具有改进的转化效率的细菌突变体的制作方法

具有改进的转化效率的细菌突变体的制作方法
【专利摘要】在此提供了具有改进的转化效率的乳杆菌突变体，该突变体包括对编码限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。还描述了用于产生这些突变体的方法、用于使用这些突变体产生转化体的方法、以及用于使用这些突变体产生多肽或发酵产物的方法。
【专利说明】具有改进的转化效率的细菌突变体
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[000引背景
[0004]由于它缺乏宿主样甲基化模式，抑或由于相对于宿主DNA的稀有碱基修饰的存在， 对于给定细胞，被识别为外源的DNA可W被祀向于在细胞内降解炬air(贝尔）和Black(布 莱克），2007,JMolBiol(分子生物学杂志）（366:768-778)。据报道，随后被限制性内切 核酸酶降解构成了将DNA引入细菌中的有效屏障炬riggs(布里格斯）等人Appl.Environ. Microbiol.(应用与环境微生物学）1"4, 6〇, 2〇〇6-2〇10 ;Accetto(阿奇巧）等人FEMS Microbiol.Lett.(欧洲微生物学会联合会微生物学快报）2005, 247, 177-183 ;(贝尔）和 Black(布莱克），J.Mol.Biol.(分子生物学杂志）2007, 366, 768-778;Corvaglia(科尔瓦 利亚）等人Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院院刊）2010, 107, 11954-11958 ; Monk(蒙克）等人，2012,HiBio3(2):e00277-ll.doi:10. 1128/mBio. 00277-11)。
[0005] 通过多种标准，该些基于核酸酶的系统被分为四种主要类型，I型至IV型 (Robeds(罗伯茨）等人NucleicAcidsRes.(核酸研究）2003,31, 1805-1812)。I型至 III型系统涵盖了成对的甲基转移酶和内切核酸酶活性，降解缺乏适当甲基化模式的外源 DNA，而IV型酶是仅切割已经被修饰的DNA底物的内切核酸酶（Tock(巧科）和化yden(德 莱登），Curr.Opin.Microbiol.(微生物学新见）2005, 8, 466-472)。
[0006] 对于多种工业上相关的过程（例如代谢工程和生化生产）而言，细菌转化体提供 了关键平台。然而，将外源DNA引入一些细菌宿主（例如乳杆菌）会是一个无效率的过程， 生成的转化体极少，如果有的话。在本领域中，对于将DNA引入细菌宿主细胞来改进所得转 化体的效率的新方法存在需要。本发明满足了该些和其他需要。
[0007] 概述
[0008] 在此描述了具有改进的转化效率的分离的乳杆菌突变体。在一个方面，是亲本乳 杆菌菌株的突变体，包含对编码I型限制修饰系统亚基（例如限制性亚基（restriction subunit)或特异性亚基（specificitysubunit))的内源基因的破坏，其中当在相同条件下 培养时，与亲本乳杆菌菌株相比，该突变体具有改进的转化效率。在一些方面，乳杆菌突变 体是路氏乳杆菌突变体。
[0009] 还描述了用于获得乳杆菌突变体的方法，该些方法包括在亲本乳杆菌菌株中破坏 编码I型限制修饰系统亚基（例如限制性亚基或特异性亚基）的内源基因。
[0010] 还描述的是用于获得乳杆菌转化体的方法，该些方法包括将异源多核巧酸转化进 入乳杆菌突变体。
[0011] 还描述的是产生多肤的方法，该些方法包括；(a)培养包含编码该多肤的异源多 核巧酸的乳杆菌转化体；W及化）回收该多肤。
[0012] 还描述的是产生发酵产物的方法，该些方法包括；（a)培养包含编码该一发酵通 路的多肤的异源多核巧酸的乳杆菌转化体；W及化）回收该发酵产物。在一些方面，发酵产 物是丙醇（正丙醇或异丙醇）。
[0013] 附图简要说明
[0014] 图1示出了与来自路氏乳杆菌SJ11400的相应的突变的特异性结构域相比，来自 路氏乳杆菌SJ10655的限制修饰系统特异性结构域LAR0818(SEQIDN0:2)的比对。
[0015] 图2示出了与来自路氏乳杆菌SJ10655的相应的特异性结构域相比，来自路氏乳 杆菌JCM1112的限制修饰系统特异性结构域LAR1344(SEQIDN0:14)的比对。
[0016] 图3示出了与来自路氏乳杆菌SJ10655的相应的特异性结构域相比，来自路氏乳 杆菌JCM1112的限制修饰系统特异性结构域LAR1346(SEQIDN0:12)的比对。
[0017] 图4示出了PSJ10600的质粒图。
[0018] 图5示出了PJP042的质粒图。
[0019] 图6示出了PSJ10762的质粒图。
[0020] 图7示出了PTRGU1065的质粒图。
[0021] 图8示出了PTRGU1073的质粒图。
[0022] 图9示出了地KQ357的质粒图。
[0023] 定义
[0024] 破坏；术语"破坏"是指参比基因的编码区和/或控制序列被部分地或完全地修饰 (例如通过删除、插入、和/或取代一个或多个核巧酸，或通过与RNAi或反义技术关联）， 导致表达缺失（失活）或降低，和/或编码的多肤的酶活性缺失或/降低。可W使用本领 域已知的技术测量破坏的效果，例如使用来自在此引用的无细胞提取物测量来检测酶活性 的缺失或降低；或通过相应的mRNA的缺失或降低（例如至少25%降低、至少50%降低、至 少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低、或至少90 %降低）；具有酶活性的相应多肤的 量的缺失或降低（例如至少25%降低、至少50%降低、至少60%降低、至少70%降低、至 少80%降低、或至少90%降低）；或具有酶活性的相应多肤的特定活性的缺失或降低（例 如至少25 %降低、至少50 %降低、至少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低、或至少 90%降低）。可W通过本领域已知的方法产生感兴趣的具体基因的破坏，例如通过直接同 源重组（参见MethodsinYeastGenetics(酵母遗传实验方法）（1997版），Adams(亚当 斯）、Gottschling(戈特施林）、Kaiser(凯泽）、和Stem(斯提姆），ColdSpringHarbor Press(冷泉港出版社）（1998))。
[0025] 亲本；术语"亲本"或"亲本乳杆菌菌株"是指对其做出破坏来产生在此描述的突 变体乳杆菌菌株的乳杆菌菌株。亲本可W是天然存在的（野生型）多肤或预先修饰的乳杆 菌菌株。
[0026] 突变体；术语"突变体"是指在对亲本乳杆菌菌株做出破坏后，生成的乳杆菌菌株。
[0027]I型限制修饰系统；术语"I型限制修饰系统"是指包含至少一个限制性亚基 化sdR)、至少一个修饰性亚基（modificationsubunit)化sdM)W及至少一个说明性亚基 (specificationsubunit) ^sd巧的多功能酶复合物，其中该复合物发挥内切核酸酶和甲基 转移酶活性（参见Murray(穆雷），Microbiol.Mol.Biol.Rev.(微生物学与分子生物学评 论）2000,64:412-4:34)。
