糖胺聚糖的分离和鉴定的制作方法

糖胺聚糖的分离和鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明涉及糖胺聚糖的分离和鉴定。本发明公开了能够结合至具有肝素结合域的蛋白质的糖胺聚糖的分离和鉴定，以及分离的糖胺聚糖在组织的生长和/或发育中的应用。具体地，本发明提供一种分离能够结合至具有肝素结合域的蛋白质的硫酸乙酰肝素的方法，包括：提供具有附着至支持物的肽分子的固体支持物，其中该肽含有肝素结合域和可选的在N-和C-端中一端或两端的一种或多种附加氨基酸，该附加氨基酸的数量为1-20个；将肽分子与富含硫酸乙酰肝素的糖胺聚糖混合物接触，以容许形成肽-硫酸乙酰肝素复合物；将肽-硫酸乙酰肝素复合物从其余混合物分离出来；从该肽-硫酸乙酰肝素复合物解离硫酸乙酰肝素；收集解离的硫酸乙酰肝素。
【专利说明】糖胺聚糖的分离和鉴定
[0001]本申请是申请日为2009年2月19日的题为“糖胺聚糖的分离和鉴定”的中国专利申请N0.200980144772.X的分案申请
【技术领域】
[0002]本发明涉及能够结合至具有肝素结合域的蛋白质的糖胺聚糖的分离和鉴定，以及分离的所述糖胺聚糖在组织的生长和/或发育中的应用。
【背景技术】
[0003]糖胺聚糖(GAG)是负责实施和调节大量的基本细胞功能的复杂的碳水化合物大分子。
[0004]GAG与数百种已知的肝素结合生长和粘附因子一起调节或介导许多信号系统。认为生长因子与GAG结合，以各种不同的作用，如通过保护其免受蛋白质降解而增长其半寿命，在细胞表面调节这些细胞因子的定位，介导分子相互作用和稳定配体-受体复合物，来调节它们的各种活性。
[0005]已经鉴定的肝素结合生长因子数目一直在增加，已经增加至已知的数百种了，其中大多数都是通过肝素亲合色谱进行纯化的。它们包括大量的成纤维细胞生长因子(FGF)家族，TOGF和多效生长因子以此至细胞因子的TGF-β超家族。该后者细胞因子的家族涵盖了骨诱导的骨形态形成蛋白质(BMP)子家族，因此因为其诱导异位骨形成的能力而得名。
[0006]GAG和生长因子的相互作用的性质和效应仍不清楚。尽管FGF2和在肝素中发现的特殊糖化物序列之间的相互作用已经证实是高亲合性的，但是这一般仍然不清楚其它生长因子和乙酰肝素(heparan)之间的关联是否涉及蛋白质生长因子上的氨基酸序列抗原决定基和GAG中嵌埋的糖化物序列之间的`高亲合性或特异性结合相互作用，或这种关联是否由GAG和蛋白质生长因子之间的较低亲合力、非特异性相互作用介导。
[0007]如果GAG和驻留于、或分泌到、胞外基质中的蛋白质之间的相互作用是特异性的，则结合配对体需要进行鉴定才能弄清楚这些相互作用并理解如何可以使用或调节这些相互作用而提供新的治疗。
[0008]因此，产生的关键问题是，是否存在嵌埋于GAG分子链中的与生长因子多肽骨架中的主要氨基酸序列匹配的糖化物序列，而以绝对的，或至少相对的特异性控制其结合以及生物活性。

【发明内容】

[0009]我们已经发明了一种回答这个问题的方法，其涉及富集显示结合至具有肝素结合域的特殊多肽的糖胺聚糖分子。然后分离的GAG混合物和/或分子能够被识别并对其调节细胞生长与分化和组织表达含肝素结合域的蛋白质的能力进行测试。对于第一次，这能受控分析特定GAG糖化物序列对细胞和组织具体的生长和分化的影响，体外和体内均可。
[0010]因此，本发明的第一方面提供了一种分离能够结合至具有肝素/乙酰肝素结合域的蛋白质的糖胺聚糖的方法，所述方法包括:
[0011](i)提供一种具有附着至支持物的多肽分子的固体支持物，其中所述多肽含有肝素结合域；
[0012](ii)将所述多肽分子与含糖胺聚糖的混合物接触而使之可以形成多肽-糖胺聚糖复合物；
[0013](iii)从所述混合物的剩余物中分离多肽-糖胺聚糖复合物；
[0014](iv)从所述多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；
[0015](V)收集所述解离的糖胺聚糖。
[0016]本发明另一方面，分离的糖胺聚糖通过其调节细胞或组织的生长或分化的能力而进行鉴定。本发明提供了一种鉴定能够刺刺激或抑制细胞和/或组织生长和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括:
