24:02的方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明以提供高精度且简便地、并且能在减少污染风险的同时特异性地检测HLA-A*24:02等位基因的方法为课题。作为其解决手段，本发明提供了含有下述PCR引物的引物组、包含所述引物组的试剂盒以及利用所述试剂盒的方法，所述PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3’末端开始到至少第16位的DNA序列。
【专利说明】检测HLA-A*24:02的方法及检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测HLA-A*24:02的方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 近年来，新的肿瘤特异性抗原相继被鉴定出来，与之相伴，正逐渐进行对新的免疫 疗法的开发。其中，癌免疫疗法中，在生物体内诱导出肿瘤抗原特异性的CD8阳性T细胞的 疫苗疗法是主流。与利用疫苗疗法的癌免疫疗法相关的多种临床应用已在进行。通过对作 为肿瘤特异性抗原的一部分的10个左右的氨基酸残基结合至HLA分子而形成的肤，HLA复 合体的识别，诱导出肿瘤特异性的CD8阳性T细胞。利用其开发了将结合至HLA的肤作为 抗原的肤疫苗疗法。
[000引现化日本国内正在进行利用结合至（日本人多数具有的）HLA-A*24:02的肤的肤 疫苗疗法的开发。通过施用该种肤预期能获得效果的仅限于保持有HLA-A*24:02等位基因 (allele)的患者。因此，需要在施用前预先确认对象患者保持有HLA-A*24:02。
[0004] 对HLA检验而言，DM分型（DMtyping)是现在最通常的检验方法，作为代表性 技术，已知PCR-SBT(基于测序的分型）、PCR-SS0 (序列特异性寡核巧酸）及PCR-SSP(序列 特异性引物）等。
[000引作为肤疫苗施用前检测HLA-A*24的方法，报道了基于PCR-SSR的方法（非专利文 献1)。
[0006] 现有技术文献
[0007] 非专利文献
[0008]非专利文献 1iP'JakatsugawaM等人，ComparisonofspeedyPCR-sspmethod andserologicaltypingofHLA-A24forJapanesecancerpatients.,Journalof ImmunoassayandImmunochemistry，2011 年 4 月，32 (2)，pp. 93-102
【发明内容】
[0009] W往的方法中，PCR-SBT存在下述问题：必须要用测序化来解读HLA基因的DM序 列，操作繁杂，并且为了分析需要专口的软件。另外，W往的PCR-SSP中，存在为了提高正确 性必须增加引物组数量的问题。此外，W往的PCR-SSP中，必须通过电泳来确认PCR产物， 因此有污染风险。污染风险（尤其在基因检验的领域中）将大大损害可靠性。
[0010] 利用PCR-SBT时，因为存在上述问题，所W并不简便，虽然其可特异性地仅检测 HLA-A*24:02等位基因。然而W往的PCR-SS0和PCR-SSP不能特异性地仅检测HLA-A*24:02 等位基因。
[0011] 因此，本发明的课题为提供较之W往的方法而言更简便、并且能在减轻污染风险 的同时、特异性地检测HLA-A*24:02等位基因的方法。
[001引本申请的发明人着眼于A*24:02:01:01和A*24:20各自的碱基序列中仅在W下位 置有所不同；HLA第211位的碱基在A*24:02:01:01中为C，而在A*24:20中则为A。本申 请的发明人发现，通过W该第211位的碱基作为祀标碱基，将在该祀标碱基处形成错配的 正向PCR引物、与规定的反向PCR引物和序列特异性结合探针组合并进行实时PCR，能够特 异性地检测HLA-A*24:02等位基因。
[0013] 本发明是基于上述新发现、通过进一步努力研究而完成的。本发明包括下述实施 方式。
[0014]项 1 :
[0015]引物组，其含有：
[0016] (A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3'末端 到至少第16位的DNA序列。
[0017] 项 2 ;
[0018]引物组，其含有：
[0019] 项1中记载的引物（A1)，及
[0020] (A。反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3'末端 到至少第20位的DNA序列。
[002。项3:
[0022] 实时PCR用试剂盒，其含有：
[002引根据项1或2所述的引物组，及
[0024]炬）下述寡核巧酸经标记而形成的序列特异性结合探针，所述寡核巧酸包含序列 号3表示的DNA序列的部分序列或其互补序列，所述部分序列是包含第429、437、440、442、 443、447和449位的碱基中的任一碱基的15?25个碱基的连续的DNA序列。
[00巧]项4:
[0026] -种方法，用于判定人DNA检测样品是否来源于具有HLA-A: 24:02的人，所述方法 包括下述工序：
[0027] 工序（1)，W人DNA检测样品为模板，使用根据项3所述的试剂盒进行实时PCR;及
[0028] 工序（2)，将在工序（1)中检测到信号的人DNA检测样品确定为来源于具有 HLA-A:24:02的人的检测样品。
[0029]项 5:
[0030]HLA-A:24:02限制性肤疫苗施用对象群的筛选方法，所述方法包括下述工序： [003。工序（1)，W人DNA检测样品作为模板，使用根据项3所述的试剂盒进行实时PCR; 及
