木霉属疏水蛋白制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于使微生物，具体地木霉属(Trichoderma)生产宿主中的生物表面活性剂诸如疏水蛋白的表达最大化的方法。
【专利说明】木霉属疏水蛋白制备
[0001 ] 相关专利申请并以引用的方式并入
[0002] 本专利申请要求提交于2012年5月21日的美国临时专利申请序列号61/649, 654 的优先权，并且所述专利申请以引用的方式全文并入本文。
[0003] 引用以下专利申请：提交于2009年6月9日的国际专利申请序列号PCT/ US2009/046783,其作为PCT公开No.WO2009/152176 公布于 2009 年 12 月 17 日；提交 于2010年8月10日的国际专利申请序列号PCT/US2010/044964,其作为PCT公开No.WO 2011/019686公布于2011年2月17日；提交于2010年8月10日的国际专利申请序列号 PCT/US2010/044964、提交于2012年3月29日的国际专利申请序列号PCT/US12/31104和 提交于2012年4月16日的国际专利申请序列号PCT/US12/33728,以及提交于2012年3月 28日的美国专利申请序列号13/433,036。
[0004] 前述申请，以及其中引证的或者在它们审查过程中引证的所有文件（"申请引证 文件"）以及申请引证文件中引证或者参考的所有文件，以及本文引证或者参考的所有文件 ("本文引证文件"）以及本文引证文件中引证或者参考的所有文件，连同关于在本文中或者 在以引用方式并入本文的任何文件中提到的任何产品的任何生产商说明书、描述、产品规 格和产品单，都以引用方式并入本文，并且可应用于本发明的实施。更具体而言，所有参考 文件被以引用方式并入至如同每一单独文件被具体且单独地指明以引用方式并入的程度。
【技术领域】
[0005] 本发明涉及在木霉属（Trichoderma)生产宿主中产生疏水蛋白的方法。
[0006] 发明背景
[0007] 疏水蛋白（HBF)为具有约70至150个氨基酸的小的分泌蛋白，其存在于丝状真 菌，例如裂裙菌（Schizophyllumcommune)中。它们通常具有8个半胱氨酸残基。疏水蛋 白可从天然资源中分离，但也可通过基因工程方法获得（参见例如，W0 2006/082251和W0 2006/131564)。
[0008] 可将疏水蛋白以不溶于水的形式散布在多种真菌结构，诸如气生菌丝、孢子、子实 体的表面上。用于疏水蛋白的基因可从子囊菌、半知菌和担子菌中分离。一些真菌具有不止 一个疏水蛋白基因，例如裂裙菌、灰盖鬼伞（Coprinuscinereus)、构巢曲霉（Aspergillus nidulans)。不同的疏水蛋白显然涉及不同的真菌发育阶段。这里的疏水蛋白可能负责 不同的功能（vanWetteretal.，2000，Mol.Microbiol.，36,201-210(vanWetter等人， 2000 年，《分子微生物学》，第 36 卷，第 201-210 页）；Kershawetal. 1998,FungalGenet. Biol, 1998, 23, 18-33 (Kershaw等人，1998年，《真菌遗传生物学》，1998年，第23卷，第 18-33 页））。
[0009] 迄今为止，确定的疏水蛋白通常被归类为I类或II类。两种类型都已在真菌中被 确定为分泌蛋白，这种分泌蛋白在疏水界面处自组装成两性膜。I类疏水蛋白的聚集体一般 相对不可溶，而II类疏水蛋白（HBFII)的聚集体易于溶解于多种溶剂。
[0010] 就疏水蛋白的生物学功能而言，除了降低气生菌丝生成时水的表面张力，还 描述了赋予抱子疏水性（Wostenetal. 1999,Curr.Biol.，19, 1985-88(Wosten等 人，1999 年，《当代生物学》，第 19 卷，第 1985-1988 页）；Belletal. 1992,Genes Dev.，6, 2382-2394(Bell等人，1992年，《基因发展》，第6卷，第2382-2394页））。此外， 疏水蛋白还用于划出地衣子实体中的气体通道，并充当植物表面真菌病原体识别系统中的 组分（Lugonesetal. 1999,Mycol.Res.，103, 635-640(Lugones等人，1999 年，《真菌学研 宄》，第 103 卷，第 635-640 页）；Hamer&Talbot1998,Curr.OpinionMicrobiol.，volume 1，693-697 (Hamer和Tablot，1998年，《微生物学新见》，第1卷，第693-697页））。
[0011] 此前，使用通常的耗时的蛋白-化学纯化（诸如尺寸排阻或离子交换柱纯化或 HPLC)和分离方法（诸如盐沉淀和结晶）制备的疏水蛋白只有中等产率和纯度。借助遗传 学方法提供较大量疏水蛋白的尝试并不总是成功的。木霉属中HFBII的产率较低，例如约 0.24g/l或甚至更低。因此，本领域需要一种产生疏水蛋白，特别是HFBII的更高效的方 法。
[0012] 在本申请中引证或者确认任何文件并不是承认这种文件可作为本发明的现有技 术利用。
【发明内容】
[0013] 本发明部分来源于 申请人:的惊人的和意外的发现，在Cbhl启动子的控制下以 及在补充有葡萄糖和槐糖的培养基中，木霉属生产宿主中的疏水蛋白表达产生高于先 前观察到的疏水蛋白产量。因为已知葡萄糖可抑制cbhl表达，并且已知乳糖可诱导 cbhl表达，乳糖先前用于诱导hfb2产生（参见例如，Baileyetal.，ApplMicrobiol Biotechnol. 2002May;58(6) :721-7(Bailey等人，《应用微生物学和生物技术》，2002年5 月；第58卷，第6期，第721-727页））。
[0014] 本发明涉及在里氏木霉（Trichodermareesei)中产生疏水蛋白II的方法。所 述方法可包括将疏水蛋白II(hfb2)编码序列克隆到表达质粒中并用表达质粒转化里氏木 霉。有利的是，里氏木霉中的cbhl编码序列可缺失或损坏。
[0015] 所述方法还可包括选择稳定的转化体表达疏水蛋白II。所述稳定的转化体可在含 有葡萄糖/槐糖的培养液中发酵。任选地，可添加消泡剂。
[0016] 可通过将疏水蛋白II从细胞中移除来将其分离，诸如通过裂解和/或过滤。
[0017] 有利的是，疏水蛋白II可以高于2g/L或高于5g/L培养液的浓度产生。
[0018] 要特别一提的是，"基本上由…组成"的使用是为了在技术可达的任何程度上 区分美国专利No. 7, 713, 725及与其等同的任何文件和美国专利No. 7, 883, 872,例如在 主题和/或专利法（例如，通过作为W0 2004/035070或要求W0 2004/035070的优先 权或与W0 2004/035070同族）上区分。要特别一提的是，"基本上由…组成"的使用是 为了在技术可达的任何程度上区分特别是由VTT生物技术公司（VTTBiotechnology) 出版的出版物，诸如但不限于Nakari-SetiUiietal.，EurJBiochem. 1997Sep1 ; 248 (2):415-23 (Nakari-SetaUi等人，《欧洲生物化学杂志》，1997年9月1日，第248 卷，第 2 期，第 415-423 页）；Ilm6netal.，ApplEnvironMicrobiol. 1997Apr; 63 (4) : 1298-306 (Ilm6n等人，《应用环境微生物学》，1997年4月，第63卷，第4期， 第 1298-1306 页）和Baileyetal.，ApplMicrobiolBiotechnol. 2002May; 58 (6) : 721-7 (Bailey等人，《应用微生物学和生物技术》，2002年5月；第58卷，第6期，第 721-727 页）。
