从经基因改造的微生物生产黏康酸的制作方法
【专利摘要】本发明处于使用生物催化剂生产可再生化学原料的领域，该生物催化剂已经经基因改造增加了其将可再生碳源转化成有用化合物的能力。更具体而言，本发明提供利用基因修饰的生物体生产黏康酸形式的可再生碳源的方法。
【专利说明】从经基因改造的微生物生产黏康酸
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年1月30日提交的美国临时申请系列号61/632, 777的优先 权益。 发明领域
[0003] 本发明处于使用生物催化剂生产可再生化学原料的领域，该生物催化剂已经经基 因改造增加了其将可再生碳源转化成有用化合物的能力。更具体而言，本发明提供利用基 因改造的生物催化剂从可再生碳源生产黏康酸异构体的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 己二酸是在尼龙66的制造中使用的大量化学品。己二酸目前是由石化产品制备， 但合成并不是环境友好的（Niu等人，2002)。备选地，己二酸可以由黏康酸的三种异构体 (顺，顺；顺，反；反，反）中的任一者经化学氢化作用制得。通过用微生物进行发酵从可再 生资源生产黏康酸、接着氢化成己二酸将会是令人合意的，因为这样的至己二酸的途径将 比传统的石化途径更加环境友好。
[0006] 目前针对微生物生产黏康酸的努力可以分组到三个类别，即：（1)用于黏康酸 生产的芳族降解通路，其中供给多种芳族化合物，且芳族化合物的苯环部分氧化切割而 打开；（2)黏康酸盐积累（buildup)通路，其中黏康酸骨架从多种C2、C3、C4化合物或 赖氨酸形成；和（3)芳族氨基酸生物合成黏康酸通路，其中黏康酸从3-脱氢莽草酸盐 (3-dehydroshikimate)形成,所述3-脱氢莽草酸盐是许多生物体中芳族氨基酸生物合成 通路中的中间体。
[0007] 许多微生物能够利用这样的通路来降解含有苯环的芳族化合物例如苯酚、儿茶 酚和苯甲酸，该通路切割芳环得到非芳族化合物的终末化合物或中间体化合物，例如顺， 顺 -黏康酸、或3-羧基-顺，顺-黏康酸（Niu等人，2002 ;Perez-Panto ja等人，2008)。过去， 许多小组已经尝试开发微生物以工业水平生产顺，顺-黏康酸的能力（Mizuno等人，1988 ; Yoshikawa 等人，1990 ;Choi 等人，1997)。在 1980 年代末，美国的 Celgene Corporation 和 日本的Mitsubishi Chemical Industries分别积极研发从甲苯和苯甲酸制造黏康酸的方 法，这由该领域中多项已授权的美国专利和日本专利所证实。
[0008] 多种微生物已经被报道为利用甲苯、苯甲酸、苯或儿茶酚生产顺，顺-黏康酸。例 如，以儿茶酚作为碳源，利用表达CatA基因的重组大肠杆菌（E. coli)细胞可以以近乎 100%的摩尔转化产率实现顺，顺-黏康酸生产，所述catA基因编码作为生物催化剂负责催 化儿茶酚的邻位切割的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)mt_2儿茶酚1，2-双加氧酶 (Kaneko等人，2011)。利用该体系用于连续生产黏康酸的生物反应器已有过记载。
[0009] 利用环状C6碳化合物进行顺，顺-黏康酸的微生物生产的此方法从未在商业上实 现；然而，在理解用于微生物中的黏康酸生产的降解通路中的酶的功能作用方面有着持续 的学术兴趣。
[0010] 近来公开的国际专利申请（W0 2011/017560)要求保护具有黏康酸盐通路的生物 催化剂和利用这些生物催化剂来生产黏康酸的方法。简而言之，这件公开的专利申请公 布了四种不同的生产黏康酸的通路。第一种用于黏康酸生产的通路以琥珀酰-CoA和乙 酰-CoA起始。第二种用于黏康酸生产的通路以丙酮酸和丙二酸半醛起始。第三种用于黏康 酸生产的通路以丙酮酸和琥珀酸半醛起始。第四种用于黏康酸生产的通路以赖氨酸起始。 在此专利申请中提出的所有这些用于黏康酸生产的通路都是基于计算机建模，而这些生物 催化剂究竟能否产生为具备商业上可接受的黏康酸生产力和产率还有待观察。
[0011] 利用基因改造的大肠杆菌体系的得到顺，顺-黏康酸的发酵途径已经记载于科 学文献（Niu 等人，2002)和专利文献（US 5,616,496;US 5,487,987;TO 2011/085311 Al)中，但现有技术方法在用于大规模商业生产从而有经济吸引力的滴度、产率和适用 性方面需要实质改进。已有两例经基因改造以从葡萄糖生产顺，顺-黏康酸的酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)酵母菌的报道，但公开的滴度仅为I. 5mg/l和140mg/ I (Weber等人，2012 ;Curran等人，2012)。在这些滴度下，这些酵母方法对于商业生产无一 有吸引力。本发明描述了通过在用于大规模商业生产的适用性方面与领域内已知的公开方 法相比有实质改进的发酵来生产顺，顺-黏康酸或顺，反-黏康酸的方法。
[0012] 本文公开的本发明的目的之一是利用适用于大规模商业生产的基因改造的生物 体，通过微生物发酵来生产顺，顺-黏康酸，该发酵起始于可再生的非芳族碳源例如糖或其 它可源自光合作用植物的简单的碳化合物。
[0013] 在2002年，Niu等人公开了这样的生产己二酸的"无苯"途径，其利用发酵方法生 产顺，顺-黏康酸，然后是催化化学方法将顺，顺-黏康酸转化成己二酸。该方法获得专利 权，但据本发明人所知，该方法尚未商业化（US 5, 487, 987 ;US 5, 616, 496)。此公开方法的 发酵部分利用基因改造的大肠杆菌菌株，其最佳者命名为WNl/pWN2. 248。该通路利用天然 的芳族氨基酸生物合成通路（也称为"莽草酸通路"、"莽草酸盐通路"、"分支酸酯通路"、"共 同芳族通路"、"中心芳族通路"，或简单地为"芳族通路"，部分示于图1中）的一部分。在此 说明书中，在供给至生物体的碳源（如葡萄糖）下游的、和直接或间接通向分支酸的任何生 化步骤被视为莽草酸通路的一部分，包括，例如由Glf、Glk、Zwf、TktA、TalB和Pps催化的步 骤。此外，该公开的方法利用三种异源的酶，所述异源的酶经由中间体原儿茶酸和儿茶酚将 3_脱氢莽草酸盐（芳族通路中的中间体）转化成顺，顺-黏康酸。改造的宿主菌株是大肠 杆菌 K-12 的衍生物，其具有 aroE353, serA: : (aroB, aroZ)，IacZ: : (tktA, aroZ)基因型，其 中aroB编码3-脱氢奎尼酸合酶（以下称为AroB)，tktA编码转酮醇酶，且aroZ是来自肺 炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae)的编码3-脱氢莽草酸脱水酶（以下称为"AroZ"） 的异源的基因。该改造的菌株含有多拷贝质粒PWN2. 248,其衍生自pBR322且含有用于表 达catA、catX、aroY、aroF (反馈抗性的）、serA、IacIq和氨节青霉素抗性的基因盒。异源 的基因 catA和catX来自乙酸I丐不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus)且编码儿茶酌? 1，2_双加氧酶（以下称为"CatA"）和功能未知的可能增强CatA活性的蛋白（"CatX"）。 在文献中，catX基因也称为"orfl"（Neidle和0rnston，1986)。在本专利说明书中，我们 要将来自不动杆菌属（Acinetobacter)的catA加 catX基因对称为"catAX."。异源基因 aroY来自肺炎克雷伯杆菌且编码原儿茶酸脱羧酶（以下称为"AroY"）。
[0014] 与上述授权专利相关的较新的专利申请已经公开（W0 2011/085311 Al)。在此 申请中，利用同样的上述菌株WNl/pWN2. 248来生产顺，顺-黏康酸，其随后被异构化成顺， 反-黏康酸。
[0015] 然而，菌株WN1/PWN2. 248并不能良好地适用于大规模商业生产，因此对于更加改 进的方法有需求。本发明提供用于顺，顺-黏康酸的发酵生产的改进的生物催化剂。
[0016] WO 2011/085311 Al中记载的方法具有数个其它特征，这些特征使得不能实现商 业大规模实施。顺，顺-黏康酸的发酵生产中使用的生物催化剂WNl/pWN2. 248中所包含 的ar〇E353突变的发挥作用以阻断碳流入莽草酸盐通路的较下部分，从而使进入得到顺， 顺-黏康酸的期望通路的碳流最大化。但aroE突变是"无效"突变（使基因对于所有实际 目的都失活的突变），其具有将菌株变成芳族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和芳族 维生素或莽草酸盐通路产生的维生素样中间体（对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸和2, 3-二羟 基苯甲酸）的营养缺陷型的作用。芳族氨基酸相对昂贵，并且其需求将会对生产顺，顺-黏 康酸的成本增加大量负担。因此，对于不需要向生产介质中添加这些昂贵的营养素的方法 也存在需求。
[0017] 与目前可得的用于生产顺，顺-黏康酸的生物催化剂相关的再一问题涉及到维持 多拷贝质粒以表达一些必需基因的需求（Niu等人，2002)。多拷贝质粒经常太不稳定而不 能用于大规模工业方法。而且，质粒上基因中的至少一个从启动子Pta。表达，其需要异丙基 硫代半乳糖苷（IPTG)或乳糖来诱导，而这两种化学品对于允许在经济上有吸引力的方法 而言太过昂贵。因此，对于具有稳定整合到生产菌的染色体中的表达盒的更稳定菌株存在 需求，并且对于从组成型启动子高水平表达从而减轻对用于启动子的化学诱导物的需求也 存在需求。
[0018] 发明概述
[0019] 本发明提供从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的基因改造的微生物。该基因 改造微生物不需要包含任何外源质粒以生产黏康酸，尽管它们具有某些实现期望的表型所 必需的外源或异源基因。引入到微生物中的外源基因稳定地整合到染色体DNA中。作为外 源基因的此染色体DNA整合的结果，使用抗生素或其它选择性方法以维持携带外源DNA的 质粒的需求全部消除。此外，使用不需要化学诱导物的强启动子来表达从碳源如葡萄糖至 顺，顺-黏康酸的通路所必需的基因。
[0020] 在本发明的一个实施方案中，芳族氨基酸生物合成的负调节物的活性受基因操 纵。在本发明的一个方面，负调节物TyrR的活性通过控制编码TyrR蛋白的tyrR基因的 表达而实质降低。在本发明的另一方面，负调节物TyrR的活性通过将来自微生物的染色体 DNA的tyrR基因缺失或失活而完全消除。
[0021] 在本发明的另一实施方案中，因某些代谢物引起的芳族氨基酸通路中某些酶的反 馈抑制通过基因操纵而克服。在大多数野生型大肠杆菌菌株中，脱氧阿拉伯-庚酮糖酸 磷酸（DAHP)合酶作为已知由三种不同基因即aroG、aroF和aroH编码的三种不同的异 构酶出现。由该三种基因中的每种编码的蛋白受到负责芳族氨基酸生物合成的莽草酸通路 的一种或多种代谢物的反馈抑制。在本发明的一个方面，野生型aroG基因被修饰的aroG 基因取代，所述修饰的aroG基因编码抵抗微生物细胞中芳族氨基酸通路的一种或多种代 谢物的反馈抑制的AroG蛋白。在本发明的另一方面，野生型aroF基因被这样的aroF基因 取代，所述aroF基因编码抵抗微生物细胞中芳族氨基酸通路的一种或多种代谢物的反馈 抑制的AroF蛋白。在本发明的另一方面，野生型aroH基因被这样的aroH基因取代，所述 aroH基因编码抵抗微生物细胞中芳族氨基酸通路的一种或多种代谢物的反馈抑制的AroH 蛋白。在本发明的另一实施方案中，选择用于顺，顺-黏康酸的商业生产的生物催化剂可以 具有多于一种的抵抗脱氧阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸（DAHP)合酶的反馈的异构酶。
[0022] 在本发明的另一实施方案中，通过在微生物细胞中的芳族氨基酸通路参与到碳流 中的一种或多种酶的活性被增强。在本发明的一个方面，参与到芳族氨基酸通路和/或黏 康酸通路的运转中的一种或多种酶的活性的增强通过基因操纵而实现。在本发明的优选实 施方案中，一种或多种编码酶或蛋白 AroF、AroG、AroH、AroB、TktA、TalB、AroZ、QutC、qa_4、 asbF、QuiC、AroY、Rpe、Rpi、Pps、CatA和CatX或其同源物或类似物的基因的表达被增强， 导致增强的所述酶的活性。Rpe是核酮糖-5-磷酸差向异构酶，Rpi是核酮糖-5-磷酸异构 酶，且Pps是磷酸烯醇丙酮酸合成酶（Neidhardt和Curtiss, 1996)。如果宿主菌株是酵母 (如酿酒酵母），或丝状真菌（如粗糙脉孢菌（Neurospora crassa))，数种催化莽草酸盐通 路中的反应的酶可以组合成一个大蛋白或多肽，称为Arolp，在酿酒酵母情形中由AROl基 因编码。AroIp组合了 AroB、AroD、AroE、AroK (或AroL)和AroA的功能。这样，出于本发 明的目的，Arolp和AROl或其部分可以作为AroB、AroD、AroE、AroK和/或AroA的替代物 使用、或者在AroB、AroD、AroE、AroK和/或AroA之外使用。