[003引工序（2)，将作为在工序（1)中检测到信号的人DNA检测样品的采集来源的人选择 为施用HLA-A:24:02限制性肤疫苗的对象。
[0033] 通过本发明，能够提供高精度且简便地、进而能在减少污染的风险的同时、特异性 地检测HLA-A*24:02等位基因的方法。
[0034]附图简沐
[00；35]图 1 为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组（A)和A*24:02检测用探针（i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的 图。
[0036]图 2 为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组（A)和 A*24:02 检测用探针（i)对HLA-A*24:20/02:06 的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的 图。
[0037]图 3 为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组（A)和 A*24:02 检测用探针（i)对HLA-A*02:01/02:06 的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的 图。
[0038] 图 4 为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组（A)和 A*24:02 检测用探针（i)对HLA-A*ll:01/ll:01的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的 图。
[0039]图 5 为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组（A)和 A*24:02 检测用探针（i)对HLA-A*23:01/29:01 的基因组DNA进行实时PCR得到的结果的 图。
[0040]图 6 为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组（A)和 A*24:02检测用探针（i)对TE缓冲液（阴性对照）进行实时PCR得到的结果的图。
[0041] 图7为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组炬）和 A*24:02检测用探针（i)对HLA-A*24:02/02:06的基因组DM进行实时PCR得到的结果的 图。
[0042]图8为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组（B)和 A*24:02检测用探针（i)对HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01 及HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DM、W及TE缓冲液（阴性对照）进行实时PCR得到 的结果的图。
[004引图9为表示使用如antiTectMultiplexPCR试剂盒、引物组（A)和A*24:02检测 用探针（i)对化4-4*24:02/02:06的基因组0臟进行实时？0?得到的结果的图。
[0044] 图10为表示使用如antiTectMultiplexPCR试剂盒、引物组（A)和A*24:02检 测用探针（1)对化4-4*24:20/02:06的基因组0臟进行实时？0?得到的结果的图。
[0045] 图11为表示使用如antiTectMultiplexPCR试剂盒、引物组（A)和A*24:02检 测用探针（1)对化4-4*02:01/02:06的基因组0臟进行实时？0?得到的结果的图。
[0046] 图12为表示使用如antiTectMultiplexPCR试剂盒、引物组（A)和A*24:02检 测用探针（1)对化4-4*11:01/11:01的基因组0臟进行实时？0?得到的结果的图。
[0047] 图13为表示使用如antiTectMultiplexPCR试剂盒、引物组（A)和A*24:02检 测用探针（1)对化4-4*23:01/29:01的基因组0臟进行实时？0?得到的结果的图。
[0048] 图14为表示使用如antiTectMultiplexPCR试剂盒、引物组（A)和A*24:02检 测用探针（i)对TE缓冲液（阴性对照）进行实时PCR得到的结果的图。
[0049] 图15为表示使用如antiTectMultiplexPCR试剂盒、引物组炬）和A*24:02检 测用探针（1)对化4-4*24:02/02:06的基因组0臟进行实时？0?得到的结果的图。
[0050] 图16为表示使用如antiTectMultiplexPCR试剂盒、引物组做和A*24:02 检测用探针（i)对HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01 及 HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DNA、W及TE缓冲液（阴性对照）进行实时PCR得到的 结果的图。
[0051] 图17为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组炬） 和A*24:02检测用探针（i)对HLA-A*24:02/02:06 的基因组DM进行实时PCR得到的结果 的图。