[0019] 在一个实施例中，用于产生在诱导型启动子的控制下的基因编码的疏水蛋白的方 法包括以下步骤：（a)生成第一混合物，其包含介于约5 %至约75 %之间的葡萄糖和纤维 素酶制品；(b)在某一温度下温育第一混合物并持续足够长的时间以产生诱导性进料组合 物，所述组合物包含浓度在2g/L至25g/L范围内的槐糖、浓度在35g/L至60g/L范围内的龙 胆二糖以及葡萄糖；以及（c)用所述诱导性进料组合物培养宿主细胞，其量能有效诱导疏 水蛋白的产生，所述宿主细胞包含在槐糖-诱导型启动子或龙胆二糖-诱导型启动子的控 制下的编码疏水蛋白的核苷酸序列。在另一个实施例中，疏水蛋白为异源疏水蛋白。在另一 个实施例中，疏水蛋白为疏水蛋白I或疏水蛋白II。在另一个实施例中，细胞经遗传工程改 造以表达在槐糖-诱导型启动子或龙胆二糖-诱导型启动子的控制下的疏水蛋白基因。在 一个实施例中，所述细胞为丝状真菌细胞，优选地选自木霉属、腐质霉属（Humicola)、镰孢 属（Fusarium)、曲霉属（Aspergillus)、脉抱菌属（Neurospora)、青霉属（Penicillium)、头 抱霉属（Cephalosporium)、毁丝霉属（Myceliophthora)、嗜热真菌属（Thermomyces)、金抱 子菌属（Chrysosporium)，更优选地为木霉属物种，并优选地为里氏木霉。在一个实施例中， 在约50°C至约70°C下温育第一混合物，时间为约8小时至约7天。在一些实施例中，疏水蛋 白基因有效连接至cbhl、cbh2、egll或egl2启动子，由此疏水蛋白的表达在cbhl、cbh2或 egll、egl2启动子的控制下。在另一个实施例中，内源性纤维素酶基因缺失或损坏。在另 一个实施例中，内源性egl5基因缺失或损坏。在一些实施例中，提供了产生在葡萄糖-和/ 或槐糖_诱导型启动子的控制下的基因编码的疏水蛋白的方法，其中葡萄糖以包含约60% wt/wt的量存在于诱导性进料组合物中，槐糖以包含约12g/L的量存在于诱导性进料组合 物中，编码疏水蛋白的核酸分子为hfb2编码序列，hfb2编码序列有效连接至cbhl启动子， 由此疏水蛋白表达在cbhl启动子的控制下，并且木霉属包括木霉属cbhl、cbh2、egll、egl5 和egl2编码序列中的一个或多个缺失或损坏的里氏木霉。
[0020] 这些和其他的实施例被以下"【具体实施方式】"公开，或者由以下"【具体实施方式】"显 而易见并被其所涵盖。
【具体实施方式】
[0021] 本文所用的"生物表面活性剂"或"生物法产生的表面活性剂"属于减小表面张力 的物质，诸如水和疏水液体之间或者水和空气之间的界面张力，并且其可从生物系统产生 或获得。生物表面活性剂或生物法产生的表面活性剂可为蛋白质，有利的是疏水蛋白。生 物表面活性剂可天然存在，或者它可以是自然界中不存在的经诱变或者遗传工程改造的变 体。
[0022] 本文所用的"生物系统"包含活生物体或者衍生自活生物体，所述活生物体诸如微 生物、植物、真菌、昆虫、脊椎动物或者通过合成生物学产生的生命形式。活生物体可以是通 过经典育种、克隆选择、诱变和类似的用以产生遗传多样性的方法所获得的、自然界中不存 在的变体，或者它可以是通过重组DNA技术获得的遗传工程生物体。活生物体可以整体使 用，或者它可以是诸如器官培养物、植物栽培种、混悬细胞培养物、贴壁细胞培养物或者无 细胞制品的组分的来源。
[0023] 生物系统当其螯合（sequester)生物表面活性剂时可含有或者不含有活细胞。生 物系统可从自然来源找到并采集，它可进行耕种、培养，或者它可在工业条件下栽培。生物 系统可从所供应的前体或者营养物合成生物表面活性剂，或者它可从它的环境富集生物表 面活性剂。
[0024] 本文所用的"制备"或"生产"涉及用于生产化学品和生物制品的制造方法，包括 但不限于收获、采集、压缩、放血、浸渍、均质、糖化、酿造、发酵、回收、固液分离、细胞分离、 离心、过滤（诸如真空过滤）、配制、储存或者运输。
[0025] 本文所用的"发酵培养液组合物"是指包含所关注的蛋白（诸如疏水蛋白）的细 胞生长培养基。细胞生长培养基可包括细胞和/或细胞碎片，并且可以进行浓缩。示例性 的发酵培养液组合物为包含疏水蛋白的经超滤浓缩的发酵培养液。通常用微量过滤保留细 胞碎片并滤过蛋白质，例如用于细胞分离，而通常用超滤保留蛋白质并滤过溶质，例如用于 浓缩。
[0026] 本文所用的术语"多肽"和"蛋白质"可互换使用，是指通过肽键连接的包含氨基酸 残基的任意长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规单字母代码或三字母代码。聚合物 可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸隔断。所述术语还涵盖 天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述干预例如是二硫键形成、糖基化、脂质化、 乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。还包括在该定义中的是例如 含有一个或多个氨基酸类似物（包括例如非天然氨基酸等）以及本领域已知的其它修饰的 多肽。
[0027] 本文所用的"培养物溶液"是包含生物表面活性剂和旨在从其中回收所关注的生 物表面活性剂的其他可溶或不溶组分的液体。此类组分包括其他蛋白质、非蛋白质类杂质 诸如细胞和细胞碎片、核酸、多糖、脂质、化学品诸如消泡剂、絮凝剂、盐、糖、维生素、生长因 子、沉淀剂等。"培养物溶液"还可以被称为"蛋白质溶液"、"液体培养基"、"渗滤培养液"、 "澄清培养液"、"浓缩物"、"条件培养基"、"发酵培养液"、"裂解培养液"、"裂解物"、"细胞培 养液"或者简称为"培养液（broth) "。如果存在细胞的话，细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、 植物细胞、动物细胞、人细胞、昆虫细胞、合成细胞等。
[0028] 本文所用的术语"回收"指对包含生物表面活性剂和一种或多种不需要的组分的 液体培养物进行处理以便从至少一些不需要的组分（诸如细胞和细胞碎片、其他蛋白质、 氨基酸、多糖、糖、多羟基化合物、无机或有机盐、酸和碱以及颗粒材料）中分离出生物表面 活性剂的工艺。
[0029] 本文所用的"生物表面活性剂产品"指适合提供给最终用户诸如消费者的生物表 面活性剂制品。生物表面活性剂产品可包括制剂赋形剂诸如缓冲液、盐、防腐剂、还原剂、 糖、多羟基化合物、表面活性剂等，添加或保留所述制剂赋形剂是为了延长生物表面活性剂 的功能货架期或者有利于生物表面活性剂的最终应用。
[0030] 本文所用的功能上和/或结构上类似的生物表面活性剂被认为是"相关生物表面 活性剂"。这种生物表面活性剂可衍生自不同属和/或种的生物体，或者甚至不同类别的生 物体（例如细菌和真菌）。相关生物表面活性剂还涵盖通过一级序列分析确定的、通过三级 结构分析确定的或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。
[0031] 本文所用的术语"衍生生物表面活性剂"是指这样的蛋白质基生物表面活性剂，其 通过将一个或多个氨基酸添加至N端和/或C端、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点 处置换一个或多个氨基酸，和/或在所述蛋白质的一端或两端或所述氨基酸序列中的一个 或多个位点处缺失一个或多个氨基酸、和/或在所述氨基酸序列中的一个或多个位点处插 入一个或多个氨基酸而衍生自某种生物表面活性剂。生物表面活性剂衍生物的制备可通过 修饰编码天然蛋白的DNA序列、将该DNA序列转化到合适的宿主中以及表达所述经修饰的 DNA序列以形成所述衍生蛋白质来实现。