[0023] 在本发明的另一实施方案中，细菌细胞中经由赤藓糖-4-磷酸的通量通过过表达 戊糖磷酸通路的运转中的酶而增强。在本发明的一个方面，由talB或talA基因编码的转 醛醇酶的超量产生被工程化。在本发明的另一方面，编码转醛醇酶和转酮醇酶的基因的表 达均通过基因操纵而增强。在本发明的另一方面，编码核酮糖-5-磷酸差向异构酶和核酮 糖-5-磷酸异构酶之一或二者的基因的表达通过基因操纵而增强。
[0024] 在本发明的另一实施方案中，可用于芳族氨基酸通路的运作的PEP (磷酸烯醇丙 酮酸）通过基因操纵而增加。在本发明的一个方面，对PEP池的竞争通过以用于葡萄糖摄 取的PEP独立性体系消除和/或补偿用于葡萄糖摄取的PEP依赖性磷酸转移酶体系（PTS) 而降低。在本发明的另一实施方案中，PEP的可得性通过增加编码PEP合成酶的基因如pps 的表达而增加。 附图简介
[0025] 图1.大肠杆菌中用于芳族氨基酸生物合成的通路。
[0026] 图2.大肠杆菌中用于黏康酸生产的通路。
[0027] 图3.显示用于全部黏康酸和生化中间体的HPLC分析的标准物的色谱。
[0028] 图4.显示用于黏康酸异构体的HPLC分析的标准物的色谱。
[0029] 图5.在用质粒pCP32AMP、pCP14和pCP54转化的大肠杆菌菌株MYR34中生产DHS 的滴度。大肠杆菌的MYR34菌株具有aroE基因缺失。质粒pCP32AMP表达编码DAHP合酶 的aroG基因。质粒pCP14表达编码DHQ合酶的aroB基因。质粒pCP54表达aroB和aroG 基因-者。
[0030] 图6.在用质粒pCP32AMP和pCP54转化的大肠杆菌菌株MYR34和MYR170中生产 DHS的滴度。大肠杆菌的MYR34菌株具有aroE基因缺失。MYR170菌株具有aroE基因缺失 和在宿主染色体DNA的ack基因座处整合的处于P 15启动子控制下的aroB基因的第二拷 贝。质粒PCP32AMP表达编码DAHP合酶的aroG基因。质粒pCP54表达aroB和aroG基因 二者。
[0031] 图7.在仅用质粒PMG37或用PMG37和PCP32AMP质粒二者转化的大肠杆菌菌株 MYR34和MYR170中生产顺，顺-黏康酸的滴度。大肠杆菌MYR34菌株具有aroE基因缺失。 MYR170菌株具有aroE基因缺失和在宿主染色体DNA的ack基因座处整合的处于P15启动 子控制下的aroB基因的第二拷贝。质粒pCP32AMP表达编码DAHP合酶的aroG基因。质粒 PMG37表达编码在黏康酸通路中起作用的蛋白的aroZ、aroY和catAX基因。
[0032] 图8.在仅用表达aroG基因的质粒（pCP32AMP)或同时表达aroG和tktA基因的 质粒（PCP50)转化的大肠杆菌MYR170菌株中生产DHS的滴度。MYR170菌株具有aroE基因 缺失和在宿主染色体DNA的ack基因座处整合的处于P 15启动子控制下的aroB基因的第二 拷贝。
[0033] 图9?来自用质粒pCP32AMP和pCP50转化的大肠杆菌MYR34和MYR170菌株的DHS 产率。DHS产率计算为每克消耗的葡萄糖所产生的DHS克数。质粒pCP32AMP表达aroG基 因，而PCP50表达aroG和tktA。细菌菌株MYR34具有aroE基因缺失。大肠杆菌MYRl70菌 株衍生自MYR34且具有在染色体DNA上的ack基因座处整合的额外的aroB基因。
[0034] 图10.来自用质粒pCP32AMP和pCP50转化的大肠杆菌MYR170和MYR261菌株的 DHS滴度。质粒pCP32AMP表达aroG基因，而pCP50表达aroB和tktA基因。MYR170菌株具 有aroE基因缺失和在宿主染色体DNA的ack基因座处整合的处于P 15启动子控制下的aroB 基因的第二拷贝。大肠杆菌MYR261菌株衍生自大肠杆菌MYR170菌株。大肠杆菌MYR261 菌株具有在染色体DNA的poxB基因座处整合的tktA基因的第二拷贝及其天然启动子。
[0035] 图11.大肠杆菌菌株MYR170、MYR261和MYR305中的黏康酸和乙酸生产，这些菌株 转化有表达编码莽草酸生物合成通路中的DAHP合酶的aroG的质粒pCP32AMP和表达编码 在黏康酸通路中起作用的蛋白的ar 〇Z、ar〇Y和catAX基因的质粒pMG37。MYR170菌株具有 aroE基因缺失和在宿主染色体DNA中ack基因座处插入的处于P15启动子控制下的aroB基 因的额外拷贝。MYR261和MYR305是MYR170菌株的衍生物。MYR261具有在宿主染色体DNA 上的PoxB基因座处整合的tktA基因的额外拷贝，而MYR305在宿主染色体DNA上的poxB 基因座处具有缺失
[0036] 图12.由大肠杆菌菌株MYR34产生的内源性DHS向黏康酸的转化。大肠杆菌MYR34 菌株在编码莽草酸脱氢酶的aroE基因中具有缺失。因此，存在DHS的积累。当MYR34菌株 用表达在黏康酸通路中起作用的蛋白的编码基因 aroZ、aroY和catAX的质粒转化时，DHS 转化成黏康酸。然而，当用无任何外源基因的空质粒载体（PCL1921)转化MYR34菌株时，没 有出现DHS转化成黏康酸。
[0037] 图13. aroZ同源物将DHS转入黏康酸通路中的能力的比较。将三种不同的 aroZ同源物，即来自不动杆菌属物种ADPl的quiC、来自苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)的asbF和来自粗糙脉孢菌的qa-4克隆到还分别自P 15和X Pk启动子表达 catAX和aroY基因的低拷贝质粒中P26启动子下。通过转化使这三种不同的质粒构建体在 MYR34中表达，并测量所产生的黏康酸的量。
[0038] 图14.将单拷贝的catAX、aroY和quiC染色体整合到大肠杆菌MYR170菌株 (AaroE，Aack ::P15-aroB)中，产生MYR352(SEQ ID No.41)。还用携带黏康酸通路运作所 需的所有基因的低拷贝质粒PMG37转化MYR170,得到MYR219菌株。用YEp24(中拷贝的空 载体）或PCP32AMP (中拷贝的aroG表达质粒）或pCP50 (中拷贝aroG和tktA表达质粒） 转化MYR352和MYR219,并使用HPLC方法对产生的PCA、儿茶酚和黏康酸的量进行定量。
[0039] 图15.通过增加 catAX的表达来去除MYR352中的儿茶酚积累。对MYR352转化仅 表达aroY的质粒（pMG27)或仅表达quiC的质粒（pMG39)或表达所有三种黏康酸通路基因 即catAX、aroY和quiC的质粒（pMG37)或仅表达黏康酸通路中的两种基因即catAX和aroY 的质粒（PMG33)。仅catAX的过表达足以防止儿茶酚积累。
[0040] 图16.利用不同体系输入葡萄糖的菌株的生长。PtsHI和galP(MYR31)的缺失导 致在基本葡萄糖培养基中生长不足，而安置gif和glk基因（MYR217)挽回生长。对照菌株 MYR34是A ar〇E，否则则是野生型。向培养基中添加三种芳族氨基酸和三种芳族维生素以 允许营养缺陷型菌株的生长。
[0041] 图17.大肠杆菌MYR34和MYR217菌株中的DHS生产。当用导致DHS生产的质粒 转化时，利用glf-glk用于葡萄糖输入的MYR217较之利用磷酸转移酶体系（PTS)的MYR34 的转化子产生更高滴度的DHS。
[0042] 图18.在7升发酵罐中以大肠杆菌MYR428菌株进行的黏康酸生产。对用质粒 PCP32AMP 和 pMG37 转化具有 A aroE A ackA: : P15-aroB A p〇xB: : tktA 基因型的大肠杆菌 MYR261菌株以产生大肠杆菌MYR428菌株。
[0043] 优选实施方式详述
[0044] 如本专利申请中所用，短语"例如"或"如"意指对于当下主题存在多于一种的方 法、途径、方案或物质组成，且给出的实例并不意在局限于该实例。
[0045] 术语"异源的"是指并非在生物体中天然或原生发现、但可以通过基因改造如通过 转化、交配或转导而引入到生物体中的基因或蛋白。异源基因可以整合（插入）到染色体 中或包含于质粒上。术语"外源的"是指出于提高、降低或消除活性的目的通过基因改造如 通过转化、交配、转导或突变已经引入到生物体中或在生物体中改变的基因或蛋白。外源基 因或蛋白可以是异源的，或者其可以是对于宿主生物体为原生但通过一种或多种方法例如 突变、缺失、改变启动子、改变终止子、重复或者在染色体或质粒中插入一个或多个额外拷 贝而改变的基因或蛋白。因此，例如，如果在染色体中在与原生位点不同的位点处插入aroB 基因的第二拷贝，第二拷贝将是外源性的。
[0046] 如本发明中所用的术语"微生物"包括可通过发酵方法用于顺，顺-黏康酸的商业 生产的细菌、古细菌、酵母、藻类和丝状真菌。
[0047] 对于命名法，基因或编码区通常以斜体的小写字母命名，例如"aroZ"，而由基因 所编码的酶或蛋白可以以相同的字母命名但第一个字母大写且不斜体，例如"AroZ"或 "Arolp"，后者为在酵母中使用的用于指示酶或蛋白的惯例的实例。"p"是由所指示的基 因编码的蛋白的缩写。酶或蛋白也可以用更加描述性的名称指代，例如，AroZ也可以指代 3_脱氢莽草酸脱水酶。编码具有特定催化活性的酶的实例之一的基因或编码区可以因历 史不同起源或因为基因来源于不同种类而具有数种不同的名称。例如，编码苏云金芽孢杆 菌或炭疽杆菌（Bacillus anthracis)的3-脱氢莽草酸脱水酶的基因可命名为asbF而非 aroZ，来自构巢曲霉（Aspergillus nidulans)的相关基因可命名为qutC，来自粗糙脉胞杆 菌的相关基因可命名为qa-4,而来自贝氏不动杆菌（Acinetobacter baylyi)(也称为乙酸 钙不动杆菌和不动杆菌属物种ADPl)的相关基因可命名为quiC。
[0048] "质粒"意指实质地小于染色体、与微生物的一个或多个染色体分开且独立于一个 或多个染色体进行复制的环状或线性DNA分子。"质粒"可以以每细胞约一拷贝或以每细胞 多于一个的拷贝存在。将质粒维持在微生物细胞中通常需要抗生素选择，但也可使用营养 缺陷型互补。
[0049] 如本发明中所用的术语"染色体"或"染色体DNA"在细菌细胞的环境下是实质地 大于质粒且不需要任何抗生素选择的环状DNA分子。
[0050] "表达盒"意指这样的DNA序列，其可以是染色体或质粒的一部分，并且其含有至少 启动子和编码酶或其它蛋白的基因或区域，从而使编码区由启动子表达，且含有该DNA序 列的宿主细胞产生该酶或蛋白。"表达盒"可以是至少部分合成的或通过基因工程方法构 建，从而使编码区从并非与编码区天然关联的启动子表达。任选地，"表达盒"可含有转录终 止子，其可以是或者可以不是与编码区天然关联的终止子。"表达盒"可以具有针对多于一 个蛋白的编码区，在这种情况下其可称为操纵子或合成操纵子。
[0051] 基因或编码区的"过表达"意指致使在相同或相似的生长条件下由该基因或编码 区编码的酶或蛋白以高于宿主微生物野生型形式中所见水平的水平在宿主微生物中产生。 这可以通过例如一种或多种以下方法而实现：1)安置更强的启动子，2)安置更强的核糖 体结合位点，如5' -AGGAGG的DNA序列，使其位于翻译起始密码子上游约四至十个碱基的 位置，3)安置终止子或更强的终止子，4)改善对编码区中一个或多个位点处的密码子的选 择，5)改善mRNA稳定性，和6)提高基因的拷贝数，通过在染色体中引入多个拷贝或是在多 拷贝质粒上放置盒。由过表达的基因产生的酶或蛋白被称为"超量产生的"。"过表达的"基 因或"超量产生的"蛋白可以是对于宿主微生物原生的基因或蛋白，或者其可以是已通过基 因工程方法从不同的生物体移植到宿主微生物中的基因或蛋白，在这种情况下酶或蛋白以 及编码该酶或蛋白的基因或编码区被称为"外来的"或"异源的"。外来的或异源的基因和 蛋白按定义是过表达和超量产生的，因为它们在未经改造的宿主生物体中不存在。
[0052] 第一基因、DNA序列或蛋白的"同源物"是执行与所述第一基因、DNA序列或蛋 白相似的生物学功能，且经用于序列比较的BLAST计算机程序所测定（Altschul等人， 1990 ;Altschul等人，1997)与所述第一基因或蛋白具有至少25%的序列同一性（当比 较蛋白序列或比较从基因序列得到的蛋白序列时），并允许缺失和插入的第二基因 、DNA 序列或蛋白。大肠杆菌aroG基因的同源物实例会是来自鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)的 aroG 基因。
[0053] 第一基因、DNA序列或蛋白的"类似物"是执行与所述第一基因、DNA序列或蛋白 相似的生物学功能，且经用于序列比较的BLAST计算机程序所测定（Altschul等人，1990 ; Altschul等人，1997)与所述第一基因、DNA序列或蛋白具有少于25%的序列同一性（当比 较蛋白序列或比较从基因序列得到的蛋白序列时），并允许缺失和插入的第二基因、DNA序 列或蛋白。肺炎克雷伯杆菌AroZ蛋白的类似物的实例会是来自构巢曲霉的QutC蛋白，因 为两种蛋白都是催化3-脱氢莽草酸脱水酶反应的酶，但在两种酶或其各自的基因之间没 有显著的序列同源性。本领域中有见解的科学家将会知晓，在许多不同的生物体中可以找 到许多具有特定生物学功能的酶和蛋白，如DAHP合酶或3-脱氢莽草酸脱水酶，它们或是作 为同源物或是作为类似物，并且因为这些酶或蛋白家族的成员共有相同的功能，故尽管它 们可能在结构上稍有不同或实质不同，但在许多情况下，使用现有的基因改造方法，相同家 族的不同成员可以用于执行相同的生物学功能。因此，例如，AroZ酶和QutC酶催化相同的 反应，DHS脱水酶，这样任一者在合适的环境下都会导致顺，顺-黏康酸产生，并且选哪一个 来使用最终可通过选择在相似的发酵条件下产生更高滴度的顺，顺-黏康酸的一个来作出 选择。