[0052]图 18 为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组（B)和 A*24:02 检测用探针（i)对HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01 及HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DM、W及TE缓冲液（阴性对照）进行实时PCR得到 的结果的图。
[0053] 图19为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组炬） 和A*24:02检测用探针（i)、W及IPC用引物组及IPC用探针（i)对HLA-A*24:02/02:06的 基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
[0054] 图20为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组炬） 和A*24:02检测用探针（i)、W及IPC用引物组及IPC用探针（i)对HLA-A*24:02/02:06的 基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
[0(巧引 图21为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组炬） 和A*24:02检测用探针（i)、W及IPC用引物组及IPC用探针（i)对HLA-A*02:01/02:06的 基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
[0056] 图22为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组炬） 和A*24:02检测用探针（i)、W及IPC用引物组及IPC用探针（i)对HLA-A*11:01/11:01的 基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
[0057] 图23为表不使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组炬） 和A*24:02检测用探针（i)、W及IPC用引物组及IPC用探针（i)对HLA-A*23:01/29:01的 基因组DNA进行实时PCR得到的结果的图。
[0058] 图24为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、引物组炬） 和A*24:02检测用探针（i)、W及IPC用引物组及IPC用探针（i)对TE缓冲液（阴性对照） 进行实时PCR得到的结果的图。
[0059] 图25为代替示意图的照片，其表示使用化qMan(注册商标）GeneExpression MasterMix、引物组炬）和A*24:02检测用探针（i)、W及IPC用引物组及IPC用探针（i) 对HLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01 及 HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DNA、W及TE缓冲液（阴性对照）分别进行实时PCR之 后、将各PCR产物供给至琼脂糖电泳得到的结果。
[0060] 图26为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、包含序列 号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引 物、和A*24:02检测用探针（i)或（ii)、W及IPC用引物组及IPC用探针（i)或（ii)对 HLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、HLA-A*11:01/11:01 及 HLA-A*23:01/29:01各自的基因组DM、W及TE缓冲液（阴性对照）分别进行实时PCR得 到的结果的图。
[0061] 图27为表示使用"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix、包含序列 号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23表示的DNA序列的反向PCR引物、 和A*24:02检测用探针扣）、W及IPC用引物组及IPC用探针（ii)，在使引物和探针的 浓度分别变化的同时，对HLA-A*24:02/02:06、HLA-A*24:20/02:06、HLA-A*02:01/02:06、 HLA-A* 11:01/11:01及HLA-A*23:01 /29:01各自的基因组DM、W及TE缓冲液（阴性对照） 分别进行实时PCR得到的结果的图。
[006引图28为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23 表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针扣）、W及IPC用引物组及IPC用 探针（ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