[0032] 相关（和衍生）生物表面活性剂包括"变体生物表面活性剂"。变体蛋白质基生 物表面活性剂与参考/亲本生物表面活性剂（例如野生型生物表面活性剂）差别在于少 数氨基酸残基处的置换、缺失和/或插入。不同的氨基酸残基的数量可以为一个或多个氨 基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变体生物 表面活性剂与野生型生物表面活性剂共有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约 85 %、至少约90 %、至少约91 %、至少约92 %、至少约93 %、至少约94%、至少约95 %、至少 约96%、至少约97%、至少约98%、或者甚至至少约99%或者更高的氨基酸序列同一性。变 体生物表面活性剂与参考生物表面活性剂的差异还可在于所选择的模体、结构域、表位、保 守区等。
[0033] 本文所用的"嵌合体"是指可以来自不同生物体、具有多种组分的单一组合物，有 利地为多肽。本文所用的"嵌合体"用于指串联排列的部分，包括生物表面活性剂或其变体 生物表面活性剂，其经工程改造以得到具有与各个蛋白部分的功能或活性相对应的区域的 融合蛋白。
[0034] 本文所用的术语"类似序列"是指蛋白质基生物表面活性剂内的提供与生物表面 活性剂相似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在包含a-螺旋或片层 结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选地保持相同的特定结构。该术语还指核 苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中，开发类似序列使得置换氨基酸导致变体酶显 示相似或改进的功能。在一些实施例中，生物表面活性剂中的氨基酸的三级结构和/或保 守残基位于所关注的区段或者片段处或者附近。因此，在所关注区段或片段包含（例如） a _螺旋或0 _片层结构的情况下，置换氨基酸优选地保持该特定结构。
[0035] 本文所用的术语"同源生物表面活性剂"指具有与参考生物表面活性剂相似的活 性和/或结构的生物表面活性剂。意图的是同源物不必是进化相关的。因此，意图的是该 术语涵盖从不同生物体获得的相同、相似或者相应的生物表面活性剂（即，就结构和功能 而言）。在一些实施例中，希望确定具有与参考生物表面活性剂相似的四级、三级和/或一 级结构的同源物。
[0036] 序列之间同源性的程度可使用本领域中已知的任何合适的方法确定（参见例如 Smith and Waterman(1981)Adv.Appl. Math 2:482(Smith 和 Waterman，1981 年，《高等应用 数学》，第 2 卷，第 482 页）；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.，48:443(Needleman 和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页）；Pearson and Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (Pearson 和 Lipman，1988 年，《美国国家科学院院 刊》，第85卷，第2444页）；程序，诸如在威斯康星遗传学软件包（Wisconsin Genetics Software Package，得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组（Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;以及 Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395 (Devereux 等人，1984 年，《核酸研宄》，第 12 卷，第 387-395 页））。
[0037] 例如，PILEUP是测定序列同源性水平的有用程序。PILEUP利用渐进性双序 列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，所述关系树示出了用 于产生比对的群关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法（Feng and Doolittle, (1987)，（J. Mol. Evol 35:351-360(Feng 和 Doolittle，1987 年，《分子进化杂 志》，第35卷，第351-360页））的简化方法。所述方法与Higgins和Sharp描述的方法类似 (Higgins and Sharp (1989) CABI0S 5:151-153 (Higgins 和 Sharp，1989 年，《计算机在生物 科学中的应用》，第5卷，第151-153页））。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重=3. 00， 默认空位长度权重=0. 10,以及加权的末端空位。可用的算法的另一个例子为Altschul等 人描述的 BLAST 算法（Altschul et al. (1990)，J. Mol. Biol. 215:403-410 (Altschul 等人， 1990 年，《分子生物学杂志》，第 215 卷，第 403-410 页）；&&Karlinetal.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (Karlin等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90 卷，第5873-5787页））。一种特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序（参见Altschul et al. (1996)Meth.Enzymol 266:460-480 (Altschul 等人，1996 年，《酶学方法》，第 266 卷， 第460-480页））。参数"W"、"T"和"X"决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认 值：字长（W)为 11、BL0SUM62 记分矩阵（SMHenikoffandHenikoff(1989)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (Henikoff 和 Henikoff，1989 年，《美国国家科学院院刊》，第 89 卷， 第10915页））比对⑶为50次、期望值（E)为10、M' 5、N' -4以及两条链的比较。
[0038] 如本文所用，在至少两条核酸或多肽的情况下，短语"基本上类似"和"基本上相 同"通常意味着多核苷酸或多肽包含的序列与参考（即，野生型）序列相比具有至少约70% 的同一 ,性、至少约75%的同一,性、至少约80%的同一,性、至少约85%的同一 ,性、至少约90% 的同一,性、至少约91%的同一1性、至少约92%的同一 1性、至少约93%的同一1性、至少约94% 的同一,性、至少约95%的同一 ,性、至少约96%的同一,性、至少约97%的同一,性、至少约98% 的同一性、或甚至至少约99%的同一性或更高的同一性。序列同一性可使用诸如BLAST、 ALIGN和CLUSTAL之类的已知程序，使用标准参数测定。（参见例如Altschul, et al. (1990) J.Mol. Biol 215:403-410 (Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第 403-410 页）；Henikoff et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (henikoff 等 人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页）；Karin et al. (1993)Proc. Natl.Acad. Sci USA 90:5873(Karin等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第 5873 页）；以及 Higgins et al. (1988)Gene 73:237-244(Higgins 等人，1988 年，《基因》， 第73卷，第237-244页））。