郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因；所述蛋白质为如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ?ID?NO.1所示的核酸序列。利用本发明的郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT基因在大肠杆菌细胞中表达，重组的类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶蛋白能促使花色苷与UDP-葡萄糖进行反应，催化生成花色苷。利用本发明的Tf3GT编码序列，在利用转基因技术修饰花色方面具有应用价值。
【专利说明】郁金香类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶Tf 3GT蛋白及其编码基因
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种郁金香类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因。
【背景技术】
[0002]在植物花色形成过程中，UDP-葡萄糖:类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶(UDP-glucose:f lavonoid 3-0-glucosy I transferase, UF3GT, EC 2.4.1.91)催化 UDP-葡萄糖转移到花青素C环的C3羟基位置(Carolye EL, 1996 ；Masako FM，2003)，使无色不稳定的花青素转化成有色稳定的花色素苷。花色素苷以水溶性形式存在于液泡中，所以UF3GT被认为花青素合成途径中不可或缺的酶，糖基化修饰一方面可以提高花青素的稳定性，另一方面可以影响花青素颜色变化。如红色葡萄果皮中能检测到UF3GT基因的大量表达，而白色葡萄果皮中虽然有UF3GT基因但不表达(Boss P K，1996)。此外，在植物中，糖基转移酶不仅影响植物基本的生理代谢，也在植物的防御和抗逆反应中起重要作用。
[0003]编码花色素苷的糖基转移酶基因在许多植物中已经克隆得到，包括龙胆(Gentiana triflora)、矮牵牛(Petunia hybrida)荷兰鳶尾(Iris hollandica)、香雪兰(Freesia hybrida)等。郁金香(Tulipa fosteriana)中类黄酮3_0_葡萄糖基转移酶基因的克隆及其表达模式尚不清楚。目前，未有任何与郁金香UF3GT蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种郁金香类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶Tf3GT的蛋白及其编码基因。本发明公开了郁金香Tf3GT蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式；利用本发明的郁金香Tf3GT基因，在大肠杆菌细胞中表达重组的UF3GT蛋白，该蛋白能促使花色苷与UDP-葡萄糖进行反应，催化生成花色苷；利用本发明的Tf3GT编码序列，在利用转基因技术修饰花色方面具有应用价值；同时，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Tf3GT发生相互用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的，
[0006]第一方面，本发明涉及一种具有郁金香类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵花瓣的不同着色阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
[0007]优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0008]进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0009]第二方面，本发明涉及一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0010]优选的，所述核酸序列具体为:
[0011](a)碱基序列如SEQ ID N0.1第I~1371位所示；
[0012]或(b)与SEQ ID N0.1第I~1371位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0013]或(c)能与SEQ ID N0.1第I~1371位所示的核酸进行杂交的序列。
[0014]优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID N0.1第I~1371位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
[0015]第三方面，本发明涉及一种检测上述的核酸序列的探针，所述探针为具有所述核酸序列8~100个连续核苷酸的核酸分子。该探针可用于检测样品中是否存在编码郁金香FLS相关的核酸分子。
[0016]第四方面，本发明涉及一种上述的核酸序列在制备重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶中的用途。
[0017]优选地，所述制备包括如下步骤:构建含所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，得到重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶。
[0018]第五方面，本发明涉及一种重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶，所述重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶是通过如下方法制备而得的:构建含上述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，即得所述重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶。`
[0019]本发明提供的分尚出的DNA分子,该分子包括:具有SEQ ID N0.1所不核苷酸序列的DNA分子；或者编码具有郁金香Tf3GT蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且与SEQ IDN0.3所示序列有至少70%的同源性；或者能与SEQ ID N0.1所示序列的核苷酸序列杂交。
[0020]在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0021 ] 在本发明中，术语“郁金香类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶蛋白编码序列”指编码具有郁金香Tf3GT蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0.1所示序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.1所示序列的同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID N0.1所示序列中从核苷酸第I~1371位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0022]该术语还包括能编码具有与天然的郁金香Tf3GT相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。
[0023]在本发明中，术语“郁金香类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶Tf 3GT蛋白”是指具有郁金香Tf3GT蛋白活性的SEQ ID N0.2所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香Tf3GT相关相同功能的、SEQ ID N0.2所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香Tf3GT蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0024]本发明的郁金香Tf3GT多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香Tf3GT相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香Tf3GT多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0025]在本发明中，“郁金香Tf3GT保守性变异多肽”指与SEQ ID N0.2所示序列的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0026]表1
[0027]
【权利要求】
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由如SEQID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)SEQID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.2所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.2所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为: (a)喊基序列如SEQ ID N0.1第I~1371位所不； 或(b)与SEQ ID N0.1第I~1371位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能与SEQ ID N0.1第I~1371位所示的核酸进行杂交的序列。
6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQID N0.1第I~1371位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
7.—种检测如权利要求4所述的核酸序列的探针，其特征在于，所述探针为具有所述核酸序列8~100个连续核苷酸的核酸分子。
8.—种如权利要求4所述的核酸序列在制备重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述制备包括如下步骤:构建含所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，得到重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶。
10.一种重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶，其特征在于，所述重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶是通过如下方法制备而得的:构建含如权利要求4所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，即得所述重组类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶。
【文档编号】C12N15/54GK103695382SQ201310689950
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】袁媛, 史益敏, 唐东芹, 马晓红, 陶秀花 申请人:上海交通大学