[002引化dR亚基包括用于ATP水解的活性位点和对于内切核酸酶活性而言所必需的其 他序列。化dM亚基包括用于DNA甲基化的活性位点和用于AdoMeUS-腺巧甲硫氨酸）的结 合位点。HsdS亚基包括赋予复合物的限制性活性和修饰性活性该二者祀序列特异性的两个 祀识别结构域。
[0029] 改进的转化效率；术语"改进的转化效率"是指当在相同条件下转化并且培养 时，与亲本乳杆菌菌株相比，参比乳杆菌突变体菌株能够产生增加量的转化体。可W通过 用至少一种适合的DNA，例如在此引用的质粒中的任一种（例如PSJ10 76 2、PTRGU106 5、 PTRGU1073)，使用如在W下实例中描述的电穿孔，产生增加量的转化体，由此来证明改进的 转化效率。在一些方面，与亲本乳杆菌菌株相比，该乳杆菌突变体菌株能够产生至少2倍 的，例如至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、 至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍、至少10000倍、至少20000倍、至少50000倍、或 至少100000倍更多的转化体。
[0030] 分离的：术语"分离的"意思指处于自然界中不存在的形式或环境中的一种参比 物质。分离的物质的非限制性实例包括（1)任何非天然发生的物质，（2)任何物质，包括但 不局限于从与其性质上相关的一种或多种或所有天然发生的组分至少部分除去的任何宿 主细胞、酶、变体、核酸、蛋白、肤或辅因子；（3)相对于自然中发现的物质，由人手工修饰的 任何物质；或（4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质 (例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；W及使用比与编码该物质 的基因天然相关的启动子更强的启动子）。
[0031] 成熟多肤序列：术语"成熟多肤序列"是指在任何翻译后序列修饰（例如N末 端加工和/或C末端截短）之后的参比多肤序列部分。例如基于信号P(Signal巧程 序（Nielsen(尼尔森）等人，Protein!Engineering(蛋白质工程）1997, 10, 1-6)或 Inte;rP;roScan程序（The!EuropeanBioinformaticsInstitute(欧洲生物信息学研究 所）），可W预测成熟多肤序列。在一些实例中，成熟多肤序列可W与整个参比多肤序列相 同。本领域已知，宿主细胞可W产生由相同多核巧酸表达的两种或更多种不同的成熟多肤 序列的混合物（即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸）。
[0032] 编码序列；术语"编码序列"是指明确一种多肤的氨基酸序列的多核巧酸序列。编 码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常WATG起始密码子或替代性 起始密码子（例如GTG和TTG)开始，并且W终止密码子（例如TAA、TAG、和TGA)结束。编 码序列可W是基因组DNA、cDNA、合成的多核巧酸、和/或重组多核巧酸的一个序列。
[0033] 成熟多肤编码序列；术语"成熟多肤编码序列"是指编码成熟多肤序列的参比多核 巧酸序列部分。例如基于信号P(Signal巧程序（同上）或Inte巧roScan程序（同上），可 W预测成熟多肤编码序列。在一些实例中，成熟多肤编码序列可W与整个参比多核巧酸序 列相同。
[0034] 序列一致性；两个氨基酸序列之间或两个核巧酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。
[00巧]出于在此描述的目的，使用Needleman(尼德曼）-Wunsch(翁施）算法来确定在两 个氨基酸序列之间的序列一致性的程度（Needleman(尼德曼）和Wunsch(翁施），J.Mol. Biol.(分子生物学杂志）1970, 48, 443-453)，如在EMBOSS软件包的Needle(尼德尔）程序 所实现的（EMBOSSJhe!EuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(欧洲分子生 物学开放软件包），化Ce(赖斯）等人，TrendsGenet.(遗传学趋势）2000, 16, 276-277)，优 选的是版本3. 0. 0或更新的版本。所使用的该些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚 分0. 5,及邸L0SUM62炬L0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。将标记为"最长一致性"的尼 德尔输出（使用非简化选项（nobriefoption)获得）用作一致性百分比并且计算如下：
[0036](一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数）
[0037] 出于在此描述的目的，使用Needleman(尼德曼）-Wunsch(翁施）算法来确定在 两种脱氧核巧酸序列之间的序列一致性的程度（Needleman(尼德曼）和Wunsch(翁施）， 1970,同上），如在EMBOSS软件包的Needle(尼德尔）程序所实现的（EMBOSS;化e化ropean MolecularBiologyOpenSoftwareSuite(欧洲分子生物学开放软件包），I?ice(赖斯）等 人，2000,同上），优选的是版本3. 0. 0或更新的版本。使用的任选参数是空位开放罚分10， 空位延伸罚分0. 5及邸NA即化(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。标记为"最长一 致性"的尼德尔的输出（使用-nobrief选项获得）被用作百分比一致性并且被计算如下：
[0038](一致的脱氧核糖核巧酸X100)/(比对长度-比对中的空位总数）
[0039] 异源多核巧酸：在此将术语"异源多核巧酸"定义为W下多核巧酸；对该宿主细胞 而言不是天然的多核巧酸；已经对编码区做出一种或多种（例如，两种，若干种）结构修饰 的天然多核巧酸；由于通过重组DNA技术对DNA的操作而定量改变其表达的天然多核巧酸， 例如，将一种不同的（外源的）启动子连接至该多核巧酸；或通过向该宿主细胞中引入该多 核巧酸的一个或多个另外的拷贝而定量改变其表达的天然多核巧酸。
[0040] 内源基因；术语"内源基因"是指对于亲本乳杆菌菌株是原生（native)的基因。
[0041] 核酸构建体；术语"核酸构建体"是指一种包括一个或多个（例如，两个、若干个） 控制序列的多核巧酸。多核巧酸可W是单链的或双链的，并且可W分离自天然存在的基因、 可W被修饰来W另外的不会在自然界中存在的方式包含核酸的区段，或可W是合成的。