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information)公开获得。另外，可使用 FASTA对数 据库进行搜索（Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (Pearson 等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页））。两个多肽实质上相同 的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换 的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如，若两个肽差别仅在于保守置换，则多肽实质上与 第二多肽相同。两种核酸序列实质上一致的另一个指示是两种分子在严格的条件（例如， 在中至高严格度的范围内）下彼此杂交。
[0039] 本文所用的"野生型"和"天然"生物表面活性剂是自然界中存在的那些生物表面 活性剂。术语"野生型序列"和"野生型基因"在本文中可以互换使用，指在宿主细胞中自 然或天然存在的序列。在一些实施例中，野生型序列是指为蛋白质工程项目的起始点的所 关注序列。编码天然存在的蛋白质的基因可依据本领域技术人员已知的一般方法获得。所 述方法一般包括合成出具有编码生物表面活性剂区域的推定序列的标记探针，从表达所述 蛋白质的生物体制备基因组文库，并通过与探针的杂交对文库筛选所关注的基因。然后对 正向杂交克隆进行映射和测序。
[0040] 本发明的方法可应用于将生物表面活性剂从培养物溶液中分离。有利的是，生物 表面活性剂为由微生物分泌的可溶解的细胞外生物表面活性剂。
[0041] 一组示例性生物表面活性剂为疏水蛋白，这是一类由丝状真菌表达的富含半胱氨 酸的多肽。疏水蛋白是小的（约100个氨基酸）多肽，因其在物体（包括细胞和人造材料） 的表面上形成疏水覆层的能力而知名。疏水蛋白最初于1991年在裂裙菌中发现，现已在多 种丝状真菌中确认。基于亲水性（hydropathy)和其他生物物理性质的差异，疏水蛋白被归 类为I类和II类。
[0042] 疏水蛋白的表达通常需要在发酵期间添加一种或多种消泡剂（即，止泡剂）。否 贝1J，疏水蛋白多肽产生的泡沫可使通气过滤器湿透，污染排放口，导致压力增大，并降低蛋 白质产率。结果，疏水蛋白的粗浓缩物常常含有残余量的消泡剂以及宿主细胞污染物，这在 疏水蛋白制品中是不可取的，尤其是当疏水蛋白要作为食品添加剂时。有利的是，消泡剂可 为基于有机硅的聚合物和/或非有机硅有机物。
[0043] 疏水蛋白可以可逆地以具有比其实际分子量大的表观分子量的形式存在，这使得 疏水蛋白很适合用本发明方法进行回收。含有疏水蛋白的液体或者泡沫可如所描述连续地 或者定期地从发酵罐收获以进行蛋白质回收，或者在发酵操作结束时批式收获。
[0044] 疏水蛋白可以是本领域已知的任何I类或II类疏水蛋白，例如，来自以下各个属 或种的疏水蛋白：伞菌属（Agaricus spp.)(例如，双孢蘑葫（Agaricus bisporus))、田头 葫属（Agrocybe spp.)(例如杨树葫（Agrocybe aegerita))、阿耶罗菌属（Ajellomyces spp.)(例如荚膜阿耶罗菌（Ajellomyces capsulatus)、皮炎阿耶罗菌（Ajellomyces dermatitidis))、曲霉属（Aspergillus spp.)(例如 Aspergillus arvii、短柄曲霉 (Aspergillus brevipes)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、硬柄曲霉(Aspergillus duricaulis)、椭圆曲霉(Aspergillus ellipticus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、 烟曲霉（Aspergillus fumigatus)、烟束曲霉(Aspergillus fumisynnematus)、迟缓曲 霉(Aspergillus lentulus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、单侧曲霉(Aspergillus unilateralis)、绿垂曲霉（Aspergillus viridinutans))、白僵菌属(Beauveria spp.) (例如球孢白僵菌（Beauveria bassiana))、麦角菌属（Claviceps spp.)(例如纺锤麦角 菌（Claviceps fusiformis))、球抱子菌属（Coccidioides spp.)(例如 Coccidioides posadasii)、旋孢腔菌属（Cochliobolus spp.)(例如异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus))、毛皮伞属（Crinipellis spp.)(例如统抱毛皮伞（Crinipellis perniciosa))、隐丛赤壳属（Cryphonectria spp.)(例如寄生隐丛赤壳菌（Cryphonectria parasitica))、Davidiella 属(Davidiella spp.)(例如 Davidiella tassiana)、云片 衣属（Dictyonema spp.)(例如 Dictyonema glabratum)、裸胞壳属（Emericella spp.) (例如构巢裸胞壳（Emericella nidulans))、小火焰菌属（Flammulina spp.)(例如金针 蒴（Flammulina velutipes))、镜刀菌属（Fusarium spp.)(例如黄色镜刀菌（Fusarium culmorum))、赤霉属（Gibberella spp.)(例如串珠状赤霉（Gibberella moniliformis))、 小丛壳属（Glomerella spp.)(例如禾生小丛壳（Glomerella graminicola))、树花菌 属（Grifola spp.)(例如灰树花（Grifola frondosa))、异担子属（Heterobasidion spp.)(例如松根异担子（Heterobasidion annosum))、肉座菌属（Hypocrea spp.) (例如红褐肉座菌（Hypocrea jecorina)、Hypocrea lixii、Hypocrea virens)、錯蘑 属（Laccaria spp.)(例如双色錯蘑（Laccaria bicolor))、香蒴属（Lentinula spp.) (例如香蒴（Lentinula edodes))、巨座壳属（Magnaporthe spp.)(例如稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae))、小皮伞属（Marasmius spp.)(例如 Marasmius cladophyllus)、 Moniliophthora 属(Moniliophthora spp.)(例如 Moniliophthora perniciosa)、新萨 托菌属（Neosartorya spp.)