[006引图29为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23 表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针扣）、W及IPC用引物组及IPC用 探针（ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
[0064] 图30为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23 表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针扣）、W及IPC用引物组及IPC用 探针（ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
[0065] 图31为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23 表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针扣）、W及IPC用引物组及IPC用 探针（ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
[006引图32为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23 表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针扣）、W及IPC用引物组及IPC用 探针（ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
[0067] 图33为表示使用包含序列号12表示的DNA序列的正向PCR引物和包含序列号23 表示的DNA序列的反向PCR引物、和A*24:02检测用探针扣）、W及IPC用引物组及IPC用 探针（ii)，对来源于日本人的细胞株基因组100份样品进行实时PCR得到的结果的图。
【具体实施方式】
[0068] 1.引物纽
[0069] 1. 1巿向引物（A1)
[0070] 本发明的引物组为含有下述（A1)的引物组：
[0071] (A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3'末端 到至少第16位的DNA序列。
[007引序列号1相当于HLA的DNA序列的第190?211位的部分序列。
[007引正向PCR引物（A1)为包含序列号1表示的DNA序列中从3'末端到优选第16、17、 18、19、20或21位、更优选到第19位的DNA序列的寡核巧酸。
[0074]正向PCR引物（A1)中，位于3'末端的碱基、即与HLA的DNA序列的第211位碱基 相应的碱基为C。A*24:02:01:01和A*24:20的HLA碱基序列仅在W下位置有所不同；分别 地，HLA的第211位的碱基在A*24:02:01:01中为C，而在A*24:20中则为A。因此，若正向 PCR引物（A1)与A*24:02:01:01及A*24:20的HLA碱基序列分别杂交，则仅与A*24:20的 HLA碱基序列在第211位的位置处产生一个碱基的错配。但是，一般而言，仅一个碱基的错 配不损害作为PCR引物的作用是已知的。因此，为了达到通过错配阻碍PCR的目的，通常， 在从错配位点朝向5'碱基侧1或2个碱基处还另行设置错配。并且，正向PCR引物（A1) 与A*24:20的HLA碱基序列之间产生的错配是所谓的C-T错误配对，其一般被认为难W阻 碍PCR延伸反应。因此，使用正向PCR引物（A1)时，即使使用A*24:20的HLA碱基序列作 为试样，认为基本不会因为上述错配而导致不发生PCR延伸反应。但是，本申请的发明人发 现，与预想相反，使用正向PCR引物（A1)时，使用A*24:20的HLA碱基序列作为试样的情况 下，因为错配而将导致不发生延伸反应。由此，若使用正向PCR引物（A1)，则进而通过与规 定的反向引物组合，能够将A*24:02:01:01和A*24:20区分开。
[007引进而，本申请的发明人发现，若使用正向PCR引物（A1)，则进而通过与规定的反向 引物组合，不仅限于A*24:02:01:01，而是能够将A*24:02全部均与A*24:20区分开。
[0076] 1. 2反向引物（A2)
[0077] 本发明的引物组还可进一步含有：
[007引 （A。反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3'末端 到至少第20位的DNA序列。
[0079] 序列号2相当于HLA的DNA序列的第882?910位的部分序列的互补序列。
[0080] 反向PCR引物（A2)为包含序列号2表示的DNA序列中从3'末端到优选至少第21 位、更优选到第23位的DNA序列的寡核巧酸。
[0081] 反向PCR引物（A。中，位于从3'末端到第2位碱基的2个碱基、即与HLA的 DNA序列的第909位和第910位碱基互补的碱基为T和G。A*23:01:01、W及A*24:04及 A*24:20的HLA碱基序列在W下位置有所不同：分别地，HLA第909位和第910位的碱基在 A*24:02:01:01、A*24:04及A*24:20 中为C和A，而在A*23:01:01中为T和T。因此，若反向 PCR引物（A2)与A*23:01:01、A*24:02:01:01、W及A*24:04 及A*24:20 的HLA碱基序列分 别杂交，则仅与A*23:01:01的HLA碱基序列在第909位和第910位的位置处产生两个碱基 的错配。该错配将阻碍PCR延伸反应。因此，若使用反向PCR引物（A。，贝化用A*23:01:01 的HLA碱基序列作为试样的情况下，因为两个碱基的错配将导致不发生PCR延伸反应。因 此，若使用反向PCR引物（A2)，则进而通过与规定的正向引物组合，能将A*23:01:01与 A*24:02:01:01、A*24:04 及A*24:20 区分开。