[0042] 控制序列；术语"控制序列"是指多肤表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码 多肤的多核巧酸可W是天然的或外源的，并且彼此可W是原生的或外源的。此类控制序列 包括但不局限于，前导序列、聚腺巧酸化序列、前肤序列、启动子序列、信号肤序列及转录终 止子序列。出于引入有利于将该些控制序列与编码一种多肤的多核巧酸的编码区连接的特 异性限制酶切位点的目的，该些控制序列可W提供有多个接头。
[0043] 可操作地连接；术语"可操作地连接"是指一种配置，其中一个控制序列相对于一 种多核巧酸的编码序列放置在一个适当位置处，W使得控制序列指引编码序列的表达。
[0044] 表达；术语"表达"包括在多肤的产生中涉及的任何步骤，包括但不局限于，转录、 转录后修饰、翻译、翻译后修饰、W及分泌。可W对表达进行测量一例如，来检测增加的表 达一通过本领域已知的技术，例如测量mRNA和/或翻译的多肤的水平。
[004引表达载体；术语"表达载体"是指一种线性或环形的DM分子，该分子包括编码一 种多肤的多核巧酸并且被可操作地连接至控制序列，其中该些控制序列提供编码该多肤的 多核巧酸的表达。最低限度上，该表达载体包括启动子序列，W及转录和翻译终止信号序 列。
[0046] 宿主细胞；术语"宿主细胞"是指对于用核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、 转导等是易感的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本 细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0047] 转化；术语"转化"是指将异源多核巧酸引入乳杆菌细胞，该样使得该DNA维持为 染色体整合体或维持为自主复制的染色体外载体。转化后生成的乳杆菌细胞在此被描述为 "转化体"。
[004引等位基因变体；术语"等位基因变体"是指占用同一染色体位点的一种基因的两个 或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可W导致群体内的多 态性。基因突变可W是静默的（在所编码的多肤中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肤。多肤的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肤。
[0049] 在此提及"约"一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及 "约X"的描述包括方面"X"。当与测量值组合使用时，"约"包括涵盖至少与测量该具体数 值的方法相关的不确定性的范围，并且可W包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范 围。
[0050] 如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式"一种/个"、"或"W及"该"包括复 数指示物，除非上下文W另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的该些方面包括"由 方面组成"和/或"基本由方面组成"。
[0051] 除非由上下文W另外的方式定义或清楚表明，在此使用的所有技术术语和科学术 语具有如本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。
[00閲详细说明
[0053] 乳杆菌突变体
[0054]除其他W外，在此描述的是亲本乳杆菌菌株的突变体，例如分离的突变体，包括对 内源限制修饰系统基因（例如编码I型限制修饰系统亚基的基因）的破坏，其中当在相同 条件下培养时，与亲本乳杆菌菌株相比，该些突变体具有改进的转化效率。如在W下实例部 分中所示， 申请人:已经出乎意料地发现对内源限制修饰系统基因的破坏可W改进乳杆菌宿 主的转化效率。此类破坏可W防止转化体DNA被宿主细胞的限制修饰系统降解，由此改进 了用于生物技术应用的宿主细胞的转化效率和总体有用性。
[0055] 突变体和相关方法的亲本菌株可W是任何乳杆菌菌株，例如野生型乳杆菌或其突 变体。在一些方面，亲本乳杆菌菌株是植物乳杆菌、食果糖乳杆菌、或路氏乳杆菌菌株。在 一个方面，亲本菌株是植物乳杆菌菌株。在另一方面，亲本菌株是食果糖乳杆菌菌株。在另 一方面，亲本菌株是路氏乳杆菌菌株。
[0056]设想的另外的亲本乳杆菌菌株包括但不局限于耐酸乳杆菌、一种乳杆菌 (Lacidifarinae)、马里乳杆菌、嗜酸乳杆菌、敏捷乳杆菌、低温乳杆菌、消化乳杆菌、解 淀粉乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、一种乳杆菌（L.amylotro地icus)、食淀粉乳杆菌、动物乳 杆菌、胃窦乳杆菌、一种乳杆菌（L.apodemi)、一种乳杆菌（L.aquaticus)、亚利桑纳乳 杆菌、鸟乳杆菌、己伐利亚乳杆菌、双发酵乳杆菌、己博乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、 保加利亚乳杆菌、可可乳杆菌、一种乳杆菌（L.camelliae)、多毛乳杆菌、一种乳杆菌 (L.carni)、干酪乳杆菌、链状乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、一种乳杆菌（L.ceti)、一种乳杆 菌（L.coleohominis)、丘状菌落乳杆菌、一种乳杆菌（L.composti)、曲面乳杆菌、一种乳 杆菌（L.con化SUS)、棒状乳杆菌、卷曲乳杆菌、一种乳杆菌（L.crustorum)、弯曲乳杆菌、 一种乳杆菌（L.cypricasei)、德氏乳杆菌、糊精乳杆菌、一种乳杆菌（L.diolivorans)、一 种乳杆菌（L.divergens)、一种乳杆菌（L.durianis)、一种乳杆菌（L.equi)、一种乳杆菌 (L.equicursoris)、一种乳杆菌（L.equigenerosi)、一种乳杆菌（L.fabifermentans)、香 肠乳杆菌、一种乳杆菌（L.farraginis)、一种乳杆菌（L.ferintoshensis)、发酵乳杆菌、 一种乳杆菌（L.化rnicalis)、食果糖乳杆菌、果糖乳杆菌、一种乳杆菌（L.化umenti)、一 种乳杆菌（L.fuchuensis)、鸡乳杆菌、加氏乳杆菌、一种乳杆菌（L.gastri州S)、一种乳杆 菌（L.