(例如浅黄新萨托菌（Neosartorya aureola)、芬尼新萨托 菌（Neosartorya fennelliae)、费希新萨托菌（Neosartorya fischeri)、光滑新萨托菌 (Neosartorya glabra)、Neosartorya hiratsukae、Neosartorya nishimurae、Neosartorya otanii、Neosartorya pseudofischeri、四绕新萨托菌（Neosartorya quadricincta)、匙 囊新萨托菌（Neosartorya spathulata)、刺抱新萨托菌（Neosartorya spinosa)、宽脊 新萨托菌（Neosartorya stramenia)、(Neosartorya udagawae)、脉抱菌属（Neurospora spp.)(例如粗糖脉胞菌（Neurospora crassa)、陷脉抱菌（Neurospora discreta)、间 型脉抱菌（Neurospora intermedia)、好食脉抱菌（Neurospora sitophila)、四抱脉 孢菌（Neurospora tetrasperma))、长卩彖壳属（Ophiostoma spp.)(例如新榆枯萎病菌 (Ophiostoma novo-ulmi)、Ophiostoma quercus)、虽球抱子菌属(Paracoccidioides spp.)(例如巴西副球抱子菌（Paracoccidioides brasiliensis))、钉抱属（Passalora spp.)(例如 Passalora fulva)、桩蒴菌属（Paxillus spp.)(例如长丝桩蒴（Paxillus filamentosus)、卷边粧蒴（Paxillus involutus))、青霉属（Penicillium spp.)(例如沙 门桕干酪青霉（Penicillium camemberti)、产黄青霉（Penicillium chrysogenum)、马尔 尼菲青霉菌（Penicillium marneffei))、Phlebiopsis 属（Phlebiopsis spp.)(例如大伏 革菌（Phlebiopsis gigantea))、豆马勃属（Pisolithus)(例如彩色豆马勃（Pisolithus tinctorius))、侧耳属（Pleurotus spp.)(例如平蒴（Pleurotus ostreatus))、足抱虫 属（Podospora spp.)(例如鶴柄孢殼菌（Podospora anserina))、泊氏孔菌属（Postia spp.)(例如鞋色泊氏孔菌（Postia placenta))、核腔菌属（Pyrenophora spp.)(例如偃 麦草核腔菌（Pyrenophora tritici-repentis))、裂糟菌属（Schizophyllum spp.)(例如 裂糟菌）、篮状菌属（Talaromyces spp.)(例如柄篮状菌（Talaromyces stipitatus))、 木霉属（Trichoderma spp.)(例如棘抱木霉（Trichoderma asperellum)、深绿木霉 (Trichoderma atroviride)、绿色木霉（Trichoderma viride)、里氏木霉[红褐肉座 菌（Hypocrea jecorina) ])、口蘑属（Tricholoma spp.)(例如棕灰口蘑（Tricholoma terreum))、Uncinocarpus 属（Uncinocarpus spp.)(例如 Uncinocarpus reesii)、轮枝抱 属（Verticillium spp.)(例如大 _花轮枝抱（Verticillium dahliae))、Xanthodactylon 属（Xanthodactylon spp.)(例如Xanthodactylon f lammeum)、石黄衣属（Xanthoria spp.) (例如 Xanthoria calcicola、Xanthoria capensis、Xanthoria ectaneoides、Xanthoria flammea、Xanthoria karrooensis、Xanthoria ligulata、石黄衣（Xanthoria parietina)、 Xanthoria turbinata)等。在例如以下文献中对疏水蛋白进行了综述：Sunde，M et al. (2008) Micron 39:773-84 (Sunde，M 等人，2008 年，《显微学》，第39卷，第 773-784 页）； Linder, M. et al. (2005) FEMS Microbiol Rev. 29:877-96 (Linder, M等人，2005 年，《欧洲微 生物学会联合会微生物学评论》，第29卷，第877-896页）；以及W6sten, H. et al. (2001) Ann. Rev. Microbiol. 55:625-46 ( \V6sten, H.等人，2001 年，《微生物学年鉴》，第 55 卷，第 625-646 页）。
[0045] 在一个特别有利的实施例中，疏水蛋白来自木霉属物种（例如，棘孢木霉、深绿木 霉、绿色木霉、里氏木霉（红褐肉座菌）），有利的是里氏木霉。
[0046] 疏水蛋白样蛋白质（例如"chaplins"）也已在丝状细菌诸如放线菌 (Actinomyces)和链霉菌（Streptomyces sp.)中鉴定出（W0 01/74864 ;Talbot, 2003, Curr Biol), 13:R696-R698(Tblbot，2003 年，《当代生物学》，第 13 卷，第 R696-R698 页））。与真 菌疏水蛋白形成对比的是，这些细菌蛋白质仅可形成最多一个二硫桥，因为它们可能仅具 有两个半胱氨酸残基。这种蛋白质是疏水蛋白的功能等同物的一个例子，并且是落入本文 方法的生物表面活性剂范围内的另一类分子。
[0047] 发酵产生生物表面活性剂是通过将宿主细胞或者微生物在生物反应器或者发酵 罐内的液体发酵培养基中培养来进行的。选择培养基的组成（例如营养物、碳源等）、温度 和pH，以给培养物的生长和/或生物表面活性剂的产生提供适当的条件。通常将空气或者 富氧空气喷射到培养基中，以向培养物提供空气/氧。
[0048] 本文所用的"发酵培养液组合物"是指包含所关注的蛋白（诸如疏水蛋白）的细 胞生长培养基。细胞生长培养基可包括细胞和/或细胞碎片，且可以进行浓缩。示例性的 发酵培养液组合物为包含疏水蛋白的经超滤浓缩的发酵培养液。通常用微量过滤保留细胞 碎片并滤过蛋白质，例如用于细胞分离，而通常用超滤保留蛋白质并滤过溶质，例如用于浓 缩。
[0049] 有利的是，可以用错流膜过滤回收方法制备疏水蛋白浓缩物，如以引用方式并入 的PCT专利公布W0 2011/019686中所述。在其他实施例中，还可以用尺寸排阻过滤和结晶 法制备疏水蛋白浓缩物。
[0050] 本发明具体地涉及表面活性剂的表达，有利的是疏水蛋白，更有利的是制备系统 中的疏水蛋白2,有利的是木霉属，更有利的是里氏木霉。疏水蛋白II基因（hfb2)编码86 个氨基酸的分泌蛋白。信号序列（15个氨基酸）裂解后，成熟蛋白质（HFBII)包含71个氨 基酸和4个二硫键。其分子量大小为约7kd。
[0051] 可从EMBL数据库中根据登录号Y11894获得hfb2基因的序列。具体地，hfb2基 因的序列可为