[0054] "非芳族碳源"或"非芳族化合物"是可作为碳源和/或能量用于供养本发明的微 生物的含碳化合物，其中该化合物不含有与苯相关的六元环。非芳族碳源的实例包括葡萄 糖、木糖、乳糖、甘油、醋酸、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖或蔗糖。"芳族化合物"是含有 一个或多个与苯相关的六元环的化合物。芳族化合物的实例是儿茶酚或1，2-二羟基苯。
[0055] "强组成型启动子"是这样的DNA序列，其通常位于由RNA聚合酶转录的DNA序列 或基因的上游（当以习惯的5'至3'方向描述时在基因的5'侧），并且其导致所述DNA序 列或基因通过RNA聚合酶转录以容易经由任何适当的测定法步骤直接或间接检测到的水 平表达。适当的测定法步骤的实例包括1)定量逆转录酶+PCR，2)对于所编码酶的酶测定 法，3)考马斯蓝染色的蛋白凝胶，或4)可测量的作为所述转录的结果间接产生的代谢物的 产生，且这样的可测量的转录的发生不论特定调节转录水平的蛋白、代谢物或诱导物化学 品存在与否。不是"强组成型启动子"的启动子的实例是大肠杆菌的P la。启动子，因为其在 没有乳糖或诱导物IPTG的情况下受阻遏物的阻遏。通过使用领域内熟知的方法，可以使用 "强组成型启动子"取代原生的启动子（否则天然存在于DNA序列或基因上游的启动子）， 得到如下的表达盒，所述表达盒可以置于质粒中或染色体中，且以高于原生启动子水平的 水平提供期望DNA序列或基因的表达水平。强组成型启动子可以是种或属特异性的，但来 自细菌的强组成型启动子常常可以在远缘相关的细菌中良好发挥功能。例如，来自枯草芽 孢杆菌（Bacillus subtilis)或来自通常在枯草芽孢杆菌上生长的噬菌体的启动子可以在 大肠杆菌中良好发挥功能。"强组成型启动子"与诱导型启动子如P ta。实质地不相同，诱导 型启动子已在现有技术中用于生产顺，顺-黏康酸且对于期望的功能水平通常需要昂贵的 化学品或其它环境变化（Niu等人，2002)。强组成型启动子的实例是来自枯草芽孢杆菌噬 菌体SPOl的P 15、P26，和大肠杆菌噬菌体入PK(SEQ ID No. 1、2和3)。
[0056] "黏康酸通路"是指从DHS到PCA到儿茶酚到顺，顺-黏康酸的生化通路，且"黏康 酸通路基因"是这样的基因，其编码催化黏康酸通路中的步骤的酶，或编码用来增强所述酶 例如ar 〇Z、ar〇Y、CatA、catX和qutC中之一者的活性的辅助功能。DHS是3-脱氢莽草酸盐 的缩写，且PCA是原儿茶酸的缩写。"黏康酸质粒"是含有一种或多种黏康酸通路基因的质 粒。
[0057] 本发明中所用的一些基因操纵的中心围绕着如图1所示的存在于细菌细胞中的 芳族氨基酸生物合成共同通路。图1所示的从DAHP合酶到分支酸合酶的芳族氨基酸生物 合成共同通路也称为"莽草酸通路"。
[0058] 关于微生物基因改造以生产芳族氨基酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有着大量的 已公开工作（US 4,681，852、US 4,753,883、US 6, 180, 373、欧洲专利申请 86300748.0)。方 法包括利用反馈抗性酶（41'<^、41'〇6、？1164、17^)、转录阻遏(^7冰）的去调控、增加启动子 强度（P tac;、Pla。）和增加一个或多个基因（tktA)的拷贝数的多种组合。然而，上述方法的许 多具体组合并未尝试过，或是因为存在太多的组合而难以无过度实验地进行尝试，或是因 为不能洞察哪一种将是最佳组合。更重要的是，这些基因操纵组合的任一种在开发用于使 用可再生的非芳族碳源来商业生产黏康酸的生物催化剂中的适用性尚不知晓。
[0059] 对于许多微生物特别是大肠杆菌，芳族氨基酸生物合成通路是熟知的（Neidhardt 和Curtiss，1996)。在野生型细胞中，该通路受反馈抑制和转录阻遏的紧密调控。第一个关 键步骤由脱氧-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸（DAHP)合酶催化，对其而言存在由ar 〇F、ar〇G和 aroH编码的三种同工酶。三种同工酶AroF、AroG和AroH分别受芳族氨基生物合成通路的 产物即酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制。对所有三者具有反馈抗性的突变体是已知 的（Draths 等人，1992 ;Lutke_Eversloh 和 Stephanopoulos, 2007 ;Hu 等人，2003 ;Shumilin 等人，1999)。本发明的一个方面涉及利用aroF、aroG和aroH基因的反馈抗性等位基因以 表达抵抗芳族氨基酸生物合成通路的产物的反馈抑制的AroF、AroG和AroH酶蛋白。芳族 通路中涉及的数种操纵子的转录受tyrR基因所编码的阻遏物或trpR基因所编码的阻遏物 或二者的调控（Neidhardt等人，1996)。特别重要的是当TyrR蛋白与一种或多种芳族氨基 酸结合时其对aroG和aroF转录的负调节。本发明的一个方面涉及通过从宿主细菌菌株的 染色体中消除tyrR或trpR基因而去除这些基因的负调节。
[0060] 本发明的主题是创造具有新的基因改造元件的基因改造盒的新组合，以提高用于 大规模商业生产顺，顺-黏康酸产生菌株的发酵参数和适用性。特别地，生产顺，顺-黏康 酸的现有技术并未教导遗传元件的某些组合，例如但不限于，超量产生的反馈抗性的AroG、 超量产生的反馈抗性的AroF、过表达的tktA、过表达的talA、染色体上整合的用于从强组 成型启动子表达aroZ、aroY和catAX(或其类似物或同源物）的表达盒，以及渗漏aroE等 位基因（我们将其定义为编码AroE酶的基因，该AroE酶对于芳族氨基酸和维生素的原养 型，但不导致芳族化合物的显著分泌）的多种组合。
[0061] 本文公开的菌株构建体的所有具体实例衍生自野生型大肠杆菌C菌株 (ATCC8739)或大肠杆菌K-12菌株（YMC9或MM294)，但本文公开的遗传元件可以组装到任 何其它合适的大肠杆菌菌株中，且本文公开的表达盒或遗传元件的适当类似物和同源物可 以组装到任何其它的合适微生物中，如可通过发酵方法用于商业生产顺，顺-黏康酸的其 它种类的细菌、古生菌、酵母、藻类和丝状真菌。
[0062] 在大肠杆菌中，自葡萄糖的芳族氨基酸生物合成通路起始于戊糖磷酸通路（PPP) 的非氧化分支。非氧化戊糖磷酸通路中的四种关键酶是转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷 酸差向异构酶和核酮糖-5-磷酸异构酶。这些酶催化导致从己糖或戊糖糖类形成赤藓 糖-4-磷酸（E4P)的反应。为提高大肠杆菌中E4P的可得性，可以过表达编码转酮醇酶的 tktA基因（Niu等人，2002)。类似地，还预期过表达转醛醇酶基因在一些情况中提高E4P的 可得性（Bongaerts等人，2001)。在本发明的另一方面，通过导致转酮醇酶和转醒醇酶的酶 活性增加的基因操纵来增强转酮醇酶和转醛醇酶基因的表达。在本发明的另一方面，通过 超量产生核酮糖-5-磷酸差向异构酶和核酮糖-5-磷酸异构酶来提高经由PPP的非氧化分 支的通量。
[0063] 共同芳族氨基酸通路中的第一关键步骤和最紧密调节的反应是经DAHP合酶（由 aroG、aroF和aroH编码）的磷酸烯醇丙酮酸（PEP)和E4P的缩合以产生脱氧阿拉伯-庚 酮糖酸7-磷酸（DAHP)。大肠杆菌消耗的D-葡萄糖部分通过PPP且部分通过糖酵解被带入 芳族生物合成。当通过用提高拷贝数而使表达增强的质粒转化来扩增转酮醇酶（tktA)和 DAHP合酶（aroG)的同工酶时，进入芳族通路的葡萄糖流大大提高（Niu等人，2002)。在本 发明的优选方面，出于扩大转酮醇酶和DAHP合酶的酶活性的目的，将外源aroG和tktA基 因整合到染色体DNA中。
[0064] 在本发明的另一实施方案中，通过增加 DAHP合成可用的PEP来提高微生物细胞中 经由PEP的通量。许多菌属细胞在利用磷酸转移酶体系（PTS)的跨细胞膜葡萄糖转运中消 耗I3EP,其中对于每分子跨细菌外膜转运的葡萄糖消耗一个PEP分子。通过用非PEP依赖性 的（PEP独立的）葡萄糖摄取机制取代或补偿PEP依赖性的PTS，可以增加微生物细胞内芳 族氨基酸生物合成通路可用的PEP池的大小。例如，用于糖摄取的PTS体系可以由基于GalP 的糖摄取体系或基于Glf/Glk蛋白的糖转运体体系进行取代或补偿（Chandran等人，2003 ; Yi等人，2003)。在本发明的优选方面，除了出于保存微生物细胞内的PEP池的目的将用于 糖摄取的PTS体系缺失外，还出于保存微生物细胞内的ATP的目的将基于GalP的糖摄取体 系失活。在PTS体系和基于Gal-P的糖摄取体系（APTS/AgalP)的运作都有缺陷的微生 物细胞中，可通过引入编码Glf?的外源基因，或编码Glf (葡萄糖易化扩散蛋白）和Glk (葡 糖激酶）蛋白二者的外源基因来实现糖摄取。如本发明所用，术语功能性的葡萄糖易化扩 散蛋白是指任何Glf蛋白以及在功能上等同于Glf且作用于通过易化扩散将糖转运到微生 物细胞中的任何其它蛋白。在本发明的一个方面，将编码葡萄糖易化蛋白Glf的基因引入 A PTS/ A galP微生物细胞中，且转运到微生物细胞中的葡萄糖通过内源葡萄糖激酶而磷酸 化。在本发明的另一方面，将编码Glf和Glk蛋白二者的基因引入到A PTS/AgalP微生物 细胞中。在本发明的优选方面，引入到微生物细胞中的外源gif和glk基因被整合到宿主 染色体DNA中。
[0065] 在本发明的另一实施方案中，当生长用的碳源和能量需要糖异生（例如如果碳源 是醋酸盐或琥珀酸盐）时，可通过提高细胞内已存在的羧化酶（例如PEP羧化激酶，其由大 肠杆菌中的Pck编码）的活性或通过引入外源的羧化酶而增加 PEP池。在优选的实施方案 中，引入的编码羧化酶的外源基因稳定整合到宿主染色体中。编码羧化酶的基因可以源自 多种多样的微生物种类。编码羧化酶的基因还可经历基因操纵，从而使得用于顺，顺-黏康 酸生产的生物催化剂内的羧化酶表达显著增加。
[0066] 在本发明的另一实施方案中，通过降低或消除利用PEP作为底物的丙酮酸激酶如 PykA和PykF的活性而增加微生物细胞内的PEP池。
[0067] 从DAHP，芳族氨基酸通路经由多个中间体至分支酸（CHA)，其是三种芳族氨基酸 即L-酪氨酸（L-Tyr)、L-苯丙氨酸（L-Phe)和L-色氨酸（L-Trp)的生物合成的分支点。
[0068] 在共同芳族氨基酸通路的初始阶段，3-脱氢奎尼酸（DHQ)合酶（AroB)从DAHP移 除磷酸基，导致DHQ的形成。酶DHQ脱水酶（AroD)从DHQ中移除水分子，导致3-脱氢莽草 酸盐（DHS)的形成，其随后被莽草酸脱氢酶（AroE)还原成莽草酸盐（SHK)。莽草酸激酶1/ II (AroK，AroL)将莽草酸盐磷酸化成莽草酸3-磷酸（S3P)。S3P与PEP进行缩合，导致5烯 醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP)的形成。EPSP的形成由EPSP合酶（AroA)介导。EPSP 的磷酸基由分支酸合酶（AroC)移除，导致分支酸（CHA)的形成。
[0069] 如图2中所示，芳族氨基酸通路可以因 aroE基因突变在3-脱氢莽草酸盐（DHS)转 化成莽草酸盐（SHK)的水平被阻断，导致DHS的积累（Niu等人，2002)。引入外源aroZ基因 起到将DHS转化成原儿茶酸（PCA)的作用。PCA随后通过由AroY酶介导的脱羧反应转化成 儿茶酚。儿茶酚通过catA基因产物的作用最终转化成顺-顺黏康酸（ccMuA)。ccMuA可以 受马来酰乙酰乙酸异构酶的作用而产生反-反黏康酸（ttMuA)。从DHS到ccMuA和ttMuA 的生物合成通路被称为黏康酸通路。负责将DHS转化成ccMuA的三种不同基因可以从多种 微生物种类获得并引入到选择用于黏康酸生产的微生物如大肠杆菌中。在本发明的优选实 施方案中，编码黏康酸通路所涉及蛋白的外源基因被整合到宿主染色体DNA中。
[0070] 在将芳族氨基酸通路重定向到顺，顺-黏康酸生产的过程中，aroE基因突变是关 键性的。aroE基因可以完全失活，导致芳族氨基酸生物合成的完全阻断，如使用描述用于黏 康酸生产的大肠杆菌WNl/pWN2. 248菌株所进行的（Niu等人，2002)。采用WNl/pWN2. 248 大肠杆菌菌株和相关菌株的重大缺点在于，由于aroE基因完全失活，该菌株成为上述的芳 族酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以及芳族维生素或维生素类化合物的营养缺陷型。结果， 在其生长以生产顺，顺-黏康酸的过程中，该菌株需要外源添加这六种化合物（或共同中 间体，如莽草酸盐），由此使得利用该菌株进行的顺，顺-黏康酸商业生产的成本实质增加。 克服对芳族氨基酸的外部来源的这种依赖性的新方法是使用具有aroE渗漏突变的菌株。 渗漏aroE突变体将允许有限的碳流向莽草酸，同时积累显著量的DHS，其随后可用于经由 AroZ酶的作用转化成PCA。由此，使用aroE的渗漏突变体形式将消除对外源芳族氨基酸的 依赖性，同时仍然将碳流转向顺，顺-黏康酸。