曲anensis)、草乳杆菌、一种乳杆菌(X.halotolerans)、一种乳杆菌(X.hammesii)、 哈氏乳杆菌、一种乳杆菌（L.harbinensis)、一种乳杆菌（L.hayakitensis)、瑞dr乳杆 菌、异型腐酒乳杆菌、希氏乳杆菌、同型腐酒乳杆菌、一种乳杆菌（L.hordei)、一种乳杆菌 (L.iners)、一种乳杆菌（L.ingluviei)、肠乳杆菌、詹氏乳杆菌、约氏乳杆菌、一种乳杆菌 (L.kalixensis)、一种乳杆菌（L.kandleri)、马乳酒样乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、高加索酸 奶粒乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌、一种乳杆菌（L.kimchii)、一种乳杆菌（L.kisonensis)、 一种乳杆菌（L.kitasatonis)、一种乳杆菌（L.kunkeei)、一种乳杆菌（L.Iactis)、一种乳 杆菌（L.Ieichmannii)、林氏乳杆菌、坏发酵乳杆菌、苹果乳杆菌、麦芽香乳杆菌、食木墓 乳杆菌、一种乳杆菌（L.mindensis)、一种乳杆菌（L.minor)、一种乳杆菌（L.minutus)、 黏膜乳杆菌、鼠乳杆菌、一种乳杆菌（L.nagelii)、一种乳杆菌（L.namurensis)、一种 乳杆菌（L.nantensis)、一种乳杆菌（L.nodensis)、一种乳杆菌（L.oeni)、一种乳杆 菌（L.oligofermentans)、口乳杆菌、一种乳杆菌（L.otakiensis)、面包乳杆菌、美洲 虎乳杆菌、一种乳杆菌（L.parabrevis)、类布氏乳杆菌、类干酪乳杆菌、一种乳杆菌 (L.paracollinoides)、一种乳杆菌（L.parafarraginis)、类高加索酸奶乳杆菌、一种乳 杆菌（X.paralimentarius)、一种乳杆菌（X.paraplantarum)、戊糖乳杆菌、一种乳杆菌 (L.perolens) > 一种乳杆菌（L.piscicola)、植物乳杆菌、一种乳杆菌（L.pobuzihii)、桥 乳杆菌、一种乳杆菌（L.psittaci)、一种乳杆菌（Lrapi)、一种乳杆菌（Lrennini)、路氏 乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、一种乳杆菌（L.rimae)、罗氏乳杆菌、一种乳杆菌（L.rossiae)、瘤 胃乳杆菌、一种乳杆菌（L.saerimneri)、一种乳杆菌（L.sakei)、唾液乳杆菌、一种乳杆菌 (L.sanfranciscensis)、一种乳杆菌（L.satsumensis)、一种乳杆菌（L.secaliphilus)、 一种乳杆菌（L.senmaiz址ei)、沙氏乳杆菌、一种乳杆菌（L.siliginis)、一种乳杆 菌（L.similis)、一 种乳杆菌（L.sobrius)、一 种乳杆菌（L.spicheri)、一 种乳杆 菌（L.sucicola)、一种乳杆菌（L.suebi州s)、一种乳杆菌（L.sunkii)、一种乳杆菌 (L.suntoryeus) > 一 种乳杆菌（L.taiwanensis)、一 种乳杆菌（L.thailandensis)、一 种 乳杆菌（L.thermotolerans)、发状乳杆菌、一种乳杆菌（L.tucceti)、齿銀乳杆菌、一种 乳杆菌（L.ul化nensis)、一种乳杆菌（L.uvarum)、牛痘乳杆菌、阴道乳杆菌、一种乳杆菌 (L.versmoldensis)、绿色乳杆菌、较乳杆菌、一种乳杆菌（L.xylosus)、果汁乳杆菌、玉米乳 杆菌、和一种乳杆菌（L.zymae)。
[0057] 破坏的基因可W是编码I型限制修饰系统亚基（例如I型限制修饰系统的限制性 亚基、I型限制修饰系统的特异性亚基、和/或I型限制修饰系统的修饰性亚基）的任何适 合的内源基因。
[005引祀基因的实例包括编码包含SEQIDN0:2、4、和/或6的特异性亚基；SEQIDN0:8的限制性亚基；W及SEQIDNO:10的修饰性亚基的路氏乳杆菌多功能酶复合物的那些。另 外的祀包括编码包含SEQIDNO:12和/或14的特异性亚基（specificitysubunit);SEQ IDNO:16的限制性亚基；W及SEQIDNO:18的修饰性亚基的路氏乳杆菌多功能酶复合物 的基因。祀基因的另外的实例包括在此描述的那些，例如表4中描绘的那些。
[0059] 在一些方面，编码限制性亚基的内源基因和编码特异性亚基的内源基因该二者被 破坏。在一些方面，编码限制性亚基的内源基因被破坏，编码特异性亚基的内源基因被破 坏，并且编码修饰性亚基内源基因被破坏。
[0060] 在突变体和相关方法的一些方面，破坏的基因是编码I型限制修饰系统的特异性 亚基的内源基因。编码特异性亚基的内源基因的实例包括具有SEQID^:1、3、5、11、或13 中示出的编码序列的路氏乳杆菌基因，SEQID^:1、3、5、11、或13分别编码具有569 10 ^:2、4、6、12、和14的氨基酸序列的亚基。在一些方面，内源基因编码与569 10^:2、4、 6、12、14、表4中描绘的任何特异性亚基的序列、或其成熟多肤序列具有至少60%，例如至 少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至 少99%、或100%的序列一致性的特异性亚基。在一些方面，内源基因编码具有与SEQID NO:2、4、6、12、14或表4中标绘的任何特异性亚基的序列差别不大于十个氨基酸，例如不大 于五个氨基酸、不大于四个氨基酸、不大于H个氨基酸、不大于两个氨基酸、或不大于一个 氨基酸的序列的特异性亚基。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:2或由其组成的 特异性亚基。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:2的成熟多肤序列或由其组成的 特异性亚基。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:4或由其组成的特异性亚基。在 一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:4的成熟多肤序列或由其组成的特异性亚基。在 一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:6或由其组成的特异性亚基。在一些方面，内源基 因编码包括SEQIDN0:6的成熟多肤序列或由其组成的特异性亚基。在一些方面，内源基 因编码包括SEQIDNO: 12或由其组成的特异性亚基。在一些方面，内源基因编码包括SEQ IDNO: 12的成熟多肤序列或由其组成的特异性亚基。在一些方面，内源基因编码包括SEQ IDNO: 14或由其组成的特异性亚基。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDNO: 14的成熟 多肤序列或由其组成的特异性亚基。