[008引进而，本申请的发明人等发现，若使用反向PCR引物（A2)，则进而通过与规定的正 向引物组合，不仅限于将A*23:01:01与A*24:02:01:01区分开，而是能将A*23:01:01与 A*24:02 全部、A*24:04 及A*24:20 区分开。
[0083] 2.连时PCR巧试剂念
[0084] 本发明的实时PCR用试剂盒含有：
[0085] 上述"1."中记载的引物组，及
[0086] 炬）下述寡核巧酸经标记而形成的序列特异性结合探针，所述寡核巧酸包含序列 号3表示的DNA序列的部分序列或其互补序列，所述部分序列是包含第429、437、440、442、 443、447和449位的碱基中的任一碱基的15?25个碱基的连续的DNA序列。
[0087] 上述"1."中记载的引物组优选含有：
[008引 （A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3'末端 到第16、17、18、19、20或21位的DNA序列；及
[008引 （A。反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3'末端 到至少第21位的DNA序列。
[0090]上述"1."中记载的引物组更优选含有：
[00川 （A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3'末端 到第19位的DM序列；及
[009引（A。反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3'末端 到第23位的DNA序列。
[0093] 2. 1序列特屏巧结合探针化)
[0094] 本发明中使用的序列特异性结合探针炬）为下述寡核巧酸经标记而形成的序列 特异性结合探针，所述寡核巧酸包含序列号3表示的DNA序列的部分序列或其互补序列，所 述部分序列是包含第429、437、440、442、443、447和449位的碱基中的任一碱基的15?25 个碱基的连续的DNA序列。
[009引 序列号3表示的DNA序列相当于HLA-A*24:02:01:01的第1?1，000位的部分序 列。A*24:02及A*24:04的DNA序列在第429?449位的DNA序列中含有的7个碱基处有 所不同。具体而言，DNA序列在下述位置有所不同；A*24:02第429、437、440、442、443、447 及449位的碱基分别依次为A、C、T、G、C、T及C，而A*24:04则分别依次为C、G、C、C、T、G 及G。
[0096] 具体而言，例如，可W使用包含序列号3表示的DNA序列的第427?451位、第 429?449位或第433?451位的DNA序列的寡核巧酸经标记而形成的序列特异性结合探 针。
[0097] 通过将序列特异性结合探针炬）与上述引物组一起使用，能够通过实时PCR检测 第211位的碱基为C、第909及910位的碱基分别为C及A、并且第429、437、440、442、443、 447及449位中任一碱基均与序列号3的碱基序列一致的HLA(例如A*24:02:01:01的HLA) 的DNA。
[0098] 进而，本申请的发明人发现，通过将序列特异性结合探针炬）与上述引物组一起 使用，能够通过实时PCR特异性地仅检测A*24:02全部（不仅限于A*24:02:01:01)的HLA 的DNA。
[0099] 关于上述检测精度，详细而言，W日本人为对象时，为能够不将现在报道的 A*24:20及A*24:04判定为阳性的精度。即使是对包含未报道为存在于日本人中的等位 基因的群进行检测，上述检测精度也仍为能够特异性检测A*24:02的精度。具体而言，上 述检测精度为能够不将抗原型与A*24不同的等位基因、W及A*24:08、A*24:13、A*24:19、 A*24:24、A*24:29、A*24:44、A*24:89、A*24:94、A*24:89、A*24:109 及A*24:129 中的任一 判定为阳性的精度。
[0100] 通过将序列特异性结合探针炬）与上述引物组一起使用并进行实时PCR，能够进 行Plus/Minus检验（Plus/MinusAssay)。此外，通过该方法可单一反应体系进行检 巧1|，因为同时进行内部标准（内部阳性对照）反应，能够排除PCR阻碍导致的假阴性的可能 性。
[0101] 序列特异性结合探针炬）具有用于通过实时PCR进行检测的标记。标记例如为英 光标记。与实时PCR中的不同检测方式相应地，对标记的方式进行选择。
[010引作为实时PCR中的检测方式，没有特定限制，例如可举出W下所示的该些。
[0103] 例如，可W举出利用WDNA聚合酶的5'外切核酸酶活性进行水解导致发出英光来 进行检测的方式（该方式中使用的探针被称为"水解探针")。作为水解探针的代表性例子， 可举出市售的化qMan(注册商标）探针。
[0104] 此外，可W举出下述方式，其中，使用经分别不同的英光染料标记的探针，在单链 祀标DNA中两条探针相互邻接并杂交而发出英光，而在双链祀标DNA中探针则均不杂交、不 发英光，利用该点进行检测（该方式中使用的探针被称为"杂交探针"）。
[0105] 进而，可W举出通过进行烙融曲线分析来进行检测的方式。所谓烙融曲线分析，表 示W实时方式追踪核酸的退火和热变性。探针与祀标的杂交体的Tm在存在错配时将显著 降低。烙融曲线分析中，利用该点来检测是否存在错配。