[0071] 用于合成DHS转化成顺，顺-黏康酸所必需的AroZ、AroY和CatA蛋白的编码基因 可以源自许多微生物种类。在一个实施方案中，这些外源基因整合到正在开发的生物催化 剂的宿主染色体中。在优选的实施方案中，这些外源基因在生物催化剂内的表达由组成型 启动子驱动而不需要任何诱导物。
[0072] 中间体原儿茶酸的生物合成需要3-脱氢莽草酸脱水酶（AroZ ;EC4. 2. 1. 118)这种 酶。在本说明书中，"AroZ"应指任何催化3-脱氢莽草酸脱水酶反应的酶。在现有技术中，该 酶从肺炎克雷伯杆菌菌株A170-40 (ATCC25597)的aroZ基因表达（Niu等人，2002 ;Draths 和Frost, 1995)。然而，AroZ的比活在生物体之间广泛变化，从0. 1至261微摩尔/min/ mg (Wheeler等人，1996 ;Fox等人，2008 ;Pf Ieger等人，2008)，因此，通过从比肺炎克雷伯杆 菌具有更高的比活的生物体，例如贝氏不动杆菌、构巢曲霉（Wheeler等人，1996)(现在也 称为构巢裸胞壳（Emericella nidulans))、或粗糙脉孢菌（Rutledge, 1984 ;Stroman等人， 1978)、或鹅柄抱壳菌（Podospora anserina，也称为 Podospora pauciseta) (Hansen 等人， 2009)表达 aroZ 基因，其也称为 asbF (Fox 等人，2008 ;Pf Ieger 等人，2008)、qutC (Wheeler 等人，1996)、qa_4 (Rutledge, 1984)和quiC，可以具有显著的改进。
[0073] 作为一个特别的实例，来自粗糙脉孢菌的编码3-脱氢莽草酸脱水酶的qa-4基因 的编码序列可以通过数种已知方法中的任一者获得，例如全基因 DNA合成、cDNA克隆或通 过基因组DNA克隆与PCR或合成DNA接头合成的组合。由于qa-4基因中没有内含子，可以 通过PCR从基因组DNA获得编码区（Rutledge, 1984)。qa-4酶的蛋白序列（SEQ ID No. 4) 和原生基因的DNA序列（SEQ ID No. 5)是已知的。
[0074] 备选地，可以从构巢曲霉针对3-脱氢莽草酸脱水酶构建表达盒。来自构巢曲霉 的QutC酶的编码序列可以通过数种已知方法中的任一者获得，例如全基因 DNA合成、cDNA 克隆或通过基因组DNA克隆与PCR或合成DNA接头合成的组合。QutC的蛋白序列（SEQ ID No.6)和不含内含子的原生基因的DNA序列是已知的（SEQ ID No.7;GenBank检索号 M77665. 1)。表达盒可以通过DNA合成，或通过基因组克隆与PCR的组合得到，从而使QutC 酶能在大肠杆菌中准确产生。通过在大肠杆菌中从强组成型启动子表达QutC的编码序列， 可以从整合到染色体中的一个或两个拷贝的基因获得充分表达，省去了可能导致不稳定性 的并且如现有技术中所公开的在多拷贝质粒上维持多于两个拷贝的表达盒的需求（Niu等 人，2002)。上述方法通常可以用于获得编码期望的酶的DNA序列，并且该编码序列随后可 用于构建设计为在大肠杆菌中或另一合适的微生物宿主生物体中发挥功能的表达盒。
[0075] AroZ的比活也可以通过利用现有技术的蛋白序列（Niu等人，2002)但构建改进的 表达盒来加以改进，例如，其中在编码区之前已安置更强的启动子和/或核糖体结合位点 (RBS)，如实施例4中所描述的。
[0076] 来自肺炎克雷伯杆菌菌株A170-40的编码AroZ(3_脱氢莽草酸脱水酶）的aroZ 基因可以按现有技术中所描述的来获得。该基因的DNA序列和周围的DNA可以通过领域 内熟知的方法确定。可利用原生的DNA序列将本发明的异源基因例如aroZ建立到表达盒 中，或者其可用针对预定宿主生物体密码子优化的序列合成。可以按记载的（Draths和 Frost，1995)从任何其它含有活性aroZ基因的微生物克隆aroZ基因，其中所述微生物例如 肺炎克雷伯杆菌菌株342、不动杆菌属物种ADPl (贝氏不动杆菌ADPl)、苏云金芽孢杆菌、构 巢裸胞壳、解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora)、恶臭假单胞菌W619和许多其它菌。
[0077] 中间体儿茶酚的生物合成需要原儿茶酸脱羧酶（AroY ;EC4. I. 1. 63)这种酶。在本 说明书中，"AroY"应指任何催化原儿茶酸脱羧酶反应的酶。在现有技术中，该酶从在多拷 贝质粒上的肺炎克雷伯杆菌菌株A170-40 (ATCC25597)的aroY基因表达（Niu等人，2002)。 然而，再一次地，可以通过从整合到宿主生物体的染色体中的一个或两个拷贝的表达盒产 生充足的酶来获得方法改进。这可以通过从以下的生物体获得aroY基因来实现，所述生物 体天然产生较之现有技术的肺炎克雷伯杆菌AroY酶具有更高比活的AroY酶,或通过提高 肺炎克雷伯杆菌AroY的表达水平而实现，所述提高表达水平是通过构建例如利用强组成 型启动子和/或强RBS的表达盒而进行，如以上对实施例4描述的。来自肺炎克雷伯杆菌 菌株A170-40的AroY的蛋白序列在SEQ ID No. 8中给出。对应的基因 aroY可以如上所述 进行克隆（Draths和Frost, 1995)，或者基于蛋白序列，其可以用针对预定宿主生物体优化 的密码子合成。
[0078] aroY基因可以从含有同源物或类似物的任何其它微生物获得，例如肺炎克雷伯杆 菌菌株 NCTC418 (ATCC15380)、肺炎克雷伯杆菌 342 和 Arxula adeninivorans (Sietmann 等 人，2010)。来自肺炎克雷伯杆菌342的aroY基因的DNA序列和周围的DNA在SEQ ID No. 9 中给出。
[0079] 顺，顺-黏康酸生物合成的最后步骤需要儿茶酚1，2-双加氧酶（CatA ; ECL 13. 11. 1)这种酶。在本说明书中，"CatA"应指任何催化儿茶酚1，2-双加氧酶反应 的酶。在现有技术中，该酶从多拷贝质粒上的乙酸钙不动杆菌菌株ADPl的catA基因表达 (Niu等人，2002)。来源菌株，乙酸钙不动杆菌菌株ADPl显然已重命名为不动杆菌属物种 ADPl 和贝氏不动杆菌 ADPl (Neidle 和 Ornston, 1986 ;Barbe 等人，2004 ;de Berardinis 等人，2008)。在该现有技术实例中，catA基因从Pta。启动子表达，该启动子需要乳糖或 IPTG(异丙基硫代半乳糖苷）作为诱导物。这些化合物对于用于商业发酵而言太过昂贵，因 此再一次地，需要通过将表达盒整合到染色体中对方法进行显著改进，既为了消除对昂贵 诱导物的需求，也为了产生更稳定的菌株。这可以通过构建利用强组成型启动子、强RBSjP /或更稳定的mRNA的catA基因的表达盒而实现，如以上其他实施例中所述。
[0080] 来自贝氏不动杆菌ADPl的catA基因的DNA序列和周围序列在SEQ ID No. 10中给 出。来自相同菌株的CatA的蛋白序列在SEQ ID No. 11中给出。在优选的实施方案中，catA 的表达盒含有一个或两个额外的天然存在于catA下游的开放阅读框，以提高catA基因的 表达水平（Schirmer和Hillen，1998)。许多其它生物体可以是catA基因的来源，例如小田 假单胞菌（Pseudomonas arvi 11a)、突光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens) (Nakazawa 等人，1967 ;Kojima 等人，1967)、链霉菌属物种菌株 2065 (Streptomyces Sp. Strain2065) (Iwagami 等人，2000)、钩虫贪铜菌 335T (Cupriavidus necator335T)和许多其它菌 (Perez-Panto ja 等人，2008)。
[0081] 为了提高朝向顺，顺-黏康酸的碳流，除了通过利用渗漏aroE突变体减小从DHS 到莽草酸盐（SHK)的碳流，还有必要阻断从芳族氨基酸通路分支出的某些其它通路。一 些细菌，例如不动杆菌属和假单胞杆菌属中的一些细菌，含有名为PobA的基因，其编码 将DHS转化成没食子酸的对羟基苯甲酸水解酶这种酶。尽管大肠杆菌中未曾发现PobA 同源物或类似物，但经改造以生产DHS的大肠杆菌菌株分泌可测量量的没食子酸（Li和 Frost, 1999)，因此有可能这种酶确实存在于大肠杆菌中。此外，源自DHS的PCA可以通过 由pobA基因所编码的对羟基苯甲酸水解酶（PobA)酶的作用转化成没食子酸。由此产生的 没食子酸可以在随后被转化成焦性没食子酸。阻断所选的生物催化剂中通向没食子酸和焦 性没食子酸的碳流以提高顺，顺-黏康酸的一种方式是通过基因操纵而阻断或减小对羟基 苯甲酸水解酶（PobA)蛋白的活性。相似地，DHS的前体--DHQ也可以受aroE所编码的莽 草酸脱氢酶的作用，导致奎宁酸的产生。在本发明的实施方案中，对渗漏AroE突变体酶额 外选择或筛选其在将DHQ转化成奎宁酸方面的失能或降低的能力。
[0082] 生产反，反-黏康酸代替顺，顺-黏康酸有数个优点。在使用乙烯用于生产对苯二 甲酸的狄尔斯-阿尔德反应（Diels Alder reaction)中对反，反-黏康酸的偏好高于顺， 顺-黏康酸。具有经基因操纵的芳族通路的生物催化剂产生顺，顺-黏康酸，所述顺，顺-黏 康酸可以在细胞外利用化学转化方法转化成反，反-黏康酸。另一方面，通过将马来酰乙酰 乙酸异构酶或相似的异构酶引入到生物催化剂中，可以在细菌生物催化剂中将顺，顺-黏 康酸转化成反，反-黏康酸。
[0083] 本专利申请的说明书提供了与构建足以生产黏康酸的微生物菌株相关的本发明 的数个不同方面。本领域技术人员能够汇编本发明的数个不同方面以构建具有极高效率的 用于生产黏康酸的生物催化剂。
[0084] 实验部分
[0085] 总论
[0086] 菌株和接种体制备：本发明中所用的细菌菌株和质粒的清单提供于表1中。本文 公开的菌株构建体的所有具体实例衍生自野生型大肠杆菌C菌株（ATCC8739)或大肠杆菌 K-12菌株（YMC9或MM294)，但本文公开的遗传元件可以组装到任何其它合适的大肠杆菌菌 株中，且本文公开的表达盒或遗传元件的适当类似物和同源物可以组装到任何其它的合适 微生物中，如可通过发酵方法用于商业生产顺，顺-黏康酸的其它种类的细菌、古生菌、酵 母、藻类和丝状真菌。
[0087] 大肠杆菌C能在AMl矿物培养基中发酵10 %葡萄糖。AMl培养基含有2. 63g/ L(NH4)2HP04、0. 87g/L NH4H2P04、1. 5mM MgS04、l. OmM甜菜碱、和 I. 5ml/L痕量元素。痕量元素 制备成 1000X 储液并且含有以下组分：1. 6g/L FeCl3、0. 2g/L CoCl2 ? 6H20、0. lg/L CuCl2、 0? 2g/LZnCl2 WH2CKO. 2g/L NaMo04、0. 05g/L H3B03、和 0? 33g/L MnCl2 .4H20。用 I. 0 ?10. OM KOH或I. 0?9. OM氢氧化铵使发酵液的pH维持在7. 0。
[0088] 发酵：通过从经基因改造的并存储于_80°C冰箱中的大肠杆菌菌株的40%甘油储 液在新鲜的NBS-2%葡萄糖（Jantama等人，2008a)平板上划线接种而开始发酵。通过在琼 脂板和液体培养基中包含合适的（一种或多种）抗生素而保留质粒（如果存在的话）。氨 苄青霉素（钠盐）以150mg/L使用，壮观霉素 HCL以100mg/L使用，四环素 HCl以15mg/l 使用，且硫酸卡那霉素以50mg/l使用。在24至48小时（37°C)后，将单克隆挑选到摇瓶中 25ml的相同培养基中。在于37°C 200rpm震荡直至细胞生长至约I. 0的OD6tltl后，在冰上冷 却培养物并添加等体积的无菌80%甘油。然后将2ml的等分物在-80°C冻存以用作发酵用 的接种物。
[0089] 细胞生长：通过使用Thermo Electronic Spectronic20分光光度计测量 550nm(0D55CI)或600nm(0D_)下的光密度来估算细胞质量。
[0090] 对莽草酸通路和黏康酸通路中的中间体的分析：利用购自Sigma-Aldrich的标准 物，通过HPLC和Waters Alliance仪器并监测2IOnm下的吸光度或45°C下的折射率来测 定发酵液中所产生的全部黏康酸（包括顺，顺-黏康酸和顺，反-黏康酸以及其它生化中 间体）。柱子是BioRad Aminex HPX-87H，以8mM硫酸作为流动相在0. 6ml/min的流速下在 50°C运行40分钟。购买的标准物（Sigma-Aldrich)的色谱图示于图3。为准备用于HPLC， 将发酵样品在〇. 05M磷酸钾缓冲液（pH7. 0)中稀释10或100倍，以防止顺，顺-形式的黏 康酸异构化为顺，反-形式。