[0061] 在突变体或相关方法的其他方面，编码特异性亚基的内源基因的编码序列与SEQ IDNO: 1、3、5、11、13、编码表4中描绘的特异性亚基的任何基因序列、或其成熟多肤编码序 列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、 至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面，内源基因的编码序 列包括SEQIDNO: 1或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDNO: 1的 成熟多肤编码序列或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDN0:3或由 其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDN0:3的成熟多肤编码序列或由其 组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDN0:5或由其组成。在一些方面，内源 基因的编码序列包括SEQIDN0:5的成熟多肤编码序列或由其组成。在一些方面，内源基 因的编码序列包括SEQIDNO: 11或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQ IDNO: 11的成熟多肤编码序列或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQID NO: 13或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDNO: 13的成熟多肤编码 序列或由其组成。
[0062] 在突变体或相关方法的其他方面，在至少低严谨度条件下，中严谨度条件下、 中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下，编码特异性亚基的基因的 编码序列与SEQIDNO: 1、3、5、11、13，或编码表4中描绘的特异性亚基的任何基因序列的全 长互补链杂交。
[0063] 在突变体和相关方法的一些方面，破坏的基因是编码I型限制修饰系统的限制性 亚基的内源基因。编码限制性亚基的内源基因的实例包括具有SEQIDN0:7和15中示出 的编码序列的路氏乳杆菌基因，SEQIDN0:7和15分别编码具有SEQIDN0:8和16的氨 基酸序列的亚基。在一些方面，内源基因编码与SEQIDN0:8、SEQIDNO: 16、表4中描绘 的任何限制性亚基的序列、或其成熟多肤序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列 一致性的限制性亚基。在一些方面，内源基因编码具有与SEQIDN0:8、SEQIDNO: 16或表 4中描绘的任何限制性亚基的序列差别不大于十个氨基酸，例如不大于五个氨基酸、不大于 四个氨基酸、不大于H个氨基酸、不大于两个氨基酸、或不大于一个氨基酸的序列的限制性 亚基。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:8或由其组成的限制性亚基。在一些方 面，内源基因编码包括SEQIDN0:8的成熟多肤序列或由其组成的限制性亚基。在一些方 面，内源基因编码包括SEQIDNO: 16或由其组成的限制性亚基。在一些方面，内源基因编 码包括SEQIDNO: 16的成熟多肤序列或由其组成的限制性亚基。
[0064] 在突变体和相关方法的其他方面，编码限制性亚基的内源基因的编码序列与SEQ IDNO: 7、SEQIDNO: 15、编码表4中描绘的限制性亚基的任何基因序列、或其成熟多肤编码 序列具有至少60 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、 至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面，内源基因的编码序 列包括SEQIDN0:7或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDN0:7的 成熟多肤编码序列或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDNO: 15或由 其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDNO: 15的成熟多肤编码序列或由其 组成。
[0065] 在突变体和相关方法的其他方面，在至少低严谨度条件下，中严谨度条件下、 中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下，编码限制性亚基的基因的 编码序列与SEQIDNO: 7、SEQIDNO: 15,或编码表4中描绘的限制性亚基的任何基因序列 的全长互补链杂交。
[0066] 在突变体和相关方法的一些方面，破坏的基因是编码I型限制修饰系统的修饰性 亚基的内源基因。编码修饰性亚基的内源基因的实例包括具有SEQIDNO:9和17中示出的 编码序列的路氏乳杆菌基因，SEQIDN0:9和17分别编码具有SEQIDNO: 10和18的氨基 酸序列的亚基。在一些方面，内源基因编码与SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 18、表4中描绘的 任何修饰性亚基的序列、或其成熟多肤序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一 致性的修饰性亚基。在一些方面，内源基因编码具有与SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 18或表 4中标绘的任何修饰性亚基的序列差别不大于十个氨基酸，例如不大于五个氨基酸、不大于 四个氨基酸、不大于H个氨基酸、不大于两个氨基酸、或不大于一个氨基酸的序列的修饰性 亚基。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDNO: 10或由其组成的修饰性亚基。在一些方 面，内源基因编码包括SEQIDNO: 10的成熟多肤序列或由其组成的修饰性亚基。在一些方 面，内源基因编码包括SEQIDNO: 18或由其组成的修饰性亚基。在一些方面，内源基因编 码包括SEQIDNO: 18的成熟多肤序列或由其组成的修饰性亚基。
[0067] 在突变体或相关方法的其他方面，编码修饰性亚基的内源基因的编码序列与 N0:9、SEQIDNO: 17、编码表4中描绘的修饰性亚基的任何基因序列、或其成熟多肤编码序 列具有至少60 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至 少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面，内源基因的编码序列 包括SEQIDNO:9或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDNO:9的成 熟多肤编码序列或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDNO: 17或由其 组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDNO: 17的成熟多肤编码序列或由其组 成。