[0052] CACATTCACTCAACTCCTCTTTCTCAACTCTCCAAACACAAACATTCTTTGTTGAATACCAACCATCAC CACCTTTCAAGATGCAGTTCTTCGCCGTCGCCCTCTTCGCCACCAGCGCCCTGGCTGCTGTCTGCCCTACCGGCCTC TTCTCCAACCCTCTGTGCTGTGCCACCAACGTCCTCGACCTCATTGGCGTTGACTGCAAGACCCGTATGTTGAATTC CAATCTCTGGGCATCCTGACATTGGACGATACAGTTGACTTACACGATGCTTTACAGCTACCATCGCCGTCGACACT GGCGCCATCTTCCAGGCTCACTGTGCCAGCAAGGGCTCCAAGCCTCTTTGCTGCGTTGCTCCCGTGGTAAGTAGTGC TCGCAATGGCAAAGAAGTAAAAAGACATTTGGGCCTGGGATCGCTAACTCTTGATATCAAGGCCGACCAGGCTCTCC TGTGCCAGAAGGCCATCGGCACCTTCTAAAGCAATGGCTTGCTTTACTGCCGGCAGTCTTTGAGAACTCTGGGCTCA CAAAAGACGACTTGCATGTATCATGGGGGCTCGCAAATGGGAGGATTTGGAGGGGATTGAGGCTGGGTTTGGCCTAT TAGAGGATTGCATAATGGAAGATTTGCGAGCAGGACATAGACGTATCTAGAGTTCTAGT(SEQ ID NO: 1)，其中 外显子为核苷酸81-210、281-366和439-483,而内含子为核苷酸211-280和367-438。经 翻译的疏水蛋白可具有序列
[0053] MQFFAVALFATSALAAVCPTGLFSNPLCCATNVLDLIGVDCKTPTIAVDTGAIFQAHCASKGSKPLCCV APVADQALLCQKAIGTF(SEQ ID N0:2)。当面对hfb2核苷酸序列时本领域的技术人员可以确 定hfb2编码序列。hfb2编码序列可在木霉属中表达，有利的是里氏木霉。
[0054] 有利的是，表面活性剂的表达可在启动子的控制下，有利的是纤维素酶启动子，具 体地，外切纤维二糖水解酶启动子，内切葡聚糖酶启动子，或葡糖苷酶启动子。在特别 有利的实施例中，启动子为cbhl启动子。在特别有利的实施例中，hfb2的表达在cbhl启 动子和终止子的控制下。在其他实施例中，启动子可为和/或包括cbh2、egll、或egl2启 动子（参见例如，美国专利公布20100323426)。
[0055] 包含和表达hfb2的表达载体可包含选择性标记，诸如但不限于用于选择真菌转 化体和ColElori的amdS标记以及用于大肠杆菌（E. coli)操纵的AmpR基因。然后，还可将 hfb2编码序列转移到表达质粒以用于在木霉属中合适的表达，有利的是里氏木霉。例如，表 达质粒可为pTrex3gM。
[0056] 载体pTrex3gM之前已有描述，参见例如，美国专利申请公布No. 20110136197、 2010216682或20100041104。简而言之，载体基于包含复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的 基因的大肠杆菌载体。其被工程改造成为Gateway目的载体（Hartley, J. L. et al.，（2000) Genome Research 10:1788_1795(Hartley，J.L.等人，2000 年，《基因组研宄》，第 10 卷，第 1788-1795页））以允许使用Gateway技术（英杰公司（Invitrogen))在里氏木霉cbhl基 因的启动子和终止子区域间插入任何所需的开放阅读框。将构巢曲霉amdS基因插入以在 转化中用作选择性标记。
[0057] 使用Gateway系统将hfb2开放阅读框插入到表达质粒中的cbhl启动子和终止子 区域之间。然后，表达质粒可转化为生产宿主，有利的是木霉属生产宿主，更有利的是里氏 木霉生产宿主。
[0058] 例如，具有本发明的构造的里氏木霉的基因枪转化可使用下列方案执行。制备 孢子的悬浮液（大约3. 5X108孢子/mL，来自里氏木霉的P-37衍生菌株）。将lOOyL至 200 y L之间的该孢子悬浮液分散在MM乙酰胺培养基板的中心。MM乙酰胺培养基具有下 列组分：0? 6g/L 乙酰胺；1. 68g/L CsCl ;20g/L 葡萄糖；20g/L KH2P04;0. 6g/L CaCl 2. 2H20 ; lmL/L 1000X微量元素溶液；20g/L Noble琼脂；pH 5. 5。1000X微量元素溶液包含5. 0g/ L FeS04. 7H20、1. 6g/L MnS04. H20、1. 4g/L ZnS04. 7H20 和 1. Og/L CoCl2. 6H20。使孢子悬浮液 在无菌纱布中的MM乙酰胺培养基的表面上进行干燥。
[0059] 可按照制造商说明书使用来自伯乐公司（Bio-Rad)(加利福尼亚州赫拉克勒 斯（Hercules，CA))的 Biolistic? PDS-1000/He 粒子递送系统（ Biolistic? PDS-1000/ He Particle Delivery System)来转化里氏木霉（Lorito，M.et al.，1993, Curr Genet 24:349-56(Lorito, M.等人，1993年，《当代基因学》，第24卷，第349-356页））。将60mg M10钨粒子置于微量离心管中。加入lmL乙醇，将混合物短暂涡旋并且使混合物静置15分 钟。将粒子在15, OOOrpm下离心15分钟。移除乙醇并将粒子用无菌dH20洗涤三次，然后 加入lmL 50% (v/v)无菌甘油。在祸旋十秒以悬浮鹤之后将25 y L的鹤/甘油粒子悬浮液 移出并置于微量离心管中。
[0060] 在持续涡旋25 y L钨/甘油粒子悬浮液时，可依次加入下列物质，从而允许在各添 加之间温育 5' ；2yL(100-300ng/yL)表达载体（剪切片段）、25yL 2.5M CaClJPlOyL 〇. 1M亚精胺。在添加亚精胺后经过5'温育，使粒子离心3秒。除去上清液；用200 yL 70% (v/v)乙醇洗涤所述粒子，然后使其离心3秒。除去上清液；用200 yL 100%乙醇洗涤所述 粒子，然后离心3秒。除去上清液并加入24 yL 100%乙醇，并通过吹吸混合。将管放置在 超声波清洗浴中大约15秒以在乙醇中进一步重悬所述粒子。在管处于超声浴中时，将8 y L 悬浮颗粒的等分试样移出并放置在微粒载体盘的中心上，所述微粒载体盘被放置于干燥器 中。
[0061] -旦钨/DNA溶液干燥在微粒载体盘上（大约15'），将其放置在轰击室中。然 后放置在包含具有孢子的丽乙酰胺的板中，并且根据生产商说明书使用llOOpsi破裂 盘执行轰击过程。在用钨/DNA粒子轰击平板接种的孢子后，将板在28°C下温育。5天 后，挑选大的转化的菌落至新鲜的丽乙酰胺的次级板（Penttila et al.，（1987)Gene 61:155-164 (Penttila等人，1987年，《基因》，第61卷，第155-164页）），并且在28°C下再 温育3天。将次级板上表现为致密、不透明的生长的菌落转移到单独的MM乙酰胺板。这些 菌落再生长3天并被转移到马铃薯葡糖琼脂板（PDA)，并在28°C下再温育7-10天以实现孢 子形成。
[0062] 在特别有利的实施例中，生产宿主可包括一个或多个缺失和/或突变的纤维素酶 基因，有利的是cbhl基因。在一个实施例中，生产宿主可为cbhl缺失生产菌株。在另一个 实施例中，生产宿主可为cbhl、cbh2、egll和egl2缺失生产菌株。在另一个实施例中，生产 宿主细胞可为美国专利申请序列号13/276,467中所描述的宿主细胞。转化体在摇瓶中在 包含葡萄糖/槐糖的培养基中发酵。
[0063] 在有利的实施例中，包含葡萄糖/槐糖的培养基可由纯化的葡萄糖和/或纯化的 槐糖制成。有利的是，最终溶液中存在约1%、约2%、或约5% (wt/wt)的葡萄糖。有利的 是，槐糖以约 lg/L、约 2g/L、约 5g/L、约 10g/L、约 15g/L、约 20g/L、约 25g/L、约 30g/L、约 35g/L、约 40g/L、约 45g/L 或约 50g/L 存在。