[0091] 为分离黏康酸的异构体，将如上制备的样品在第二HPLC体系中运行。仪器是 Agilentl200HPLC，柱子是Agilent Eclipse XDB-C18, 4. 6x150mm，以用憐酸调节至pH3. 0 的 50mM KH2PO4于30%甲醇中的流动相在30摄氏度运行。流速为lml/min，持续4分钟，进行 278nm下的吸光度检测。通过将顺，顺-黏康酸溶解于水中并允许其在室温下经历约2小时 的自发的酸催化的异构化来产生顺，反-黏康酸标准物，直至HPLC峰已经完全移动至新位 置。其它标准物购自Sigma-Aldrich。显示标准物的色谱图示于图4中。
[0092] 用于发酵方法的黏康酸生产培养基的组成：每升的发酵培养基含有50ml/L的IM 腿2卩04、10!111的20(^/1柠檬酸+258/1柠檬酸铁、1.21111的98%硫酸和一滴411衍作 &111204。将 这些组分与足量的水混合以允许有添加以下其它组分的空间。在高压灭菌后，添加以下组 分：10、20、30或40ml的50%葡萄糖（以得到5、10、15或20g/l终浓度）、2ml的IM MgS04、 Iml 的 0? IM CaCl2UOml 的 1000X 痕量元素 （Jantama 等人，2008a)、1、2、4 或 8ml 的 50g/L 苯丙氨酸+50g/L酪氨酸+50g/L色氨酸（以得到0.5、0. 1、0.2或0.4g/l终浓度）、10ml的 lg/L对轻基苯甲酸+lg/1对氨基苯甲酸+lg/L2, 3-二轻基苯甲酸和必要时的Iml的150mg/ ml氨苄青霉素（钠盐）和/或Iml的lOOmg/ml壮观霉素 HC1。
[0093] 对于补料分批发酵，给料瓶含有600g/L的无水葡萄糖和32ml/L的50g/L苯丙氨 酸+50g/L酪氨酸+50g/L色氨酸。9M NH4OH用作碱以维持发酵培养基的pH。
[0094] 对于摇瓶，用NBS盐（Jantama等人2008a)加0. 2M MOPS缓冲液（pH7. 4)替代如 上所述的高压灭菌前的混合物，但葡萄糖和其它添加物相同。
[0095] 补料分批发酵在7L New Brunswick Scientific发酵罐中进行，pH、DO、温度、葡萄 糖和进料速度通过D⑶控制器或Biocommand软件来加以控制。温度维持在37°C，pH通过 9N氨水维持在7.0,溶解氧（DO)维持在30%空气饱和同时将叶轮速度从750rpm升高至 1200rpm。期望的培养基中的初始葡萄糖浓度为约5至25g/L。当葡萄糖浓度降至低于5g/ L时，将葡萄糖溶液添加至发酵罐中，并通过溶解氧水平来控制葡萄糖的进料速度。总发酵 时间为48小时，最终滴度为16g/L的黏康酸。
[0096] 表达黏康酸通路基因的质粒的构建：将DHS转化成黏康酸所需的三种异源基因单 独或组合克隆到低拷贝质粒PCL1921中（Lerner和Inouye, 1990)。pCL1921的DNA序列 在表3SEQ ID No. 20中给出。简言之，catAX、aroY和aroZ类似物或同源物的编码序列经 密码子优化用于在大肠杆菌中表达并商业合成（GeneArt, Invitrogen)。然后利用携带独 特的核糖体结合位点的正向引物和携带各基因独特的终止子序列的反向引物将这些序列 经PCR扩增。将所得的PCR片段经限制性酶消化并通过标准分子克隆方法克隆到独特的 组成型启动子序列的下游。通过从之前描述过的来源DNA序列进行PCR扩增（美国专利申 请20090191610 ;美国专利7244593)，之后是限制性消化和标准分子克隆，来克隆启动子序 列。启动子-RBS-编码序列-终止子序列在一起组成表达盒。接着将单独的表达盒组合以 产生表达一个、两个或所有三个黏康酸通路基因的质粒。
[0097] 实施例1
[0098] 增加 aroG和aroF的表达
[0099] 大肠杆菌的tyrR基因可通过数种熟知方法中的任一种来突变，例如化学或辐射 诱变和筛选（例如通过PCR和DNA测序）或选择类似物抗性（例如，对4-氟酪氨酸的抗性）、 转座子诱变、细菌噬菌体Mu诱变或转化。在优选的实施方案中，tyrR基因中的突变是无效 突变（导致没有可检测的活性的突变），而在更优选的实施方案中，至少部分tyrR基因缺 失。这可以通过例如利用使用线性DNA分子的两步转化法（Jantama等人，2008a ;Jantama 等人，2008b)来实现。在第一步中，通过双重组和选择氯霉素抗性将camK、sacB盒在tyrR 基因座处整合以取代大部分的或所有的tyrR开放阅读框。在第二步中，通过双重组、在丰 富营养基如LB中选择对5%蔗糖的抗性将包括缺失型的tyrR基因的线性DNA整合。通过 诊断性聚合酶链式反应（PCR)来鉴定和确定正确的缺失。将tyrR缺失的目的是增加 aroG 和aroF的表达。实现相似结果的可选方法是用强组成型启动子取代aroG和/或aroF之 前的原生启动子和（如果必要的话），添加转录终止子。关于总体如何实现的更多细节在以 下实施例4中给出。
[0100] 以上描述的用于克服TyrR蛋白对AroG和AroF活性的抑制的两种途径中后 者是优选的，因为tyrR缺失会引起不希望的基因如aroLM的过表达（Neidhardt和 Curtiss, 1996)。关于总体如何实现的更多细节在以下实施例4中给出。
[0101] 实施例2
[0102] 反馈抗性的AroG和AroF
[0103] 导致反馈抗性的AroG酶（3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶或DAHPS)的 aroG基因中的突变是领域内已知的（Shumilin等人，1999 ;Kikuchi等人，1997 ;Shumilin 等人，2002)。还已知的是产生、鉴定和表征这些突变的方法（Ger等人，1994, Hu等 人，2003)。优选的突变是引起对苯丙氨酸抑制完全抗性的突变。可以通过数种已知方法中 的任一种将任何已知的已公开的反馈抗性突变引入到染色体中或质粒上所包含的aroG基 因中，其中一个方法实例是诱变PCR，其中期望的突变作为PCR引发寡核苷酸的部分被合成 (Hu等人，2003)。通过DNA测序来证实突变的正确置入。来自大肠杆菌C的野生型aroG 基因的序列在SEQ ID No. 18中给出。优选的突变是将AroG的氨基酸150从脯氨酸变成亮 氨酸的点突变，例如通过将密码子150从CCA变成CTA (Hu等人，2003)。在更优选的实施方 案中，密码子150从CCA变成CTG，其是大肠杆菌中的优选密码子。该特别的aroG等位基因 是优选的，因为所编码的DAHP合酶对高达3mM的苯丙氨酸抑制完全抵抗，并且其具有与野 生型酶相似的比活（Hu等人，2003)。
[0104] 可以通过诱变和选择对一种或多种苯丙氨酸类似物（如P -2-噻吩丙氨酸、P-氟 代苯丙氨酸、P-氯代苯丙氨酸、〇-氟代苯丙氨酸和〇-氯代苯丙氨酸）的抗性、接着证明导 致抗性的突变与aroG基因关联，来得到另外的反馈抗性aroG等位基因（Ger等人，1994 ;US 专利4, 681，852)。与aroG的关联可以通过DNA测序或苯丙氨酸存在和不存在情况下的酶 测定来直接证明（Ger等人，1994)，或通过噬菌体介导的转导和对aroG基因座处或其附近 的可供阳性或阴性选择的遗传标记物的选择而间接证明（US专利4, 681，852)。这样的遗 传标记物可以是aroG基因自身中的缺失或点突变，或者是任何合适的紧密关联的基因（如 大肠杆菌情况下的nadA)中的突变。例如，在大肠杆菌中，在诱变和选择苯丙氨酸类似物抗 性后，单个突变体或突变体集合可被用作供体用于经Pl介导转导至缺失所有三种DAHP合 酶基因 aroG、aroF和aroH的原生受体中，并选择在合适的基本培养基上的生长。然后转导 子将富集（一个或多个）期望的基因中的突变。备选地，在诱变和选择类似物抗性后，单个 突变体或突变体集合可被用作供体用于经Pl介导转导至包含nadA基因中的无效突变的原 生受体菌株中，再次选择在缺乏烟酰胺的基本培养基上的生长。另一方法是在这样的菌株 背景中选择抗性突变体，所述菌株背景在aroG基因附近（如在nadA基因中）含有转座子 (如TnlO)插入。从类似物抗性突变体Pl转导到不包含所述转座子的菌株背景中和选择四 环素或其它合适的抗生素抗性将富集期望的aroG突变。在所有这些方法中，反馈抗性最终 通过酶测定和对基因的DNA测序而得以证实。我们将对反馈抑制具有抗性的aroG的等位 基因称为aroG*。
[0105] 菌株WM191(AtyrR，AaroF)衍生自YMC9(ATCC33927)。利用两步基因取代法 (Jantama等人，2008a)置入tyrR和aroF的完全缺失（clean deletion)，以得到菌株 WM191。接着，从 CAG12147(CGSC7351，Coli Genetic Stock Center, Yale University) 转导入 nadA: : TnlO 等位基因，以得到菌株 WM189 ( A tyrR, A aroF, nadA: : TnlO)。在 LB+ 四环素 HCl (15mg/l)上进行选择。菌株RY890 ( A tyrR: : kan, aroF363)通过Pl转导 以三步从 MM294(ATCC33625)得到。供体菌依次为 JW1316-1(CGSC9179, Coli Genetic Stock Center, Yale University)、NK6024(CGSC6178, Coli Genetic Stock Center, Yale University)和 AB3257(CGSC3257, Coli Genetic Stock Center, Yale University),并且 三次选择依次为LB+硫酸卡那霉素（50mg/l)、LB+盐酸四环素（15mg/l)和NBS最低限葡萄 糖（Jantama 等人，2008a)及硫胺素 HCl (5mg/l)。
[0106] 用UV光对丽189诱变至约20%存活，并铺板于含有〇-氟代苯丙氨酸（ImM)、硫胺 素（5mg/l)和烟酰胺（ImM)的NBS最低限葡萄糖培养基中（Jantama等人，2008a)。将从数 个板各自得到的菌落收集到单独的池中，并在各个池上制备Plvir溶菌物。使用这些溶菌 物在LB培养基上将丽191转导成四环素抗性（15mg/l)，并将得到的菌落复制铺板到含有 ImM 〇-氟代苯丙氨酸、硫胺素（5mg/l)和烟酰胺（ImM)的NBS最低限葡萄糖培养基上。假 定在四环素和类似物上均存活的菌落复制物在aroG中含有反馈抗性突变。从5个独立的 池中选择八个单独的菌落用于DNA测序。通过聚合酶链式反应将aroG编码区扩增并测序。 示于图4的结果显示，八个菌株各自在其aroG基因中包含点突变。一些等位基因与已公开 的等位基因相同，但一些是新的。
[0107] 使用来自以上描述的池之一的Plvir溶菌物将RY890 (其具有aroG野生型等位基 因）转导成四环素抗性并通过如上所述的复制铺板转导成对0-氟代苯丙氨酸（〇.3mM)抗 性。挑取四个克隆，命名为RY893、RY897、RY899和RY901，用于DNA测序（表4)，再次地，两 个等位基因与已公开的等位基因相同，但两个是新的。与后四个菌株同基因但却含有野生 型aroG基因的菌株RY890通过从CAG12147转导被构建为对照。这五株菌在摇瓶中在25ml NBS最低限葡萄糖（15g/l) +硫胺素 HCl (5mg/l)和烟酰胺（ImM)中过夜生长。所得的细胞 通过离心收集,重悬以用IOml水漂洗，再离心，并重悬于0. 5ml的50mM磷酸钾（pH7. 0)中。 重悬的细胞通过与三滴氯仿一起涡旋而裂解，并使用与文献中所描述的方法类似的方法测 定粗溶菌物的DAHP合酶活性（Hu等人，2003)，有以下改动。磷酸盐缓冲液是50mM(终浓 度），pH7. 0,最终的赤藓糖-4-磷酸浓度为2mM，最终的磷酸烯醇丙酮酸浓度为5mM，孵育温 度为30°C，反应在10分钟时终止。我们将ImU定义为每分钟每毫克蛋白产生InM DAHP的 活性。为测试反馈抗性，在有或没有终浓度ISmM的苯丙氨酸的存在下对各个粗溶菌物进行 测定。测定结果示于表5。酶显示出不同的比活和对苯丙氨酸的抗性，但所有选择的进行测 试的突变体形式显著比野生型对照具有更高抗性。