[0068] 在突变体或相关方法的其他方面，在至少低严谨度条件下，中严谨度条件下、 中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下，编码修饰性亚基的基因的 编码序列与SEQIDN0:9、SEQIDNO: 17,或编码表4中描绘的编码修饰性亚基的任何基因 序列的全长互补链杂交。
[0069] 在突变体和相关方法的一些方面，破坏的基因是编码非I型限制修饰系统蛋白的 内源基因。如在此使用的非I型限制修饰系统是指不是I型分类的限制修饰系统蛋白（例 如II型、III型、或IV型）。编码非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的实例包括具有SEQ IDNO: 19和21中示出的编码序列的路氏乳杆菌基因，SEQIDNO: 19和21分别编码具有 SEQIDNO: 20和22的氨基酸序列的蛋白。在一些方面，内源基因编码与SEQIDNO: 20、 SEQIDNO:22、或其成熟多肤序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至 少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性的蛋 白。在一些方面，内源基因编码具有与SEQIDNO: 20或SEQIDNO: 22差别不大于十个氨 基酸，例如不大于五个氨基酸、不大于四个氨基酸、不大于H个氨基酸、不大于两个氨基酸、 或不大于一个氨基酸的序列的蛋白。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:20或由其 组成的蛋白。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:22的成熟多肤序列或由其组成的 蛋白。在一些方面，内源基因编码包括SEQIDN0:20或由其组成的蛋白。在一些方面，内 源基因编码包括SEQIDN0:22的成熟多肤序列或由其组成的蛋白。
[0070] 在突变体和相关方法的其他方面，内源基因的编码序列与SEQIDNO: 19、SEQID NO:21、或其成熟多肤编码序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一 些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDNO: 19或由其组成。在一些方面，内源基因的编 码序列包括SEQIDNO: 19的成熟多肤编码序列或由其组成。在一些方面，内源基因的编码 序列包括SEQIDN0:21或由其组成。在一些方面，内源基因的编码序列包括SEQIDN0:21 的成熟多肤编码序列或由其组成。
[0071] 在突变体和相关方法的其他方面，在至少低严谨度条件下，中严谨度条件下、 中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下，编码非I型限制修饰系统 蛋白的基因的编码序列与SEQIDNO: 19或SEQIDN0:21的全长互补链杂交。
[0072] 在此披露的多核巧酸序列，或其子序列；连同在此描述的氨基酸序列，或其片段； 可W根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针W鉴定和克隆来自不同属或种的菌株的、I 型限制修饰系统的同源亚基。具体而言，可W根据标准DNA印迹程序，使用该样的探针与来 自感兴趣的乳杆菌物种的DNA杂交，W便鉴定和分离其中的对应基因。该样的探针可W大 大短于整个序列，例如长度至少为14个核巧酸，至少25个核巧酸、至少35个核巧酸、至少 70个核巧酸。该些探针可W更长，例如长度至少为100个核巧酸，至少200个核巧酸、至少 300个核巧酸、至少400个核巧酸、至少500个核巧酸。可W使用甚至更长的探针，例如长度 至少为600个核巧酸，至少700个核巧酸、至少800个核巧酸、至少900个核巧酸。DNA和 RNA探针该二者都可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因（例如，用3中、巧、 35S、生物素或抗生物素蛋白）。
[0073] 可W针对与W上描述的探针杂交的DNA，来筛选由该样的其他菌株制备的DNA文 库。来自该类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可W通过琼脂糖或聚丙帰醜胺凝胶电泳， 或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其 他适合的载体材料上。为鉴定与在此描述的多核巧酸序列或其子序列同源的克隆或DNA，可 W在DNA印迹法中使用载体材料。对W上描述的探针的目的，杂交是指，在非常低至非常高 的严谨度下，多核巧酸杂交至与该些多核巧酸序列或其全长互补链、或W上项的子序列对 应的标记核酸探针上。在该些条件下，核酸探针杂交的分子可W使用例如X射线胶片而进 行检测。
[0074] 对于长度为至少100个核巧酸的长探针而言，非常低至非常高严谨度条件定义为 最佳地按照标准DNA印迹程序，在42C下在5XSSPE、0. 3 %SDS、200微克/mL剪切并变性 的娃鱼精子DNA中，W及对于非常低和低严谨度在25 %甲醜胺中，对于中和中-高严谨度在 35%甲醜胺中，或对于高和非常高严谨度在50%甲醜胺中预杂交和杂交12至24小时。将 载体材料最终使用2XSSC、0. 2%SDS在45C(非常低严谨度）、在5(TC(低严谨度）、在 55C(中严谨度）、在6(TC(中-高严谨度）、在65C(高严谨度）、W及在7(TC(非常高 严谨度）洗涂H次，每次持续15分钟。
[0075] 对于长度为约15个核巧酸至约70个核巧酸的短的探针而言，严谨度条件被定义 为最佳地按照标准DNA印迹程序，在比使用根据Bolton(博尔顿）和McCarthy(麦卡锡） (Proc.化tl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊）1962, 48, 1390)的计算而计算的Tm低约 5°C至约 10°C下，在0. 9MNaCl、0. 09MTris-肥UpH7. 6)、6mM邸TA、0. 5%NP-40、1X登哈特 氏溶液值enhar化'Ssolution)、ImM焦磯酸轴、ImM磯酸二氨轴、0.ImMATP、W及0. 2mg的 酵母RNA/mL中预杂交和杂交12至24小时。最后将载体材料在计算的TmW下5C至IOC， 在6XSCC加0. 1 %SDS中洗涂1次持续15分钟并且使用6XSSC洗涂2次，每次15分钟。