[0017](i)提供一种具有附着至支持物的多肽分子的固体支持物，其中所述多肽含有肝素结合域；
[0018](ii)将所述多肽分子与含糖胺聚糖的混合物接触而使之可以形成多肽-糖胺聚糖复合物；
[0019](iii)从所述混合物的剩余物中分离多肽-糖胺聚糖复合物；
[0020]( iv)从所述多肽-糖胺聚糖复合物解离糖胺聚糖；
[0021](V)收集所述解离的糖胺聚糖；
`[0022](Vi)将所述收集的糖胺聚糖加入细胞或组织中，其中存在含所述肝素结合域的氨基酸序列的蛋白质；
[0023](vii)测定以下一种或多种:细胞增殖，细胞分化，一个或多个蛋白质标记物的表达。
[0024]在本发明的实施方式中，含GAG的混合物可以包含合成的糖胺聚糖。然而，在优选的实施方式中，使用了获自细胞或组织的GAG。例如，该混合物可以包含胞外基质，其中这种胞外基质材料通过原位活体组织刮片(即，直接从由获得的人或动物身体中的组织中获得)或通过对已经从人或动物的身体提取的组织(活的或死的)进行刮片而获得。另外，胞外基质物质可以获自培养基中生长的细胞。胞外基质物质可以获自结缔组织或结缔组织细胞，例如骨骼、软骨、肌肉、脂肪、韧带或肌腱。
[0025]GAG组分可以从组织或细胞样品提取或通过本领域内对于技术人员众所周知的系列常规分离步骤(例如，阴离子交换色谱)提取。
[0026]GAG混合物可以包含不同类型的糖胺聚糖的混合物，其可以包括硫酸葡聚糖、硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。在优选的实施方式中，与固体支持物接触的GAG混合物富含这些类型的糖胺聚糖中的一种，最优选硫酸乙酰肝素。富含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素或硫酸葡聚糖的GAG部分可以通过对GAG混合物实施柱色谱分离而获得，例如弱、中或强阴离子交换色谱，以及强高压液相色谱(SAX-HPLC)以选择合适的部分。
[0027]收集的GAG可以进行进一步分析而鉴别GAG，例如测定GAG的组成或序列，或测定GAG的结构特性。GAG结构典型地是高度复杂的，而考虑到当前可以利用的分析技术，在大多数情况下不可能精确检测GAG的序列结构。
[0028]然而，所收集的GAG分子可以进行部分或完全糖化物消化(例如，通过亚硝酸的化学消化或采用裂解酶如肝素酶III的酶消化)而产生都属于GAG的特性和诊断特征的糖化物片断。具体而言，消化产生二糖(或四糖)可以用于测定所获得的每一二糖的百分数，二糖可能提供GAG特征二糖“指纹”。
[0029]GAG的硫酸化形式也能够进行检测而用于确定GAG结构。例如，对于硫酸乙酰肝素，在氨基糖和C2、C3和C6位置的硫酸化形式可以用于表征硫酸乙酰肝素。
[0030]二糖的分析，四糖的分析和硫酸化的分析能够结合其它分析技术如每一种都提供GAG的独特光谱的HPLC、质谱和NMR进行使用。这些技术组合起来可以提供GAG的明确结构表征。
[0031]GAG和肝素结合域之间高亲合力的结合相互作用表明，GAG将含有有助于高亲合力结合的相互作用的特异性糖化物序列。其它步骤可以包括确定参与结合相互作用的GAG的完整或部分糖化物序列，或GAG的关键部分。
[0032]在一个实施方式中，GAG-多肽复合物可以采用裂解糖胺聚糖链的试剂，例如裂解酶进行处理。裂解酶处理可以切开并未参与与多肽的结合相互作用的结合GAG部分。参与与多肽结合相互作用的GAG部分可以免受裂解酶作用。在除去裂解酶之后，例如，在冲洗步骤之后，保持结合至多肽的GAG分子代表多肽的特异性结合配体(“GAG配体”)。由于较短的GAG分子的较低复杂性，GAG配体的解离和收集之后，能够期望进行GAG配体的较高程度的结构表征。例如，任何糖化物序列(即，包含于GAG配体中单糖的主要(线性)序列)、硫酸化方式、二糖和/或四糖消化分析、NMR谱图、质谱图和HPLC谱图的组合可以提供GAG配体的高水平结构表征。
[0033]在本发明的一方面，提供的GAG具有BMP2的高结合亲合性。更优选GAG是硫酸乙酰肝素(HS)。HS从通过以下本发明的方法获自成骨细胞的胞外基质的GAG混合物分离出来，其中包含BMP2的肝素结合域(SEQ ID NO:1)的多肽连接至固体支持物而可以形成GAG-多肽复合物。GAG组分从GAG-多肽复合物解离导致分离出本文中称之为“HS/BMP2”的独特HS。