[0108] 将来自如上所述的RY893、RY899、RY901和RY902的aroG等位基因按如下引入黏 康酸生产菌株背景中。将来自aroG*和aroGwt供体菌株的Plvir溶菌物用于将MYR219(大 肠杆菌C, A aroE, A ack: :P15-aroB, pMG37)转导成四环素 HCl抗性（15mg/l),以分别得 到新菌株RY903、RY909、RY911和RY912。然后使用JW1316-1的Plvir溶菌物以引入 A tyrR: : kan等位基因，将这些菌各自转导成硫酸卡那霉素抗性（50mg/l)，，分别得到菌株 RY913、RY919、RY921和RY922。始终维持壮观霉素选择以维持黏康酸质粒。所得的四株菌 在37°C在摇瓶中在含有20g/l葡萄糖、0. 2M MOPS缓冲液（pH7. 4)、烟酰胺（ImM)、苯丙氨 酸（100mg/l)、酪氨酸（100mg/l)、色氨酸（100mg/l)、对轻基苯甲酸（lmg/1)、对氨基苯甲酸 (lmg/l)、2,3-二轻基苯甲酸（lmg/1)、酚红（10mg/l)和硫酸铵（lg/1)的补充物的NBS基 本培养基（Jantama等人，2008a)中生长48小时。通过针对pH7. 0标准物目视酚红颜色估 计，通过按要求对摇瓶人工添加 Iml的I. OM KOH等分物，将pH保持在接近7。产生的黏康 酸如上所述通过HPLC进行检测，结果显示在表6中。所有三株含有反馈抗性的aroG*等位 基因的菌株较之含有野生型aroG等位基因的同基因菌株产生更多的黏康酸。在本文公开 的单独实验中，在多拷贝质粒PCP32AMP上含有aroG的菌株MYR205在摇瓶中产生I. 5g/l 黏康酸。因此，发明人已经显示，较之含有同基因的aroG质粒的菌株，AtyrR和单拷贝染 色体aroG*的组合可以表现良好地在摇瓶中产生黏康酸。染色体等位基因相较于质粒等位 基因的固有的优异遗传稳定性，加之减弱了对于为了维持质粒的选择性培养基的需求，使 得本文描述的新菌株更加适合于大规模商业发酵。而且，不需要化学诱导物用于黏康酸通 路基因的表达。因此，上述的本发明菌株较之全部在不理想的多拷贝质粒上包含用于过表 达DAHP合酶的基因的现有技术（Niu等人，2002)而言有改进。
[0109] 按与以上针对AroG描述内容相似的方式，可以在质粒上或在染色体中置入产生 抵抗由酪氨酸的反馈抑制的AroF或AroH同工酶的突变。优选的突变是将AroF的氨基 酸148从脯氨酸变为亮氨酸的点突变，例如通过将密码子148从CCG变为CTG(Weaver等 人，1990)，得到命名为aroF*的基因。可以按与以上针对aroG*等位基因描述内容类似 的方式通过对酪氨酸类似物（例如〇-氟代酪氨酸、m-氟代酪氨酸、P-氟代苯丙氨酸等） 的抗性来分离其它aroF*等位基因。可以通过与转座子或卡那霉素抗性插入物关联而选 择、富集以及转导aroF*等位基因，例如，在诸如JW2584(CGSC10051，Coli Genetic Stock Center, Yale University)的菌株中在紧密连接的AyfiR::kan中。
[0110] 实施例3
[0111] 从染色体DNA缺失aroE和黏康酸生产
[0112] 在该实施例中研究了过表达多拷贝质粒上的aroB和aroG以及表达在黏康酸通 路中有功能的蛋白的编码基因的作用。在编码莽草酸脱氢酶的aroE基因中含有缺失的菌 株MYR34被用作这些研究中的亲本菌株。以与上述实施例1中所描述内容相似的方式完 成aroE的染色体拷贝的缺失。当用过表达编码在莽草酸通路中有功能的DAHP合酶蛋白的 aroG基因的质粒pCP32AMP转化MYR34时，DHS的积累有显著提高。当用从组成型启动子表 达aroB基因的质粒转化MYR34时，没有注意到DHS积累的显著提高。然而，当用表达aroB 和aroG基因二者的质粒转化大肠杆菌菌株MYR34时，相比使用仅转化有aroG的MYR34时 所观察的情况，DHS的积累有增加，因此表明aroB是DHS生产中的第二瓶颈（图5)。
[0113] 在图6呈现的实验中，检视了整合到宿主染色体DNA中的aroB基因的额外的拷贝 的效果。在衍生自MYR34的大肠杆菌菌株MYR170中，将处于P15启动子控制下的aroB基 因的额外拷贝在ack基因座处整合到宿主染色体中。当用pCP32AMP质粒转化MYR170菌 株时，与用相同质粒转化MYR34菌株时所检测到的DHS积累相比，DHS积累有轻微的增加。 MYR170中DHS积累的轻微增加可以归因于整合到宿主染色体DNA中的aroB基因的额外拷 贝。当用表达aroB和aroG基因二者的pCP54转化MYR170菌株时，DHS积累有进一步的增 力口，意味着aroB是DHS生产中的第二瓶颈。
[0114] 图7提供了使用大肠杆菌菌株MYR34和MYR170的黏康酸生产结果。在建立了在 aroE缺失菌株MYR34和MYRl70中在aroB和aroG基因的过表达下有DHS积累后，工作致力 于观察编码在黏康酸生产通路中有功能的蛋白的"黏康酸通路"基因的表达是否会导致DHS 转变成顺，顺-黏康酸。在这些实验中，单独用质粒PMG37或用质粒pMG37和pCP32AMP二 者转化大肠杆菌菌株MYR34和MYR170。质粒pMG37表达编码在黏康酸通路中有功能的蛋白 的aroZ、aroY和catAX基因。当用质粒pMG37和pCP32AMP二者转化这些细菌菌株时，与仅 用PMG37质粒转化的这两种菌株中的黏康酸产量相比，MYR34和MYR170二者中的黏康酸产 量增加,这提示在这些菌株中，aroB表达是顺，顺-黏康酸生产的瓶颈。
[0115] 实施例4
[0116] tktA的过表达
[0117] 由tktA编码的转酮醇酶是戊糖磷酸通路中的关键酶，并被认为对于黏康酸生产 中的关键中间体之一--赤藓糖-4-磷酸的生产是限制性的。已知通过将基因及其原生启 动子置于多拷贝质粒上来过表达编码转酮醇酶的tktA(Sprenger等人，1995, 1995a)能提 高进入芳族通路中的流量（Draths等人，1992)。然而，这样的质粒不稳定，并且往往需要抗 生素选择以维持。现有技术中的另一方法是向宿主菌株的染色体中添加 tktA基因的一个 额外拷贝（Niu等人，1992)。然而，tktA的一个额外拷贝及其原生启动子并不足以用赤藓 糖-4-磷酸饱和芳族通路，因为其原生启动子并非完全接近于理想。这样，该方法需要实质 的改进。
[0118] 可以例如，通过用强组成型启动子例如来自枯草芽孢杆菌噬菌体SPOl的P15或P 26 启动子（分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，或来自细菌噬菌体入的Pk启动子（SEQ ID No. 3)来替代染色体中的原生tktA启动子，来获得改进的tktA过表达。这通过如实施例1 中描述的两步而实现，不同在于在第一步骤中使用cam K，sacB盒来取代原生染色体tktA启 动子。在第二步中，通过转化线性DNA并进行蔗糖抗性选择而置入强组成型启动子，所述线 性DNA包含强组成型启动子，其侧翼是在强组成型启动子下游侧的tktA编码区5'端的至少 50个碱基和在强组成型启动子上游侧的就在原生tktA启动子上游的同源的至少50个碱基 对。自这样的表达盒的改进的表达还通过增加从表达盒转录的mRNA的稳定性而实现。mRNA 稳定性的提高通过在mRNA的5'端、mRNA的3'端或两端增加莖环结构而实现。莖-环结 构往往存在于mRNA的末端，其由rho-非依赖性的转录终止子自然终止，但如果不是这样， 则可以通过遗传工程的公知方法（连接、PCR等）向DNA序列中添加 rho-非依赖性的转录 终止子。这样的终止子可以由在各重复序列中的4至20个碱基的反向重复序列组成，所述 反向重复序列由3个或更多个碱基的"环"隔开，后接富含T (脱氧胸苷）的一个或多个碱 基的区域。反向重复序列富含G和C(脱氧鸟苷和脱氧胞苷）。类似地，可以通过就在转录 起始点的下游但在核糖体结合位点之前插入含有如上所述的茎-环但没有T-富集的区的 DNA序列，将茎-环构建到mRNA的5'端中。对于此的实例结合P15启动子（SEQ ID No. 1) 给出。
[0119] 在过表达tktA基因对经由莽草酸通路的碳流的作用的分析中，大肠杆菌菌株 MYR170被用作亲本菌株。MYR170在编码莽草酸脱氢酶的aroE基因中有缺失并在ack基因 座处具有aroB基因的额外拷贝。
[0120] 在图8、9和10所描绘的实验中，使用两种不同质粒，即pCP32AMP和pCP50。质粒 PCP32AMP仅从其原生启动子表达DAHP合酶aroG基因，质粒pCP50从其原生启动子表达转 酮醇酶基因 tktA连同aroG基因。用pCP32AMP和pCP50质粒单独转化具有aroE缺失和在 染色体DNA的ack基因座处整合的在P 15启动子控制下的aroB基因的额外拷贝的MYR170。 如图8所示，与仅表达aroG基因的大肠杆菌细胞相比，aroG基因连同tktA基因的表达使 DHS积累进一步增加。
[0121] 图9提供了用质粒pCP32AMP或pCP50转化的两种不同菌株即MYR34、MYR170中的 DHS产率的数据。具有aroE基因缺失的MYR34菌株每消耗1克葡萄糖产生0. 1克DHS。当 用具有aroG基因过表达的pCP32AMP质粒转化MYR34菌株时，该菌株中的DHS产率增至每 消耗1克葡萄糖产生〇. 15克DHS。MYR170具有在ack基因座处插入的aroB基因的额外拷 贝。由于存在aroB基因的该额外拷贝，用pCP32AMP转化的MYR170菌株中的DHS生产的产 率稍高于用PCP32AMP转化的MYR34菌株中所观察到的DHS产率。因此，MYR170中aroB的 额外拷贝的存在引起增加的经由莽草酸通路的碳流。当用表达aroG和tktA基因二者的质 粒PCP50转化MYR170菌株时，观察到DHS产率的进一步提高。因此，tktA的额外拷贝的存 在导致经由莽草酸通路的碳流的增加。更具体而言，存在额外的aroB和tktA基因的作用 引起对DHS产率的累加效应。
[0122] 图10中描绘的实验中所使用的MYR261被改造为在poxB基因座处将tktA基因的 额外拷贝整合到MYR170的染色体DNA中。MYR261菌株中期望的基因取代（poxB ::tktA) 通过PCR验证。用pCP32AMP (aroG过表达）质粒或pCP50 (aroG和tktA过表达）质粒转化 MYR261。作为对照，用pCP32AMP质粒转化MYR170。如图10所示的结果所显示的，与在用 相同质粒转化的MYR170菌株中所观察到的DHS生产的滴度相比，MYR261的染色体DNA中 tktA基因的额外拷贝的存在增加了 pCP32AMP质粒的DHS生产滴度。当用过表达转酮醇酶 的质粒PCP50转化菌株时，MYR261中转酮醇酶水平的进一步增加导致DHS生产滴度的进一 步提高。由PoxB编码的酶PoxB，或丙酮酸氧化酶，产生乙酸盐作为反应产物。这样，如本 文描述的因 tktA插入引起的poxB缺失去除了乙酸盐生产的潜在活性通路。类似地，同时 插入P15ar〇B并删除编码AckA或乙酸激酶的ackA，如在以下实施例12中所描述的，去除 了通向乙酸盐的另一潜在活性通路。乙酸盐产生在发酵中通常是不合人意的（Jantama等 人，2008b)。这样，这些缺失可以用于减少乙酸盐生产。
[0123] 图11提供了在用质粒pCP32AMP和pMG37转化后大肠杆菌MYR170、MYR261和 MYR305菌株中的黏康酸和乙酸生产的滴度。通过从染色体DNA中缺失poxB基因从MYR170 得到MYR305,而MYR261是MYR170衍生菌，其中poxB基因已经通过插入tktA基因的额外拷 贝而失活。如上所述，质粒PCP32AMP表达编码在莽草酸生物合成通路中起作用的DAHP合 酶蛋白的aroG基因，导致由于大肠杆菌菌株MYR170、MYR261和MYR305中aroE基因的缺失 的DHS的积累。由于质粒pMG37上黏康酸通路基因即aroZ、aroY和catAX的表达，DHS被 转化成顺，顺-黏康酸，如图2所示。在MYR261菌株中aroB基因和tktA基因的额外拷贝 的存在下，黏康酸生产稍有增加，伴随着乙酸积累的降低。
[0124] 实施例5
[0125] talA或talB的过表达
[0126] talB基因编码大肠杆菌中主要的转醛醇酶，但talA基因也编码小部分的转醛醇 酶。已知转醛醇酶的过表达提高进入芳族通路的流量（Lu和Liao, 1997 ;Sprenger，1995 ; Sprenger等人，1995b)。在现有技术中，这是通过在多拷贝质粒上从原生启动子过表达tal 基因（现在称为talB基因）而实现的（Lu等人，1997, Sprenger等人，1995b)。然而，这样 的质粒并不稳定，并且需要抗生素筛选以维持。因此，需要有改进的方法。可以例如通过用 强组成型启动子例如来自枯草芽孢杆菌噬菌体SPOl的P15或P26启动子（分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，或来自细菌噬菌体入的PR启动子（SEQ ID No. 3)来替代染色体中 的原生talB启动子来获得改进的talB表达。这通过如实施例1中描述的两步而实现，不同 在于在第一步骤中使用cam K，sacB盒来取代原生染色体talB启动子。在第二步中，通过用 线性DNA转化并进行蔗糖抗性选择而置入强组成型启动子，所述线性DNA包含强组成型启 动子，其侧翼是在强组成型启动子下游侧的talB编码区5'端的至少50个碱基和在强组成 型启动子上游侧的就在原生talB启动子上游的同源的至少50个碱基对。也可以通过相似 方法来过表达talA基因，但优选过表达talB基因，因为其编码主要活性（Sprenger，1995 ; Sprenger等人，1995b)。对于有关设计为用于过表达的表达盒的构建的更多细节,参见实 施例4。
[0127] 实施例6
[0128] aroZ、aroY 和 catAX 基因的表达