[0106] 烙融曲线分析也可W在PCR之后进行。
[0107] 为进行该方式，除了前文所述的杂交探针之外，还可使用经一种物质标记的探针。
[0108] 烙融曲线分析中，通过对序列特异性结合探针与祀标DNA的杂交体的烙融进行监 巧1|，即使只有一个碱基的错配，也可W识别出来。
[0109]在使用杂交探针的情况下，烙融曲线分析详细而言为下述该样的分析。寡核巧酸 中的一者与祀标DNA的不产生错配的部分杂交。该探针能够作为销探针（anchorprobe) 发挥作用。另一者的寡核巧酸（检测用探针）则结合至可产生错配的部分。产生错配的情 况下，该检测用探针的Tm将比销探针的Tm低约5C。DNA扩增完成后，立刻使用合适的装 置实施烙融曲线分析，识别不同的基因型。该分析期间，在使温度缓慢上升（例如，每1砂 0. 1?0. 2C)的同时，继续进行英光测定。通过该操作，能够监测结合至祀标DNA的探针 的烙融动态。伴随温度上升，从较短的突变探针开始发生烙融。通过烙融，两种英光染料之 间的距离分开，因此英光信号减少。探针与祀标的杂交体的Tm不仅取决于探针的长度或GC 含量，还取决于杂交体的同源性程度。因此，探针更完全结合，则烙融Tm更高；而对于结合 至包含欠缺稳定性的错配的DNA上的探针来说，Tm将变低。
[0110] 作为实时PCR中的检测方式，还可举出使用分子信标（MolecularBeacon)、 EclipseProbes(结构化探针，struc1:uredProbe)、HyProbe(邻近杂交探针，adjacent hybridizationProbes)及QProbe等的方式，W及使用包含RNA和DNA的嵌合探针的循环 探针（cyclingprobe)法及使用Invader(注册商标）探针的InvaderPlus(注册商标） 法等。
[0111] 2. 2丑它组分
[0112] 本发明的PCR用试剂盒还可含有其它构成要素（组分）。
[0113] 作为其它构成要素，没有特别限定，可举出PCR用试剂盒中通常含有的那些构成 要素。
[0114] 作为PCR用试剂盒中通常含有的那些构成要素，没有特别限定，例如可举出 dNTP(脱氧核巧酸H磯酸）、耐热性DNA聚合酶、Mg"、PCR缓冲液及说明书等。
[0115]dNTP中，也可代替dTTP而含有加TP。dNTP中含有加TP代替dTTP的情况下，通 过利用UNG(尿嚼巧-N-糖基化酶）（其为分解包含尿嚼巧的DNA的酶），能够防止此前进 行的PCR扩增产物的遗留（carryover)导致的假阳性。目P，即使万一此前进行的PCR扩增 产物混入了反应体系，因为PCR扩增产物中惨有加TP，因此通过作为分解包含尿嚼巧的DNA 的酶的UNG发挥作用，由此能够防止该样的遗留导致的假阳性。因此，本发明的PCR用试剂 盒还可含有UNG。 引 2. 2. 1耐热巧DNA聚合酶
[0117] 作为耐热性DNA聚合酶，没有特别限定，可从市售品中针对探针的种类进行适当 的选择。需要说明的是，因为本发明目的在于W与模板DM杂交了的正向PCR引物（Al)的 3'末端处是否形成错配为指标进行判定，因此优选不具有3' - 5'外切核酸酶活性的耐热 性DNA聚合酶。
[011引作为序列特异性结合探针炬)，使用水解探针的情况下，优选为具有5' - 3'外切 核酸酶活性的耐热性DNA聚合酶。作为具有5'- 3'外切核酸酶活性的耐热性DNA聚合酶， 没有特别限定，作为优选，可举出例如化qDNA聚合酶及TthDNA聚合酶。作为化qDNA聚 合酶，除通常的为化qDNA聚合酶外，还可使用化学修饰型的Ampli化qGold(注册商标） DNA聚合酶、化tStar化q(注册商标）DNA聚合酶及化stStartTaqDNA聚合酶、W及作为使 用了适体（aptamer)的热启动酶的Apta化qDNA聚合酶、或利用了抗化q抗体的化tStart PCR系统（TaKaRaTaqTMHotStartVersion等）等。
[0119] 使用分子信标探针（MolecularBeaconProbe)或Hyprobe的方式、W及采用循环 探针法及InvaderPlus法等的情况下，使用欠缺保真（Proof-reading)活性、并且5'- 3' 外切核酸酶活性及3' - 5'外切核酸酶活性均无的酶。
[0120] 作为该样的酶，没有特别限定，可举出例如TaqAexoDNA聚合酶、K0D(ex〇-)DNA 聚合酶、Exo-PfuDM聚合酶及Vent(exo-)DNA聚合酶等。
[0121] 2.2.2
[012引作为Mg",没有特别限定，例如可作为MgCls及MgS04含有在PCR用试剂盒中。虽 然没有特别限定，但通常需要为1. 5?2. 5mM的Mg2+。
[0123] 2. 2. 3缓冲液
[0124] 缓冲液通常相应于使用的酶的种类来选择。作为缓冲液，没有特别限定，可W使用 市售的PCR用缓冲液、或与市售的PCR用试剂盒中含有的缓冲液相同的缓冲液。该些市售 品中，经常不标明缓冲液组成。下面举出使用Taq聚合酶的情况下的标准缓冲液的组成。 [012引 50mlKC1
[012引 lOmMTris-肥l(pH8. 4 ?9. 0,25°C)
[0127] 1. 5mMMgClg
[012引 0. 01% 明胶或 0. 01%TritonX-100
[0129] 本发明的PCR用试剂盒中也可含有较之缓冲液使用时而言为10倍左右高的浓度 的物质。该种情况下，使用时将缓冲液稀释后使用。
[0130] 3.判定方法
[0131] 本发明的用于判定人DNA检测样品是否来源于具有HLA-A:24:02的人的方法为 包括下述工序的判定人DNA检测样品是否来源于具有HLA-A: 24:02的人的方法，所述工序 为：