[0034]因此，本发明一方面提供了 HS/BMP2。HS/BMP2可以以独立的或纯化的形式提供。在另一方面提供了包含HS/BMP2的培养基。
[0035]在本发明的另一方面，提供了一种包含HS/BMP2的药物组合物或药物，可选地与药用载体、佐剂或稀释剂组合。在一些实施方式中，药物组合物或药物可以进一步包含BMP2蛋白质。提供的包含HS/BMP2的药物组合物或药物用于预防或治疗损伤或疾病。本发明也提供了 HS/BMP2在预防或治疗损伤或疾病的药物生产中的应用。
[0036]在本发明的其他方面，提供了在其需要这种治疗的患者中预防或治疗损伤或疾病的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的HS/BMP2。给予的HS/BMP2可以配制于合适的药物组合物或药物中并可以进一步包含药用载体、佐剂或稀释剂。可选地，这种药物组合物或药物也可以包含BMP2蛋白质。
[0037]本发明另一方面提供了促进或抑制骨生成(骨骼细胞和/或骨骼组织的形成)的方法，包括给予骨前体细胞或骨干细胞HS/BMP2。
[0038]本发明另一方面提供了促进或抑制软骨组织的形成(软骨发生)的方法，包括给予软骨前体细胞或软骨干细胞HS/BMP2。
[0039]刺激或抑制骨生成或软骨组织的形成的方法可以通过将骨骼或软骨前体或干细胞与HS/BMP2接触，可选地，在外加的BMP2蛋白质的存在下而体外实施。前体细胞或干细胞可以是间充质干细胞。在组织形成受促进时，可以收集形成的组织而用于移植入人体或动物患者中。
[0040]因此，本发明一方面，提供了其中所述结缔组织通过在HS/BMP2(即，外源HS/BMP2)的存在下，可选地在BMP2 (即，外源BMP2)的存在下体外培养间充质干细胞而获得的结缔组织。这种结缔组织可以是骨骼、软骨、肌肉、脂肪、韧带或肌腱。
[0041]采用HS/BMP2预防或治疗疾病可以涉及到组织，尤其是结缔组织如骨骼、软骨、肌肉、脂肪、韧带或肌腱的修复、再生或替代。
[0042]在具有这些组织中的一种受损的患者中，给予受损的位置HS/BMP2可以用于刺激该位置的组织生长、增殖和/或分化。例如，刺激给药位置处存在或附近的间充质干细胞，优选在该位置也存在BMP2时，可以导致间充质干细胞增殖和分化成合适的结缔组织，由此提供受损组织的替代/再生和损伤治疗。
[0043]可替换地，可以收集由接触HS/BMP2的间充质干细胞体外培养获得的结缔组织并移植于在损伤或疾病位置而替代受损或恶化的组织。受损或恶化的组织可选地首先从损伤或疾病位置切除。
[0044]另一方面，可以提供一种包含干细胞，优选间充质干细胞，和HS/BMP2的药物组合物。在损伤、疾病或恶化的位置给药，例如注射该组合物提供了该位置处的组织再生。
[0045]因此，HS/BMP2适用于通过向需要治疗的患者直接施用HS/BMP2，可选地组合BMP2和/或干细胞而实施的体内伤口愈合，包括组织修复、再生和/或代替(例如疤痕组织或断裂骨骼的愈合)。HS/BMP2也适用于体外产生适用于植入需要组织修复、再生和/或代替的患者的组织。
[0046]优选实施方式的说明
[0047]本发明涉及GAG，尤其涉`及富集包含结合至对应于结合肝素/乙酰肝素)的蛋白质的肝素结合域的多肽(“肝素结合因子”)的一种或多种GAG的化合物的混合物的方法。这种富集导致GAG分离，无论是作为含不同GAG的混合物或结构或功能上相同(或基本相同)的GAG的种群。富集的混合物优选对肝素结合因子具有调节作用。
[0048]本发明也涉及富含一种或多种对肝素/乙酰肝素结合因子具有调节作用的GAG的化合物的混合物，以及使用这种混合物的方法。
[0049]本发明也涉及增强(例如,激动)BMP-2活性和由此刺激干细胞增殖和骨骼形成能力的GAG分子。
[0050]正如本文中所用术语“富集”、“浓缩”、“富含”等都是描述一种处理(或状态)，其中混合物的相对组成被(或已经)按照这种方式改变以使该混合物中的一种或多种成分的分数升高，而同时该混合物中的一种或多种不同的成分的分数降低。