[0076] 来自不同属或种的菌株的在此描述的I型限制修饰系统亚基的同系物一般具有 是次要性质的氨基酸变化，即并不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插 入；典型地具有一个至约30个氨基酸的小删除；小氨基末端或駿基-末端延伸，例如一种 氨基-末端甲硫氨酸残基；具有至多约20-25个残基的一种小连接肤；或通过改变净电荷 促进纯化或另一种功能的一种小延伸，例如一种聚组氨酸段、一种抗原表位或一种结合结 构域。
[0077] 保守取代的实例处于W下组内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸W及组氨酸）、酸性 氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨醜胺和天冬醜胺）、疏水性氨基酸（亮氨 酸、异亮氨酸W及额氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸W及酪氨酸）、W及小氨基酸 (甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸W及甲硫氨酸）。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取 代是本领域已知的，并且例如由H.NeuratMH.诺伊拉特）和R.L化11化L希尔）1979年 描述于化eProteins(蛋白质）中，AcademicPress(学术出版社），纽约。最常发生的交 换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、!'虹/Ser、Ala/Gly、AlaA虹、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、 Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
[0078] 可W根据本领域已知的程序来鉴定必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱 变（Cunnin曲am(坎宁安）和Wells(威尔斯），Science(科学）1989,244, 1081-1085)。 在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的 活性W鉴定对该分子的活性关键的氨基酸残基。还参看Hilton(希尔顿）等人，J.Biol. 化em(生物化学杂志）1996, 271，4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通 过W下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学 分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参看例如deVos(德沃斯）等人， Science(科学）1992, 255, 306-312;Smith(史密斯）等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂 志）1992, 224, 899-904;Wlodaver(沃尔达韦尔）等人，阳BSLett.(欧洲生物化学学会联 盟通讯）（阳BSLett.) 1992, 309, 59-64。还可W从与其他相关酶的一致性分析来推断必需 氨基酸的一致性。
[0079] 使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可W 做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该些相关的筛选程 序例如由Rei化aar(里德哈尔）-Olson(奧尔森）和Sauer(萨奧尔），Science(科 学）1988, 241，53-57;Bowie(博维）和Sauer(萨奧尔），Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.(美 国国家科学院院刊）1989, 86, 2152-2156 ;W0 95/17413;或WO95/22625披露的那些。可W 使用的其他方法包括：易错PCR、瞻菌体展示（例如，Lowman(洛曼）等人，Biochemistry(生 物化学）1991，30, 10832-10837 ;美国专利号 5, 223, 409 ;W0 92/06204)，W及区域定向 诱变值erbyshire(德比希尔）等人，Gene(基因）1986, 46, 145;Ner(内尔）等人，DNA 1988, 7, 127)。
[0080] 可W结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达 的克隆的、诱变的多肤的活性（Ness(内斯）等人，化化reBiotechnol.(自然生物技 术）1999, 17, 893-896)。可W使用本领域的标准方法，从宿主细胞回收编码活性酶的诱变 的DNA分子，并且对其进行迅速测序。该些方法允许迅速确定多肤中单个氨基酸残基的重 要性。
[0081]I型限制修饰系统亚基基因的破坏和产生乳杆菌突变体的方法
[0082] 可W通过使用本领域已知的方法（包括在此描述的那些方法）破坏编码I型限制 修饰系统亚基的参比基因，来构建在此描述的乳杆菌突变株。可W破坏基因的一部分，例如 编码区或表达编码区所需的控制序列。该样的控制序列可W是启动子序列或其功能部分， 即足W影响该基因的表达的部分。例如，可W使启动子序列灭活，导致没有表达，或者可W 用更弱启动子取代天然启动子序列来减少编码序列的表达。用于可能的修饰的其他控制序 列包括但不局限于前导子、前肤序列、信号序列、转录终止子、和转录激活因子。
[0083] 可W通过基因删除技术来构建乳杆菌突变株，W消除或减少基因表达。基因删除 技术使得能够部分或完全除去基因，由此消除它们的表达。在该样的方法中，通过使用已经 被构建为连续地包含侧翼于该基因的5'和3'区域的质粒，用同源重组来完成基因的删除。
[0084] 还可W通过引入、取代、和/或除去该基因或其转录或翻译所需的它的控制序列 中的一个或多个（若干个）核巧酸，来构建乳杆菌突变株。例如，可W插入或除去核巧酸， 用于终止密码子的引入、起始密码子的除去、或开放读码框的框移。该样一个修饰可W根 据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。参见例如Botstein(博特 斯坦）和Siortle(肖特尔），Science(科学）I985, 229, 4了19;Lo(卢）等人，Proc.化tl. Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院院刊）1985,81, 2285;Higuchi(極口）等人，Nucleic AcidsRes(核酸研究）1988, 16,7351 ;Shimada(岛田），Meth.Mol.Biol.(分子生物学方 法）1996, 57, 157;Ho(何）等人，Gene(基因）1989, 77, 61 ;Hoi~ton(霍顿）等人，，Gene(基 因）I989, 77,Gl;W及Sarkar(萨卡尔）和Sommer(索姆），BioTechniques(生物技 术）1990,8, 404。