[0129] 为证实大肠杆菌所产生的内源性DHS转化成黏康酸，将来自不动杆菌属物种 ADPl的异源基因 catAX、来自肺炎克雷伯杆菌的aroY、和来自不动杆菌属物种ADPl的 quiC克隆到低拷贝质粒pCL1921中强组成型启动子（分别为P15、Pk和P26)下（Lerner和 Inouye, 1990)，以生成"黏康酸质粒"pMG37。携带空载体（pCL1921)或pMG37的MYR34衍 生菌在含有2%葡萄糖的摇瓶培养基（补充有芳族氨基酸和维生素的NBS基本培养基）中 在37°C生长17小时。收集上清液并通过HPLC分析。与显示DHS积累的MYR34/pCL1921成 对比，MYR34/pMG37显示黏康酸的产生（图12)。从后一菌株中没有检测到显著量的DHS或 中间体产物如PCA和儿茶酚，提示从pMG37表达的异源基因是有功能并且足够的。
[0130] 实施例7
[0131] aroZ同源物的比较
[0132] 比较三种不同的aroZ同源物和类似物（图13)将DHS转入黏康酸生产通路的 能力。来自不动杆菌属物种ADPl的quiC、来自苏云金芽孢杆菌的asbF和来自粗糙脉 孢菌的qa_4被报告为编码具有AroZ样活性的蛋白（Elsemore和Ornston, 1995 ;Fox等 人，1995 ;RUtledge，1984)。这些基因各自经密码子优化以用于在大肠杆菌中表达且通过 GeneArt (Invitrogen)合成，并克隆到还分别从P15和Pk启动子表达catAX和aroY基因的低 拷贝"黏康酸质粒"中强组成型P 26启动子下。MYR34/pCL1921、MYR34/pMG37 (以quiC作为 aroZ的黏康酸质粒）、MYR34/pMG47 (以asbF作为aroZ的黏康酸质粒）和MYR34/pMG70 (以 asbF作为aroZ的黏康酸质粒）在具有含2%葡萄糖、芳族氨基酸和芳族维生素的基本培 养基的摇瓶中在37°C生长48小时。收集上清液并通过HPLC分析。如所预期的，转化空载 体的MYR34积累DHS且不产生黏康酸。检查的两种aroZ同源物和一种类似物在将DHS转 向黏康酸生产中是有功能的，但程度不同。表达quiC基因的MYR34衍生菌最为强烈，显示 近乎100%的DHS向黏康酸的转化和微乎其微的DHS存留量。表达真菌aroZ同源物qa-4 的MYR34衍生菌以约80 %的DHS向黏康酸的转化和20 %的DHS存留紧接其后。最后，表达 asbF基因的MYR34衍生菌显示仅50%的DHS向黏康酸的转化和50%的DHS存留。汇总而 言，在我们的摇瓶测定条件下，与其它aroZ同源物相比，quiC基因的表达和/或活性看起 来是最1?的。
[0133] 实施例8
[0134] catAX、aroY和quiC的染色体整合
[0135] 可以通过含有仅在adhE基因座处染色体整合的从组成型启动子表达的catA-X、 aroY和quiC的单拷贝的菌株来生产黏康酸。
[0136] 高 DHS 生产菌-MYR170( AaroE, Aack: :P15_aroB)，是用于在染色体中 adhE 基 因座处整合黏康酸通路基因的宿主菌（SEQ ID No. 41)。对所得的菌株MYR352转化质粒 YEp24 (中拷贝，空载体）、pCP32AMP (中拷贝，aroG从原生启动子表达）或pCP50 (中拷贝， aroG和tktA从其各自的原生启动子表达），以生成衍生菌株。后两种质粒用于增加 DHS产 量。菌株在37°C在如上所述的含2%葡萄糖的摇瓶培养基中生长72小时。在72小时收集 上清液并通过HPLC分析。如所预期的，与空载体对照相比，转化有aroG和aroG/tktA的 MYR352衍生菌显示出总产物形成的整体提高（图14)。所有的MYR352转化子生产可测量 滴度的黏康酸，首次证明黏康酸可以由仅含有整合的"黏康酸通路"基因的菌株生产且不需 要补料基因表达的化学诱导物。
[0137] 任何这些MYR352衍生菌中产生的DHS并非全被转化成终产物黏康酸。相反，有显 著量的儿茶酚积累（图14)，提示当catAX在染色体上从单拷贝表达时，其表达或活性是限 制性的。由于主要的积累中间体是儿茶酚，可能在用于黏康酸合成的MYR352菌株背景中 quiC和aroY基因表达和/或活性是充足的。
[0138] 将MYR352衍生菌与类似的MYR219衍生菌平行比较。MYR219菌株与MYR170菌株 相同，但含有表达黏康酸通路基因的低拷贝质粒PMG37。因此，MYR352与MYR219菌株的主 要区别涉及到黏康酸通路基因的剂量（分别为1个拷贝vs.约5个拷贝）。与MYR352衍生 菌相反，MYR219衍生菌显示出极少的儿茶酚或其它中间体的积累，并成功地生产终产物黏 康酸。总的来说，这些结果表明需要提高菌株例如MYR352中的catAX活性。
[0139] 实施例9
[0140] catAX 的表达
[0141] MYR352菌株中儿茶酚的积累和不足的黏康酸生产是由于catAX基因产物的有限 剂量和/或活性。如上所述，MYR352含有AaroE，Aack ::P15-aroB和强组成型启动子下的 染色体整合的catAX、ar〇Y和quiC基因的单拷贝。用中拷贝的空载体对照（YEp24)或aroG/ tktA表达质粒（pCP50)转化该菌株以增加进入芳族氨基酸合成通路的碳流并生产大量的 DHS。转化的菌株在如上所述的补充有2%葡萄糖的摇瓶培养基中在37°C生长72小时，导 致儿茶酚中间体的积累。该结果提示catAX活性在MYR352中可能不足。为验证该假设，测 试一种或多种从低拷贝质粒表达的黏康酸通路基因减弱MYR352/pCP50中儿茶酚积累的能 力（图15)。具体而言，还用低拷贝的空载体对照（pCL1921)或表达黏康酸生产通路的所有 三种基因、两种基因或一种基因的质粒转化MYR352/pCP50。在如上所述的摇瓶实验中测定 衍生菌。尽管单独增加 aroY (来自pMG27)或单独增加 quiC (来自pMG39)的剂量并未减少 儿茶酚积累，但所有的黏康酸通路基因（来自PMG37)的表达或catAX和aroY(来自pMG33) 共同的表达导致成功地将儿茶酚转化成黏康酸。此外，单独表达catAX(来自pMG31)足以 生产黏康酸和防止儿茶酚积累。
[0142] 实施例10
[0143] 构建渗漏aroE突变
[0144] 在用于生产顺，顺-黏康酸的现有技术方法中，宿主菌株含有名为aroE353的aroE 基因突变，其是无效突变。结果，该菌株需要补料从莽草酸通路制备的芳族氨基酸（苯丙氨 酸、酪氨酸和色氨酸）和芳族维生素（对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸，和2, 3-二羟基苯甲 酸）。在商业上有吸引力的方法中补料芳族氨基酸太过昂贵。这样，现有技术方法需要实质 的改进。这可以通过置入渗漏aroE基因（我们会将其称为aroE*)而实现。渗漏突变通过 首先产生使aroE编码序列中的一个氨基酸改变引起无效表型的错义突变而获得。这可以 通过任何形式的诱变和筛选对于以上列出的六种芳族化合物的同时营养缺陷型而实现。优 选方法是利用Taq DNA聚合酶，使用野生型大肠杆菌C基因组DNA作为模板，并使用与aroE 编码区上游的约1000个碱基对和下游的1000个碱基对杂交的PCR寡核苷酸引物，通过易 错PCR诱变来产生突变体aroE基因池。所得的线性DNA分子池用于转化产生顺，顺-黏 康酸并且含有已经取代aroE编码区的整合的camR, sacB盒（对于相关实例参见实施例4) 的大肠杆菌C衍生菌，并进行蔗糖抗性选择。然后对转化子筛选已经失去氯霉素抗性并且 需要以上列出的六种芳族化合物的营养缺陷型。挑取数个独立的营养缺陷型并通过在没有 六种芳族化合物的基本葡萄糖板上铺板约1〇 7、1〇8、或IO9细胞（在基本葡萄糖培养基中漂 洗）来测试可复原力（revertability)。挑取在板上产生菌落的复原体并进行顺，顺-黏康 酸产生但没有实质性水平的芳族氨基酸产生的测试。在这些复原体中将有这样的菌株，所 述菌株携带aroE基因中的一个或多个突变，从而使AroE酶提供充足的芳族氨基酸和维生 素用于生长、但又没有这些芳族化合物的剩余。获得渗漏aroE突变体的另一方法是向顺， 顺-黏康酸生产菌中置入经典的可回复的aroE突变体如aroE353和aroE24(均可从Yale University 的 Coli Genetic Stock Center, New Haven, CT, USA得到）之一，并如上所述选 择复原体。
[0145] 实施例11
[0146] 通过易化扩散的葡萄糖输入
[0147] 芳族通路的第一个关键步骤中的底物之一是磷酸烯醇丙酮酸（PEP)。PEP也是用 于通过细菌磷酸转移酶体系（PTS)输入葡萄糖和一些其它糖类的磷酸盐和能量的来源。因 此，当细菌在PTS-依赖性的糖上生长时，在PTS和芳族通路之间存在对PEP的竞争。这样， 可以通过删除PTS并提供可选的糖摄取通路来实现增加芳族通路流量的显著改进。该问题 的一个解决方案是用大肠杆菌GalP通透酶，对于葡萄糖摄取起相当好作用的质子同向转 运蛋白（US专利6, 692, 794)取代PTS。然而，质子同向转运蛋白仍然耗用能量以维持驱动 通透酶所必需的质子梯度。这样，对于方法的进一步改进存在需求。
[0148] 一些糖，例如木糖，可以由从ATP(三磷酸腺苷）的水解获得能量的转运蛋白运输。 再一次地，如果可以用需要较少能量的转运蛋白来取代能量依赖性的转运蛋白，那么可以 获得改进，因为ATP中固有的能量得以保存用于其它有益用途。
[0149] 可以通过利用在糖输入中不耗用能量的易化扩散转运蛋白来获得显著改进 (Parker等人，1995 ;Snoep等人，1994)。例如，由gif基因编码的来自运动发酵单孢菌 (Zymomonas mobilis)的葡萄糖易化蛋白可以用于代替或额外加至3-脱氢莽草酸盐（DHS) 生产菌株中的PTS (Yi等人，2003)。然而，这些菌株仍然至少部分依赖于GalP进行葡萄糖 输入。由于GalP需要质子梯度形式的能量用于葡萄糖输入，有需求提高黏康酸生产菌株的 葡萄糖输入效率。
[0150] 用于gif加上葡糖激酶基因 glk(也来自运动发酵单孢菌）的表达的盒可以与强 组成型启动子如P26组装。然后可以将该盒在不妨碍期望的化合物（在这种情况下为顺， 顺-黏康酸）的生产的位置处整合到宿主菌株的基因组中。大肠杆菌染色体中这样的位置 的实例是苏氨酸降解操纵子，tdcABCDEFG。如果生长培养基不含苏氨酸，则不需要操纵子或 该操纵子不表达，由此在该操纵子中插入表达盒不会妨碍代谢。
[0151] 为实现上述的改进，利用与实施例1中所公开内容相似的方法将一个或多个编码 PTS功能的基因缺失。例如可以缺失ptsH、ptsI、err或ptsG中的一个或多个。接着缺失 galP。然后可以在两步步骤中置入P26_glf，glk盒，与实施例1中所描述内容相似。在第一 步中，利用源自PAC21 (SEQ ID No. 15)的线性DNA在tdc操纵子处整合camK，sacB盒，并进 行氯霉素（30mg/l)抗性选择。在第二步骤中，利用源自pAC19(SEQ ID No. 15)的线性DNA 在tdc操纵子处整合P26-glf，glk盒，进行蔗糖抗性选择并进行氯霉素敏感度筛选，在这种 情况下是在基本葡萄糖培养基上的改进生长。
[0152] 为测试葡萄糖的易化扩散是否能替代大肠杆菌中常规的葡萄糖输入体系，从 MYR34 (AaroE)中缺失ptsHI基因和galP基因，然后利用源自pAC19(SEQ ID No. 14)的线 性DNA在tdc操纵子处整合P26-glf，glk盒，得到菌株MYR217。MYR217在补充有所需的三 种芳族氨基酸和三种芳族维生素样化合物的基本葡萄糖培养基上生长相当好（图16)。然 而，含有PtsHI和galP缺失但不含有glf，glk盒的菌株MYR31并未显示出任何可测量的生 长（图16)。因此，易化扩散足以取代我们的菌株背景中的两种常规葡萄糖输入体系。
[0153] 为测试易化扩散是否可用于生产源自芳族通路的化合物，用pCP54(ar〇G，aroB) 和pCP55(aroG，aroB，tktA)转化MYR34和MYR217。对这两种菌株比较摇瓶中芳族中间体 3_脱氢莽草酸盐（DHS)的生产（图17)。在pCP54或pCP55的情况下，利用易化扩散的菌 株产生与利用常规葡萄糖输入体系的菌株相比同样多或更多的DHS。DHS生产是经改造的 大肠杆菌菌株中黏康酸生产的良好代表，因此我们可以得出结论，葡萄糖的易化扩散对于 黏康酸生产是有用的改进。
[0154] 实施例12
[0155] aroB基因的过表达
[0156] 据报道aroB基因的表达对于顺，顺-黏康酸生产是限速性的（Niu等人，2002)。 在现有技术中，据称这是通过整合aroB基因的第二拷贝与其原生启动子而解决的。然而， 这并不足以缓解aroB限制，因为aroB基因的原生启动子和核糖体结合位点还远不够理想。 这样，该方法需要实质的改进。
[0157] 可以例如通过用强组成型启动子例如来自枯草芽孢杆菌噬菌体SPOl的P15或P 26 启动子（分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，或来自细菌噬菌体入的Pk启动子（SEQ ID No. 3)来替代染色体中的原生aroB启动子来获得改进的aroB过表达。这通过如实施例4 中描述的两步而实现，不同在于在第一步骤中使用cam K, sacB盒来取代原生染色体aroB启 动子和/或核糖体结合位点。在第二步中，通过用线性DNA转化并进行蔗糖抗性选择而置 入强组成型启动子，所述线性DNA包含强组成型启动子，后接核糖体结合位点和在强组成 型启动子的下游侧的自aroB编码序列5'端的至少50个碱基（包括ATG起始密码子），以 及在强组成型启动子上游侧的就在原生aroB启动子上游的同源的至少50个碱基对。除了 置入更强启动子外或代替置入更强启动子，利用相似方法，可以在aroB的ATG翻译起始密 码子上游的约4至10个碱基对处置入更强的核糖体结合位点例如AGGAGG。这样的合成盒 例如P 15-aroB盒的拷贝可以在不同于原生aroB基因座的基因座处例如在ack基因座处整 合到染色体中。如实施例4中同时缺失ack基因并缺失poxB基因可帮助减少发酵过程中 不希望的乙酸盐形成。