[0064] 在替代实施例中，据发现（参见例如美国专利No. 7, 713, 725)当将全部纤维素 酶制品添加到浓缩的葡萄糖溶液中，并将组合物在约50°C至约75°C (优选地，约50°C至 65°C )下温育至少2天时，形成糖混合物，其包含可测量的纤维素酶基因表达诱导剂，S卩，诱 导性进料组合物。所述诱导性进料组合物具有介于约2和25g/L之间的槐糖。此外，所述 诱导性进料组合物可具有介于约35和60g/L之间的龙胆二糖。令人惊讶的是，所得的混合 物不需要任何进一步的纯化。它本身即有能力诱导纤维素酶制品。本发现为所需的乳糖或 纯化槐糖提供了廉价的替代物，也为固体纤维素提供了更简便的替代物，所述固体纤维素 用于制备由丝状真菌中的诱导型启动子调节的蛋白质。可以特别地设想，本发明的组合物 可用于在木霉属中的纤维素酶启动子的控制下制备纤维素酶或诱导性基因。
[0065] 在产生诱导性进料组合物的替代方法中，可将最终发酵培养液（全部纤维素酶加 上细胞）添加到葡萄糖溶液（例如，20% v/v)中。细胞的存在不影响槐糖的形成。因此， 不需要使用回收的纤维素酶（即，从细胞中分离的纤维素酶制品）。虽然仍存在细胞，但可 使用发酵结束时存在的酶混合物。
[0066] 在一个实施例中，本发明提供了包含浓缩的葡萄糖溶液和全部纤维素酶制品的组 合物，其可用作诱导性进料，以用于通过丝状真菌来制备所关注的蛋白质（诸如表面活性 剂，有利的是疏水蛋白，更有利的是疏水蛋白II)。
[0067] 在一个实施例中，诱导性进料可通过制备5%-75% (wt/wt)葡萄糖的无菌溶液 来制得。将来自里氏木霉的全部纤维素酶制品添加到无菌葡萄糖溶液中，使最终浓度介于 2g和20g总蛋白/L之间。最终蛋白质范围可低至0. 5g/L并且可高至50g/L。所述溶液在 50°C -75°C (优选地，50°C至65°C之间）下温育。在搅拌下将所述溶液温育8小时至7天 之间。在一个实施例中，温育周期大于2天。在第二实施例中，温育周期为2天。在第三实 施例中，温育周期为3天。收获最终无菌溶液并用于发酵进料。在一个实施例中，用60% (wt/wt)葡萄糖溶液制备诱导性进料。在另一个实施例中，通过将全部纤维素酶制品添加到 葡萄糖溶液以使最终浓度为约2至约10g总蛋白/L来制备诱导性进料。
[0068] 如美国专利No. 7, 713, 725中所述制备葡萄糖/槐糖进料。例如，可将60% (wt/ wt)葡萄糖溶液在121°C溶解并灭菌30分钟。将温度降低至65°C并加入10g总蛋白（先前 由里氏木霉产生的全部纤维素酶）/L。缓慢搅拌混合物并在65°C下保持3天。在该60%葡 萄糖溶液中测量到槐糖含量为12g/L。
[0069] 在约25°C至约37°C (有利的是在约34°C )和约pH 3至约pH 5. 5 (有利的是约 pH 3. 5)栽培，并在约25°C至30°C (有利的是在约28°C )和约pH 3至约pH 5. 5(有利的 是在约pH 4.5)制备时有利地进行发酵。可添加消泡剂。在另一个实施例中，有利的是使 疏水蛋白不溶解以避免起泡（参见例如，美国临时专利申请序列号61/469, 067)。
[0070] 在有利实施例中，约60%葡萄糖（wt/wt)的储备溶液可与约12g/L槐糖的储备溶 液反应，其中混合物可缓慢进料到发酵罐中。可将混合物持续进料到发酵罐中。引入反应 器的每个物流优选地控制在预定速率，或者响应于可通过监测例如来自发酵罐的废气中碳 和能源基质、PH、溶解氧、氧气或二氧化碳的浓度所确定的需要，响应于可通过透光率测量 的细胞密度等。各种物质的进料速率可变化，以获得尽可能快的细胞生长速率，与碳和能源 的有效利用一致，以获得相对于基质进料量尽可能高的微生物细胞产量。参见例如美国专 利No. 7, 713, 725。在有利的实施例中，进料速率可为约5至约20克干固体每升每小时，有 利地约10克干固体每升每小时。
[0071] 因为发酵罐的收获可产生主要由泡沫组成的培养液，所以发酵罐有利地非常缓慢 地冷却并降压。培养液还可能需要用约50%、约100%、约150%、约200%、约250%、约 300%、约350%或约400%的温工业用水稀释，以有助于分散泡沫。可通过过滤移除细胞， 诸如40X40cm压滤机，使用娃藻土 Celite FW-12作为混合剂。可用温工业用水置换滤液。 这种方法在具有可忽略量的泡沫的均匀、澄清滤液中提供了疏水蛋白的全面回收。因为温 度高于消泡剂的浊点，这有助于降低滤液中的消泡剂的量。
[0072] 可在低于MAZU?消泡剂的浊点下对滤液进行超滤（UF)浓缩，这同样有助于进一 步移除消泡剂。UF元件可为连接到旋转叶片式再循环泵和冷却的贮存器上的Millipore PES 10kD 0. 6m2螺旋式旋拧盒。
[0073] 通过添加20g娃藻土助滤剂（Filtercel-70)制备用于无菌过滤的2升浓缩物。可 通过与部分真空同时使用的两个1升的Millipore 0. 2 ym PES瓶顶膜过滤器进行无菌过 滤，从而避免泡沫从滤液中溶解的空气中冒出。
[0074] 在特别有利的实施例中，所得的疏水蛋白的浓度可高于lg/L、高于2g/L、高于3g/ L、高于4g/L、或高于5g/L。
[0075] 虽然已详细描述了本发明及其优点，但应理解，可在不偏离所附权利要求书中所 限定的本发明精神和范围的前提下，在这里作出各种变化、替换和变更。
[0076] 将在以下实例中对本发明进行进一步说明，实例仅以举例说明目的给出，并不旨 在以任何方式限制本发明。
[0077] 实例
[0078] 疏水蛋白II.本实例报告了生产宿主里氏木霉中木霉属天然疏水蛋白II的制备。 根据供应商（加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司（Invitrogen，Carlsbad，CA))的指导， hfb2基因通过聚合酶链反应从里氏木霉的基因组DNA扩增为包含三个外显子和两个内含 子的451bp DNA片段，并在5'端添加CACC以有利于定向克隆到pENTR/D-TOPO中。木霉属 中的hfb2基因表达在质粒pTrex3gM中的cbhl启动子和终止子的控制下。国际专利公开 W0 05/001036中描述的里氏木霉的四缺失菌株（Acbhl、Acbh2、Aegll、Aegl2)可用于 本发明。
[0079] 表达质粒.hfb2表达质粒包含用于选择真菌转化体和ColElori的amdS标记以 及用于大肠杆菌操纵的AmpR基因。hfb2基因的聚合酶链反应片段首先被克隆到pENTR/ D-T0P0载体中。通过DNA测序来验证hfb2基因的保真性。然后通过Gateway克隆方法将 hfb2基因转移到pTrex3gM以形成表达质粒：pTrex3gM_HFBII。
[0080] 菌株。使用基因枪转化方法使用全部质粒将表达质粒转移至木霉属生产宿主 (Morph 1. 1 pyr+菌株）。将整个质粒插入到Morphl. 1菌株的基因组中而无需移除细菌 DNA序列。获得11个稳定的转化体并且全部产出一定含量的HFBII。三个转化体在摇瓶中 产生大量的HFBII。选择最好的转化体以用于进一步发酵研宄。
[0081] 在14L发酵罐中制备HFBII.0. 8L培养基接种有1.5mL里氏木霉冷冻孢子悬浮 液，作为接种摇瓶。将该摇瓶分离成两个〇. 4L部分并在48小时后转移到两个不同的15L Biolafitte发酵罐中的2X7L发酵培养基中。发酵罐最初在34°C、pH 3. 5运行，之后在 28°C、pH 4. 5运行。在每分钟10标准升气流下，将搅拌保持在500RPM。单独地进料消泡剂 和葡萄糖/槐糖。通过凝胶电泳测量蛋白质制备。
[0082] 通过首先缓慢冷却和降压来收获发酵罐。用200%的温工业用水稀释收获的培养 液以分散泡沫。使用硅藻土 Celite FW-12在40X40cm压滤机上通过过滤移除细胞。用温 工业用水置换滤液。这种方法在具有可忽略量的泡沫的均匀、澄清滤液中提供了 HFBII的 全面回收。因为温度高于消泡剂的浊点，这有助于降低滤液中的消泡剂的量。
[0083] 在低于消泡剂的浊点下对滤液进行超滤（UF)浓缩，这同样有助于进一步移除消 泡剂。UF元件为连接到旋转叶片式再循环泵和冷却的贮存器上的Millipore PES 10kD 0. 6m2螺旋式旋抒盒。通过添加20g娃藻土（Filtercel-70)制备用于无菌过滤的2升浓缩 物。通过两个1升的Millipore 0.2 ym PES瓶顶膜过滤器进行无菌过滤。
