~8g、葡萄糖5~10g、氨基酸组合4~8g、复方中药多糖20~25g，溶解于步骤I)制得的1000mL磷酸缓冲溶液中，加入1%酚红I~3ml充分混匀，用酸或碱调节pH至7.4~7.8之间，无菌条件下通过0.22 μ m滤膜，过滤除菌后置4°C保存备用，使用前添加健康猪血清60~80ml。
【文档编号】C12N1/20GK103555641SQ201310579845
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】张秀文, 李阳, 闫艳丽, 刘雪, 王二先, 盛璐丝 申请人:浙江美保龙生物技术有限公司