[013引工序（1)，W人DNA检测样品为模板，使用上述"2."中记载的试剂盒进行实时PCR;及
[0133] 工序（2)，将在工序（1)中检测到信号的人DNA检测样品确定为来源于具有 HLA-A:24:02的人的检测样品。
[0134] 作为人DNA检测样品，含有人基因组DNA即可，没有特别限定，例如可举出血液、口 腔粘膜、毛发、指甲及血迹（将血液滴至滤纸上而得的）等。
[01巧]作为人DNA检测样品，可优选使用血液检测样品。作为血液检测样品，可W直接使 用通过采血制备而得的检测样品，也可使用对通过采血得到的物质施加规定的处理而得的 检测样品。作为规定的处理，没有特别限定，可举出例如加热及冷冻等。
[0136] 对实时PCR，可使用通常使用的市售的装置。作为市售的装置，没有特别限定，可举 出例如ABI7500 化St及ABI7500FastDx(LifeTechnologies)等。
[0137] 关于实时PCR的条件，可在通常的条件下进行。
[0138] 关于引物及探针各自的浓度及反应容量，在使用例如市售的预混溶液（例如， TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2及缓冲液的混合液）的情况下，可根据该预混溶液推荐的 那样来确定。作为市售的预混溶液，没有特别限定，可举出例如化qMan(注册商标）Gene ExpressionMasterMix(LifeTechnologies)、QuantiTect(注册商标）MultiplexPCR试 剂盒（QIAGEN)等。根据针对"TagMan(注册商标）GeneExpressionMasterMix的推荐， 可使用引物900nM、探针250nM、反应体系20yL。此外，根据针对如antiTect(注册商标） MultiplexPCR试剂盒的推荐，可使用引物400nM、探针200nM、反应体系25yL。
[0139] 相应于退火温度和延伸温度，选择Tm值合适的引物。
[0140]PCR条件可合适地设定。虽然没有特别限定，但可举出例如下述条件。
[0141] (l)5(rC，2 分钟
[0142] (2)95°C，10 ?15 分钟
[0143] (3) 95 °C，15 砂
[0144] (4)68°C，1 分钟
[0145] 妨W(3)和（4)作为1个循环，重复进行剩下的39个循环（使得全部合计为40 个循环）。但是，利用抗体型或适体的热启动的情况下，因为不需要用于活化的时间，所W上 述（2)也可W为0?15分钟。
[0146] 通过本发明，对具有日本人该样的等位基因频率的群体，能够简便且高精度地进 行对HLA-A:24:02的检测。
[0147] 此外，例如，在东南亚，存在作为A*24亚型之一的A*24:07等位基因被报道为高频 率的国家。在日本A*24:07等位基因的频率低。A*24:02与A*24:07序列上的不同仅在于 第412位的一个碱基。通过注目于该一个碱基的不同，能够设计能特异性检测A*24:07的 引物。作为该样的引物，没有特别限定，可举出例如包含序列号4表示的DNA序列的正向 引物等。将Tm值设定为68°C左右时，通过使用该正向引物进行PCR，能够将观察到DNA扩 增的检测样品判定为A*24:07等位基因阴性。因此，针对W高频率具有A*24:07等位基因 的群体，W本发明的判定方法为基础，通过进一步另行使用能特异性检测A*24:07的引物， 可简便且高精度地进行对HLA-A:24:02的检测。此外，针对等位基因频率与日本人不同的 其他群体，通过W本发明为基础施加类似的改良，能够简便且高精度地进行对HLA-A:24:02 的检测。
[0148] 4.筛犹方法
[0149] 本发明的HLA-A:24:02限制性肤疫苗施用对象群的筛选方法为包括下述工序的 方法：
[0150] 工序（1)，W人DNA检测样品作为模板，使用上述"2."中记载的试剂盒进行实时 PCR;及
[0151] 工序（2)，将作为在工序（1)中检测到信号的人DNA检测样品的采集来源的人选择 为施用HLA-A:24:02限制性肤疫苗的对象。
[0152] 现在，日本国内正在进行利用结合至日本人多数具有的HLA-A*24:02的肤 (HLA-A:24:02限制性肤疫苗）的肤疫苗疗法的开发。作为该样的HLA-A:24:02限制性肤疫 苗，可举出例如0了5102、0(：￥-101、0(：￥-105、胖14869、5288310、5488410 及（^56(：-424等。
[0153] 通过施用HLA-A:24:02限制性肤疫苗预期能获得治疗效果的仅限于保持 有HLA-A*24:0 2等位基因的患者。因此，若能够在施用前预先确认对象患者保持有 HLA-A*24:02,则能够筛选施用HLA-A:24:02限制性肤疫苗的对象。
[0154] 关于人DNA检测样品、实时PCR的诸项条件W及对象群，与上述"3.判定方法"中 给出的说明相同。
[0155] 实施例
[0156]W下参照实施例更详细地说明本发明，但本发明不仅限于该些实施例。 。157] 1.材料巧方法 。巧引 1-1.引物巧探针的巧计
[0159] 关于引物的设计，报道过基于A*24:02:01:01的序列、通过将第909?910位 设定为反向引物的3'末端，能够不检测出A*23:01:01而检测出A*24:02:01:0UBunce M,O'NeillCM等人，F*hototyping:comprehensiveDNAtypingforHLA-A,B,C,DRB1,D RB3,DRB4,DRB5&D地 1byPCRwith144Primermixesutilizingsequence-specific Primers(PCR-SSP). ,TissueAntigens, 1995 年 11 月，46 (5)，pp. 355-67)。