[0051]通过富集而分离的GAG可以是纯的，即基本上仅仅含有一种类型的GAG，或可以仍然是一种不同类型的GAG的混合物，该混合物相对于起始混合物具有较高比例的结合于肝素结合域的特殊GAG。
[0052]通过本发明鉴定的GAG优选是当与其中表达或包含含肝素结合域的蛋白质的细胞或组织接触时表现出功能效应的GAG。这种功能效应可以是调节或强化效应。
[0053]这种功能效应可以是促进(刺激)或抑制某些类型的细胞增殖或从一种细胞类型向另一种分化，或一种或多种蛋白质标记的表达。例如，GAG可以促进细胞增殖，即细胞数量增加，或促进干细胞向特异化细胞类型的分化(例如，结缔组织中的间充质干细胞)，促进或抑制指示细胞的多能性或分化状态的蛋白质标记的表达(例如，这些标记如碱性磷酸酶活性，检测RUNX2、成骨相关转录因子(osterix)、胶原I，II，IV，VII，X、骨桥蛋白质、骨钙素、BSPI1、S0X9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增强子结合蛋白质-α (C/ΕΒΡα )、脂肪细胞脂质结合蛋白质(ALBP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白2、(BSPII)、胶原2al (Coll2a)和S0X9)。
[0054]正如本文中所用术语“调节效应”应该理解为是指第一种物质对第二种物质具有的效应，其中第二种物质在另一过程或多个过程中的正常功能通过第一种物质的存在而改变。在本发明优选的实施方式中，调节效应可以是激动性的或拮抗性的。
[0055]调节效应可以是强化效应。术语“强化效应”应该理解为是指提高效能的效应。在本发明优选的实施方式中，术语“强化效应”是指第一种物质对第二种物质所具有的效应，其效应提高了第二种物质在另一过程或多个过程中的效能。在本发明其他的优选实施方式中，强化效应应该理解为是指分离的GAG对肝素结合因子的效应，其中所述效应提高了所述肝素结合因子的效能。
[0056]在本发明优选的实施方式中，强化效应是肝素结合因子的生物利用度提高。在本发明优选的实 施方式中，强化效应是BMP2的生物利用度提高。测定肝素结合因子生物利用度提高的方法是通过检测肝素结合因子局部浓度的升高。
[0057]在本发明另一实施方式中，强化效应是保护肝素结合因子不受降解作用。在本发明尤其优选的实施方式中，强化效应是保护BMP-2不受降解作用。检测肝素结合因子降解减少的一种方法是通过测定肝素结合因子的半衰期提高。
[0058]在本发明的另一实施方式中，强化效应是将肝素结合因子与细胞受体隔绝。在本发明的另一实施方式中，强化效应是稳定配体-受体的相互作用。
[0059]强化效应(例如，生长或分化的调节)可以通过使用合适的分析法进行检测。例如，HS对BMP-2的稳定性所具有的效应可以通过ELISA进行检测。HS对BMP-2活性所具有的效应可以测定SMADl、5或8中的一种或多种的活化/表达，或测定一种或多种成骨标记基因如Runx2、碱性磷酸酶、成骨相关转录因子(osterix)、骨钙素和BSPl的表达，或使用染色如菌素红和冯库萨(von Kossa)染色而测定矿化作用的水平。
[0060]正如本文中所用“接触”的过程涉及使两种或多种分开的物质物理上彼此靠近。“接触”过程涉及使两种或多种分开的物质靠近一段时间，而在某些条件下，足以容许那些两种或多种离散存在物中的部分在分子水平上相互作用。优选地，正如本文中所用，“接触”的过程涉及使含有一种或多种GAG的化合物的混合物与对应于肝素结合因子的肝素结合域的多肽彼此附近。“接触”的过程的实例包括混合、溶解、膨胀、冲洗。在优选的实施方式中，GAG混合物和多肽的“接触”足以形成复合物，该复合物可以是表现出相互之间的高亲合性的GAG和多肽之间的共价键，但优选是非共价键。
[0061]这种多肽可以包含具有肝素结合域的所选蛋白质的全长或接近全长的一级氨基酸序列。由于在较长的多肽中可能出现的折叠导致掩蔽肝素结合域与GAG混合物接触，因此这种多肽优选是短的。优选地，这种多肽具有包含肝素结合域并且可选地在肽的N-和C-端中一端或两端包含一种或多种氨基酸的氨基酸序列。这些附加的肽使连接子(linker)或连接分子(attachment molecule)能够加入到这些多肽中，而这对将多肽连接至固体支持物是必需的。