[0158] 实施例13
[0159] 降低经由戊糖磷酸通路的氧化分支的流量
[0160] 芳族通路中第一关键步骤所需的赤藓糖-4-磷酸来源于戊糖磷酸通路（PPP)的非 氧化部分。存在两种不同的通路可让碳进入PPP。第一种是从葡萄糖-6-磷酸通过酶葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶（由zwf基因编码）、6_磷酸葡糖酸内酯酶（由pgl基因编码）和6-磷 酸葡糖酸脱氢酶（由gnd基因编码），得到核酮糖-5-磷酸。在这三个步骤的最后，一个碳 作为CO 2损失。这种进入PPP的通路称为PPP的氧化分支。核酮糖-5-磷酸然后通过异构 酶、差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶的作用被转化成多种其它糖磷酸盐。这组起始于核 酮糖-5-磷酸的可逆反应被称为PPP的非氧化分支。第二种碳进入PPP的通路是通过果 糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸（二者都来自Embden-Myerhoff通路，也称为糖酵解），它们 可经转醛醇酶和转酮醇酶组合和重排而得到多种其它糖磷酸盐，其中之一是赤藓糖-4-磷 酸。如果碳是通过该第二途径进入PPP，则没有CO 2损失。为了提高自葡萄糖的顺，顺-黏康 酸产率，通过阻断PPP的氧化分支从而使所有进入PPP的碳必须经历自果糖-6-磷酸和甘 油醛-3-磷酸的非氧化途径，可以防止CO 2损失。利用与实施例1所公开的用于缺失tyrR 基因的内容相似的两步法，通过缺失zwf基因来完成PPP氧化分支的阻断。
[0161] 实施例14
[0162] 增加通向芳族通路和经由PEP通向芳族通路的流量
[0163] 理想的是确保PEP不是顺，顺-黏康酸通路上的限速中间体。这是例如，通过增 加丙酮酸通过酶PEP合成酶向PEP的再循环而实现的，这是通过如以上在其它实施例中 所描述的整合pps基因的过表达盒而实现的。另一方法是限制丙酮酸激酶的PEP消耗，丙 酮酸激酶在大肠杆菌中由PykA和pykF基因编码。在这种情况下，方法是降低（一种或 多种）酶的活性。这是通过缺失一种或多种编码丙酮酸激酶的基因（如实施例1中对于 tyrR所描述的），或降低这些基因中的一种或多种的表达强度，如通过突变启动子、核糖体 结合位点或编码序列从而使丙酮酸激酶活性的水平降低而实现的。例如，大肠杆菌PykA基 因之前的RBS是5' CGGAGTATTACMS。ATG翻译起始密码子加下划线。该序列可以突变成 CaGAGTATTACATG. CaaAGTATTACATG. CaatGTATTACATG. CaataTATTACATG 等等，从而通过一次 一个碱基变化使RBS序列变得与AGGAGG的共有RBS更加不同。然后将各个突变的形式引 入到染色体中PykA基因座处，取代野生型，并测量黏康酸生产水平的改进。
[0164] 实施例15
[0165] 赋予蔗糖上的生长
[0166] 源自大肠杆菌C的菌株不能以蔗糖作为唯一碳源生长。然而，如PCT专利申请PCT/ US11/064598中（在此整体地并入本文以作参考）所公开的，它们可经基因改造而如此生 长。这样，可以改造顺，顺-黏康酸生产菌株使其在蔗糖上生长，如以上提及的申请中所公 开的那样。
[0167] 实施例16
[0168] 改进的顺，顺-黏康酸生产者
[0169] 可以通过一个接一个地安置特征将实施例1-15中所描述的所有特征组合到一株 大肠杆菌菌株中。所得的菌株包含改进的顺，顺-黏康酸生产者。随后可通过在与第一拷贝 的位置隔开的位置，一次一个地整合各个上述过表达盒的第二拷贝，对所得菌株进行再进 一步的改进。方便且安全的位置的实例是在就在rrfF(其编码核糖体RNA)的终止子下游的 BsrBl限制性位点。期望的盒作为平端线性DNA连接到质粒pMH17F(SEQ ID No. 17)中唯一 的BsrBl位点。实例是catAX表达盒连接以得到名为pcatAX的质粒。平行地，camK，sacB 盒作为平端片段连接到PMH17F中以得到pMH28F(SEQ ID No. 19)。使用通过PCR或通过限 制性酶切从PMH28得到的线性DNA在rrfF位点处保存camK，sacB盒。接着，利用在蔗糖 上选择，使用通过PCR或通过限制性酶切从pcatAX得到的线性DNA在rrfF基因座处安置 catAX盒的第二拷贝。然后将所得的菌株与祖代亲本菌株比较顺，顺-黏康酸生产，以确定 catAX是限制性步骤。通过相似的方法，对来自实施例2-15的各个盒测试限速步骤。如果 发现步骤是限速性的，则在染色体的另外其它合适位置处整合相关盒的一个或多个额外的 拷贝，引起顺，顺-黏康酸生产的更进一步改善，而不需要质粒或可诱导的启动子。
[0170] 实施例17
[0171] 通过发酵生产顺，顺-黏康酸
[0172] 可以通过以上实施例1-15中所公开的经基因改造的微生物来生产顺，顺-黏康 酸。生长培养基可以广泛地不同，并且可以是任何支持微生物充分生长的培养基。优选的 培养基是含有矿物盐和非芳族碳源例如葡萄糖、木糖、乳糖、甘油、乙酸、阿拉伯糖、半乳糖、 甘露糖、麦芽糖或蔗糖的基本培养基（关于优选基本生长培养基的实例参见上文）。对于 经改造的微生物和生长培养基的各个组合，通过常规实验来确定生产顺，顺-黏康酸的合 适条件，在所述常规实验中，发酵参数系统性地变化，例如温度、pH、通气速率和用于维持pH 的化合物。随着顺，顺-黏康酸产生，必须向发酵罐中补料一种或多种化合物以防止pH变 得太低。用来中和酸的优选化合物包括碱性盐，如铵、钠、钾、钙、镁的氧化物、氢氧化物、碳 酸盐和碳酸氢盐，或者两种或更多种的这类碱盐的组合。
[0173] 大肠杆菌MYR428菌株在7升发酵罐中的黏康酸生产示于图18。对具有基因 型 A aroE A ackA: :P15_aroB A p〇xB: : tktA 的大肠杆菌 MYR261 菌株转化质粒 pCP32AMP 和 PMG37以产生MYR428。MYR428在如上所述的7升发酵罐中以葡萄糖补料生长48小时。最 终黏康酸滴度为16g/l (参见图18)。
[0174] 在发酵完成后，通过絮凝、离心和/或过滤来移除细胞，然后通过一个或多个后续 步骤例如沉淀、结晶、电渗析、层析（离子交换型、疏水亲和性、和/或基于尺寸的）、微滤、纳 滤、反渗透和蒸发的组合从澄清发酵液中纯化顺，顺-黏康酸。
[0175]
【权利要求】
1. 从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的经基因改造的微生物，其中将所有编码在 黏康酸通路中起作用的蛋白质的基因整合到所述微生物的染色体DNA中。
2. 权利要求1的经基因改造的微生物，其中所述编码在黏康酸通路中起作用的蛋白质 的基因选自由aroZ、qa_4、asbF、quiC、aroY、和catAX组成的组。
3. 权利要求1的经基因改造的微生物生物体，其包含编码不动杆菌属 (Acinetobacter)细菌的QuiC酶或所述QuiC酶的同源物的基因。
4. 权利要求1的经基因改造的微生物，其包含一种或多种编码在莽草酸通路中起作用 的蛋白质的外源基因。
5. 权利要求4的经基因改造的微生物，其中将所述编码在莽草酸通路中起作用的蛋白 质的外源基因中的一种或多种整合到所述生物体的染色体DNA中。
6. 权利要求4的经基因改造的微生物，其中所述编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质 的外源基因选自由 aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe 和 rpi 组成的组。
7. 权利要求4的经基因改造的生物体，其中所述编码在黏康酸通路或莽草酸通路中起 作用的蛋白质的基因无一从需要补料化学品用于诱导的启动子表达。
8. 权利要求1的经基因改造的宿主细菌，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的活 性实质上降低或消除。
9. 权利要求8的经基因改造的微生物，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白是TyrR 蛋白或TyrR蛋白的同源物。
10. 权利要求8的经基因改造的微生物，其中编码芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白 的基因已被突变。
11. 权利要求1的经基因改造的生物体，其包含编码渗漏AroE酶的aroE基因。
12. 权利要求1的经基因改造的微生物生物体，其中至少一种在莽草酸通路中有活性 的酶实质上抵抗所述微生物的代谢物的抑制。
13. 权利要求12的经基因改造的生物体，其包含aroG*基因，所述aroG*基因编码实质 上抵抗苯丙氨酸抑制的DAHP合酶。
14. 权利要求12的经基因改造的生物体，其包含编码DAHP合酶的aroG*基因，所述 aroG* 基因选自由 aroG*20-893、aroG*20-897、aroG*20-899、aroG*20-901、aroG* 111、 aroG*211、aroG*212、aroG*311、aroG*312、aroG*411、aroG*412 和 aroG*511 组成的组。
15. 权利要求I的经基因改造的微生物，其中所述微生物是细菌。
16. 权利要求1的经基因改造的微生物，其中所述微生物衍生自大肠杆菌 (Escherichia coli)C〇
17. 经基因改造的细菌，其在PEP依赖性磷酸转移酶体系中有缺陷、在用于葡萄糖输入 的基于GalP蛋白的体系中有缺陷，且包含编码功能性的葡萄糖易化扩散蛋白的外源基因。
18. 如权利要求17中的经基因改造的细菌，其中功能性的葡萄糖易化扩散蛋白是由 gif?基因编码的Glf蛋白。
19. 如权利要求17中的经基因改造的细菌，还包含编码葡糖激酶的外源基因。
20. 如权利要求17中的经基因改造的细菌，还包含一种或多种外源基因，所述外源基 因编码在从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的黏康酸通路中起作用的蛋白质。
21. 权利要求20的经基因改造的细菌，其中所述编码在黏康酸通路中起作用的蛋白质 的基因选自由aroZ、qa_4、asbF、quiC、aroY和catAX组成的组。
22. 如权利要求17中的经基因改造的细菌，还包含一种或多种在染色体上整合的外源 基因，所述外源基因编码在莽草酸通路中起作用的蛋白质。
23. 如权利要求22中的经基因改造的细菌，其中所述编码在莽草酸通路中起作用的蛋 白质的外源基因选自由aroB、aroD、aroF、aroG、aroH、tktA、talB、rpe和rpi组成的组。
24. 权利要求17的经基因改造的细菌，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的活性 被实质上降低或消除。
25. 权利要求17的经基因改造的细菌，其中芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白是TyrR 蛋白或TyrR蛋白的同源物。
26. 权利要求17的经基因改造的细菌，其中编码芳族氨基酸生物合成的负调节蛋白的 基因已被缺失或突变。
27. 权利要求17的经基因改造的细菌，其中至少一种在莽草酸通路中有活性的酶实质 上抵抗所述微生物的代谢物的抑制。
28. 权利要求17的经基因改造的细菌，其中所述微生物衍生自大肠杆菌C。
29. 从非芳族碳源开始生产顺，顺-黏康酸的经基因改造的微生物，其中编码在黏康酸 通路和莽草酸通路中起作用的蛋白质的外源基因不从需要补料化学品用于诱导的启动子 表达。
30. 如权利要求29中的经基因改造的微生物，其中所述微生物是细菌。
31. 如权利要求29中的经基因改造的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
32. 从非芳族碳源开始产生顺，顺-黏康酸的经基因改造的微生物，所述微生物包含编 码渗漏AroE酶的aroE基因。
33. 如权利要求32中的经基因改造的微生物，其中所述微生物是细菌。
34. 如权利要求32中的经基因改造的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
【文档编号】C12P7/40GK104220587SQ201380017560
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年1月29日 优先权日:2012年1月30日
【发明者】R·R·约卡姆龚巍, S·多勒, R·西勒斯, M·甘地, J·G·佩罗 申请人:麦兰特公司