[0160] 与A*24:02:01:01互补的正向引物，相对其它等位基因而言，序列上仅在3' 末端有一个碱基不同。具体而言，正向引物的3'末端碱基为C，而例如A*24:20的互 补链为T，该种情况下产生C-T错误配对，其使得延伸反应最容易进行（KwokS等人， EffectsofPrimer-templatemismatchesonthepolymerasechainreaction:human immunodeficiencyvirustype1modelstudies. ,NucleicAcidsRes. ,1990 年 2 月，18(4)，pp. 999-1005;HuangMM等人，ExtensionofbasemispairsbyTaqDM polymerase:implicationsforsinglenucleotidediscriminationinPCR. ,Nucleic AcidsRes.，1992年9月，20 (17)，PP.4567-73)。为了解决该问题，存在在引物的各 碱基中利用LNA(锁核酸，LockedNucleicAcid)的方法（XatorraD等人，Enhanced allele-speci円cPCRdiscriminationinSNPgenotypingusing3'lockednucleic acid(LNA)Primers. ,HumMutat.，2003 年 7 月，22 (1)，pp. 79-85)和利用等位基因特 异性竞争性遏制剂（allelespecificcompetitiveblocker)的方法（OrouA等人， Allele-speci円ccompetitiveblockerPCR:aone-stepmethodwithapplicabilityto poolscreening. ,HumMutat. ,1995 年，6(2)，卵.163-9)等。
[0161]A*24:02:01:01检测引物、探针的序列如下文所示。关于引物，设计了从上述的3' 末端到5'末端侧16?26mer的引物。
[0162] 作为本发明的实施例，使用了最常用的化qMan(注册商标）探针。
[0163] 关于探针，设计了例如A*24:02:01:01的第429?449位的序列（21mer)和第 433?451位的序列（19mer)。关于英光染料，使用了FAM。关于浑灭剂，使用了TAMRA和 作为黑洞浑灭剂的ATT0540Q。关于化qman探针的设计，只要序列上有一个碱基不同，就 可W利用包含LNA或MGB的探针检测到扣gozzoliLA等人，Real-timegenotypingwith oligonucleotideProbescontaininglockednucleicacids. ,AnalBiochem.，2004 年 1 月，324(1)，pp. 143-52;deKokJB等人，Rapidgenotypingofsinglenucleotide polymorphismsusingnovelminorgroovebindingDNAoligonucleotides(MGB ?1'〇663).，血111]\111131.，2002 年5月，19(5)，卵.554-9)，因此^4*24:02:01:01 的从第429 位到449位中的何处序列不同位点为祀标均可。
[0164] 此外，为了防止检测样品的分注错误、通过PCR阻碍导致的假阴性，设计了RNaseP 基因的引物、探针序列作为内部阳性对照。
[0165] 引物、探针是从SigmaGenosys或日本基因研究所（NihonGeneResearch Laboratories,Inc.)购入的。
[0166] <A*24:02:01:01 检测引物、探针>
【权利要求】
1. 引物组，其含有： (A1)正向PCR引物，所述正向PCR引物包含序列号1表示的DNA序列中从3 '末端到至 少第16位的DNA序列。
2. 引物组，其含有： 权利要求1中记载的正向PCR引物（A1)，及 (A2)反向PCR引物，所述反向PCR引物包含序列号2表示的DNA序列中从3'末端到至 少第20位的DNA序列。
3. 实时PCR用试剂盒，其含有： 根据权利要求1或2所述的引物组，及 (B)下述寡核苷酸经标记而形成的序列特异性结合探针，所述寡核苷酸包含序列号3 表示的DNA序列的部分序列或其互补序列，所述部分序列是包含第429、437、440、442、443、 447和449位的碱基中的任一碱基的15?25个碱基的连续的DNA序列。
4. 一种方法，用于判定人DNA检测样品是否来源于具有HLA-A: 24:02的人，所述方法包 括下述工序： 工序（1)，以人DNA检测样品为模板，使用根据权利要求3所述的试剂盒进行实时PCR ; 及 工序（2)，将在工序⑴中检测到信号的人DNA检测样品确定为来源于具有 HLA-A:24:02的人的检测样品。 5. HLA-A:24:02限制性肽疫苗施用对象群的筛选方法，所述方法包括下述工序： 工序（1)，以人DNA检测样品作为模板，使用根据权利要求3所述的试剂盒进行实时 PCR;及 工序（2)，将作为在工序（1)中检测到信号的人DNA检测样品的采集来源的人选择为施 用HLA-A :24:02限制性肽疫苗的对象。
【文档编号】C12N15/09GK104395468SQ201380020977
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年4月19日 优先权日:2012年4月20日
【发明者】大西英晃 申请人:大塚制药株式会社