[0062]在优选的实施方式中，除了肝素结合域中氨基酸的数量之外，多肽含有I~20个，更优选I~10个，更加优选I~5个附加氨基酸。在一些实施方式中，肝素结合域的氨基酸序列占多肽氨基酸的至少80%，更优选至少90%，更加优选至少95%。
[0063]为了将多肽附着到固体支持物的表面上，优选对这些多肽进行改性以包含分子标签，而固体支持物表面经过改性而引入具有对该分子标签具有高亲合力的对应分子探针，即分子标签和探针形成结合对。在优选的实施方式中，这种标签和/或探针选自以下任意之一:抗体、细胞受体、配体、生物素、这些结构的任何片段或衍生物、前述的任何组合、或能够设计或构造探针而与之结合或另外通过特异性联合的任何其它结构。适于作为标签和探针使用的优选结合对是生物素和抗生物素蛋白。
[0064]这种多肽优选衍生自感兴趣的蛋白质。对于“衍生自”是指多肽因为其含有感兴趣蛋白质中存在的肝素结合域的氨基酸序列而被选择、挑选或制备。在一些实施方式中，肝素结合域的氨基酸序列可以由感兴趣的蛋白质中所显示出的序列进行改变，例如，为了研究肝素结合域序列中的变化对GAG结合的影响，。
[0065]感兴趣的蛋白质可以是任何结合肝素的蛋白质，而因此具有肝素结合域。优选的蛋白质包括那些表达于胞外基质中，尤其是在结缔组织的胞外基质(例如，骨骼、软骨、肌肉、肌膜、朝带、脂肪)中的蛋白质。
[0066]优选蛋白质及其肝素结合域列于下表:
[0067]
【权利要求】
1.一种分离能够结合至具有肝素结合域的蛋白质的硫酸乙酰肝素的方法，所述方法包括: (i)提供具有附着至支持物的肽分子的固体支持物，其中所述肽含有肝素结合域和可选的在N-和C-端中一端或两端的一种或多种附加氨基酸，其中所述附加氨基酸的数量为1-20 个； (ii)将所述肽分子与富含硫酸乙酰肝素的糖胺聚糖混合物接触，以使容许形成肽-硫酸乙酰肝素复合物； (iii)将肽-硫酸乙酰肝素复合物从其余混合物分离出来； (iv)从所述肽-硫酸乙酰肝素复合物解离硫酸乙酰肝素； (v)收集解离的所述硫酸乙酰肝素。
2.一种鉴定能够刺激或抑制细胞和/或组织的生长和/或分化的硫酸乙酰肝素的方法，所述方法包括: (i)提供一种具有附着至支持物的肽分子的固体支持物，其中所述肽含有肝素结合域和可选的在N-和C-端中一端或两端的一种或多种附加氨基酸，其中所述附加氨基酸的数量为1-20个； (ii)将所述肽分子与富含硫酸乙酰肝素的糖`胺聚糖混合物接触，以使容许形成肽-硫酸乙酰肝素复合物； (iii)将肽-硫酸乙酰肝素复合物从其余混合物分离出来； (iv)从所述肽-硫酸乙酰肝素复合物解离硫酸乙酰肝素； (v)收集解离的所述硫酸乙酰肝素； (vi)将收集的所述硫酸乙酰肝素加入其中存在含所述肝素结合域的氨基酸序列的蛋白质的细胞或组织中； (vii)测定以下一种或多种:细胞增殖、细胞分化、一种或多种蛋白质标记的表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括通过改变所述固体支持物的表面上存在的盐浓度，选择出对所述肝素结合域具有最高亲合性和/或特异性的硫酸乙酰肝素。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述方法包括获得对所述肽的结合亲和性小于I U M的硫酸乙酰肝素。
5.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将收集的所述硫酸乙酰肝素进行进一步分析以便确定所述硫酸乙酰肝素的结构特性。
6.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述肽-硫酸乙酰肝素复合物与裂解酶接触。
7.一种通过权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法获得的分离的硫酸乙酰肝素。
【文档编号】C12Q1/02GK103739743SQ201310690150
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2009年2月19日 优先权日:2008年9月11日
【发明者】西蒙·麦肯齐·库尔, 维克托·努尔科姆比, 克里斯蒂安·多姆布劳斯基 申请人:新加坡科技研究局