[0084] 最终滤液包含95-115g HFBII每千克滤液，如使用溶菌酶作为标准通过SDS-PAGE 密度计量学所确定。无菌滤液包含19 %干固体，这使得酶总体纯度为50 % -60 %。在SDS-凝 胶上的非-HFBII条带相当于泳道总密度的5%。
[0085] 对疏水蛋白进行基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS)分 析。
[0086] 如上所述，已详细地描述了本发明的优选实施例，但应理解，由以上段落限定的本 发明并不局限于以上描述所说明的具体细节，因为在不偏离本发明的精神或者范围的前提 下可以对本发明作出许多显而易见的变型。
【权利要求】
1. 一种用于产生在诱导型启动子的控制下的基因编码的疏水蛋白的方法，包括以下步 骤： (a) 生成第一混合物，其包含介于约5%至约75%之间的葡萄糖和纤维素酶制品； (b) 在某一温度下温育所述第一混合物并持续足够长的时间以产生诱导性进料组合 物，所述组合物包含浓度在2g/L至25g/L范围内的槐糖、浓度在35g/L至60g/L范围内的 龙胆二糖以及葡萄糖；以及 (c) 用所述诱导性进料组合物培养宿主细胞，所述诱导性进料组合物的量能有效诱导 疏水蛋白的产生，所述宿主细胞包含在槐糖-诱导型启动子或龙胆二糖-诱导型启动子的 控制下编码疏水蛋白的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述产生的蛋白质为异源疏水蛋白。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水蛋白为疏水蛋白I。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水蛋白为疏水蛋白II。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞已被遗传工程改造以表达在槐糖-诱导 型启动子或龙胆二糖-诱导型启动子的控制下的疏水蛋白基因。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述所关注的蛋白质在纤维素酶基因启动子的控 制下。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述启动子是来自里氏木霉（Trichoderma reesei)的cbhl启动子。
8. 根据权利要求5所述的方法，其中所述疏水蛋白基因在槐糖-诱导型启动子的控制 下。
9. 根据权利要求5所述的方法，其中所述所关注的蛋白质在龙胆二糖-诱导型启动子 的控制下。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为丝状真菌细胞。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述丝状真菌选自木霉属（Trichoderma)、腐质 霉属（Humicola)、镰孢属（Fusarium)、曲霉属（Aspergillus)、脉孢菌属（Neurospora)、青 霉属（Penicillium)、头抱霉属（Cephalosporium)、毁丝霉属（Myceliophthora)、嗜热真菌 属（Thermomyces)、金抱子菌属（Chrysosporium) 〇
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述丝状真菌为木霉属（Trichoderma)物种。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述丝状真菌为里氏木霉（Trichoderma reesei)〇
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一混合物中的所述纤维素酶制品包含约 0· 5g/L至约50g/L总蛋白。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述第一混合物中的所述总蛋白浓度在约2g/L 至约l〇g/L的范围内。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一混合物在约50°C至约70°C下温育。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述第一混合物温育8小时至7天之间。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶制品为里氏木霉（Trichoderma reesei)纤维素酶制品。
19. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一混合物在约50°C至约65°C的温度下温 育两至三天。
20. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一混合物在约65°C的温度下温育两至三 天。
21. 根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶制品为已被工程改造以过表达 β-葡糖苷酶的里氏木霉（Trichoderma reesei)的所述产品。
22. 根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶制品为全部纤维素酶组合物或富 集β-葡糖苷酶的纤维素酶组合物。
23. 根据权利要求12所述的方法，其中编码一个或多个纤维素酶的一个或多个木霉属 (Trichoderma)序列缺失或损坏。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述木霉属（Trichoderma)细胞进一步被修饰 以损坏或缺失egl5基因。
25. 根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水蛋白基因有效连接至cbhl、cbh2、egll 或egl2启动子，由此所述疏水蛋白的表达在所述cbhl、cbh2或egll、egl2启动子的控制 下。
26. 根据权利要求1所述的方法，其中编码所述疏水蛋白的所述核酸分子包含hfb2编 码序列。
27. 根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖和槐糖在诱导性进料组合物中提供。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中槐糖以包含约lg/L至约50g/L的量存在于所述 诱导性进料组合物中。
29. 根据权利要求27所述的方法，其中所述葡萄糖以包含约5-75% wt/wt的量存在于 所述诱导性进料组合物中。
30. 根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖以包含约60% wt/wt的量存在于 所述诱导性进料组合物中，所述槐糖以包含约12g/L的量存在于所述诱导性进料组合物 中，编码所述疏水蛋白的所述核酸分子为hfb2编码序列，所述hfb2编码序列有效连接 至所述cbhl启动子，由此疏水蛋白表达在所述cbhl启动子的控制下，并且所述木霉属 (Trichoderma)包括木霉属（Trichoderma) cbhl、cbh2、egll、egl5 和 egl2 编码序列中的一 个或多个缺失或损坏的里氏木霉（Trichoderma reesei)。
【文档编号】C12P21/02GK104520434SQ201380023485
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2012年5月21日
【发明者】M·华德 申请人:丹尼斯科美国公司