[0085] 还可W通过将一个破坏的核酸构件体插入该基因，用基因破坏技术构建乳杆菌突 变株，该一破坏的核酸构建体包含与将产生同源区的复制并且合并该些复制的区域之间的 构建体DNA的基因同源的核酸片段。如果插入的构建体将该基因的启动子与编码区分开或 中断编码序列，该样使得非功能基因产物生成，则该样一个基因破坏可W消除基因表达。破 坏构建体可W简单地是伴随与该基因同源的5'和3'区域的一个选择性标记基因。选择性 标记使得能够鉴定包含破坏的基因的转化体。
[0086] 还可W通过基因转换的过程，构建乳杆菌突变株（参见例如Iglesias(伊格莱西 亚斯）和Trautner(特劳特纳），MolecularGeneralGenetics(分子遗传学和普通遗传 学）1983, 189, 73-76)。例如，在基因转化方法中，将对应于该基因的核巧酸序列在体外进行 诱变W产生缺陷的核巧酸序列，然后将其转化到亲本乳杆菌菌株中W产生缺陷基因。通过 同源重组，该缺陷的核巧酸序列替换内源基因。希望的是该缺陷的核巧酸序列还包括用于 选择包含该缺陷基因的转化体的标记。
[0087] 还可W使用与该基因的核巧酸序列互补的核巧酸序列，用建立的反义技术构建乳 杆菌突变株（Parish(帕里什）和Stoker(斯巧克），FEMSMicrobiol.Lett.(欧洲微生物 学会联合会微生物学快报）1997, 154, 151-157)。更确切，用乳杆菌突变株的该基因的表达 可W通过引入与该基因的核巧酸序列互补的核巧酸序列来减少或灭活，其中该核巧酸序列 可在菌株中转录并能与菌株中所产生的mRNA发生杂交。在允许互补的反义核巧酸序列与 mRNA发生杂交的条件下，所翻译蛋白的量由此降低或消除。
[0088] 还可W通过建立的RNA干扰（RNAU技术构建乳杆菌突变株（参见例如WO 2005/056772 和WO2008/080017)。
[0089] 可W通过使用本领域熟知的方法的随机诱变或专一诱变进一步构建乳杆菌突变 株，该些诱变包括但不局限于化学诱变（参见例如化pwood(霍普伍德），化eIsolationOf MutantsinMethodsinMicrobiology(微生物学方法中突变体的分离）（J.R.Norris(诺 里斯）和D.W.I^itibons(里邦斯）编辑）363-433页,AcademicPress(学术出版社），纽约， 1970)。该基因的修饰可W通过使亲本菌株经受诱变，并且筛选该基因的表达已经被减少或 灭活的突变株来进行。诱变可W是专一的或随机的，可W例如通过使用适合的物理或化学 诱变剂、通过使用适合的寡核巧酸、或通过使DNA序列经PCR产生的诱变来进行。此外，诱 变可W通过使用该些诱变方法的任意组合来进行。
[0090] 适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线扣V)照射，轻胺，N-甲 基-N'-硝基-N-亚硝基脈（MNNG)，N-甲基-N'-亚硝基脈（NTG)，邻甲基轻胺，亚硝酸，己 基甲賴酸（EM巧，亚硫酸氨轴，甲酸和核巧酸类似物。当使用该样的试剂时，诱变典型地是在 适合条件下在所选的诱变处理试剂的存在下通过赔育有待诱变的亲本菌株并选择展示基 因表达减少或不表达的突变体来进行的。
[0091] 可W使用来自其他微生物来源的与在此描述的基因同源或互补的核巧酸序列来 破坏所选的乳杆菌菌株中的相应的基因。
[0092] 在一个方面，乳杆菌突变体中基因的修饰未用选择性标记进行标记。可W通过在 反选择培养基上培养该些突变体来完成选择性标记基因的除去。在选择性标记基因包含侧 翼于其5'和3'端的重复的情况下，当突变株经受反选择时，该些重复将通过同源重组促进 选择性标记基因的环出。还可W通过将一个核酸片段（该核酸片段包括缺陷基因的5'和 3'区域，但是缺乏选择性标记基因）引入该突变株，随后在反选择培养基上进行选择，用同 源重组除去选择性标记基因。通过同源重组，包含选择性标记基因的缺陷基因被替换为缺 乏选择性标记基因的核酸片段。也可使用本领域已知的其他方法。
[0093] 还描述的是产生在此描述的乳杆菌突变体的方法。在一个方面，描述的是用于获 得在此描述的乳杆菌突变体的方法，该方法包括在亲本乳杆菌菌株中，破坏编码I型限制 修饰系统亚基的内源基因。在另一方面，描述的是用于获得在此描述的乳杆菌突变体的方 法，该方法包括；(a)培养亲本乳杆菌菌株；(a)在（a)的亲本乳杆菌菌株中，破坏编码I型 限制修饰系统亚基的内源基因；W及（C)分离生成自化）的突变株。
[0094] 转化的DNA和相关方法
[0095] 对于产生乳杆菌转化体，在此描述的乳杆菌突变体是有用的。在一个方面，描述 的是获得乳杆菌转化体的方法，该方法包括将异源多核巧酸转化进在此描述的乳杆菌突变 体。在另一方面，描述的是获得乳杆菌转化体的方法，该方法包括；(a)培养在此描述的乳 杆菌突变体；化）将异源多核巧酸转化进（a)的乳杆菌突变体；W及（C)分离生成自化）的 转化体菌株。
[0096] 在此描述的转化的DNA可W是任何感兴趣的DNA。DNA可W是基因组来源的、CDNA 来源的、半合成来源的，合成来源的、或它们的任何组合。DNA可W是编码具有感兴趣的生物 活性的任何多肤的异源多核巧酸或可W是在具有生物活性的多肤的表达中涉及的DNA，例 如启动子。
[0097] 具有生物活性的多肤可W是任何感兴趣的多肤。多肤对于感兴趣的乳杆菌宿主细 胞而言可W是原生的或外源的。多肤可W是下述多肤和杂合多肤的天然发生的等位基因变 体和基因工程变体。
[009引术语"多肤"在此并非指特定长度的编码产物，因此涵盖肤、寡肤和蛋白。术语"多 肤"还涵盖杂合多肤，其包含获得自至少两种不同多肤的部分的或完整的多肤序列的组合， 其中一种或多种对于乳杆菌细胞而言可W是外源的。多肤还包括多肤的天然出现的等位变 体和工程化变体。
[0099] 在一个方面，多肤是抗体、抗原、抗微生物肤、酶、生长因子、激素、免疫放大介质 (immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白W及转录因子。
[0100] 在另一方面，多肤是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或者连接酶。 在一个最优选的方面，多肤是a-葡糖巧酶，氨肤酶，淀粉酶，碳水化物酶，駿肤酶，过氧化 氨酶，纤维素酶，几下质酶，角质酶（CUtinase)，环糊精糖基转移酶，脱氧核糖核酸酶，醋 酶，a-半乳糖巧酶，目-半乳糖巧酶，葡糖淀粉酶，葡糖脑巧脂酶，a-葡糖巧酶，目-葡 萄巧酶，转化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖巧酶，变聚糖酶（mutanase)，氧化酶，果胶分解酶 (pectinolyticenzyme)，过氧化物酶，磯脂酶，肌醇六磯酸酶，多酷氧化酶，蛋白水解酶，核 糖核酸酶，谷氨醜胺转移酶，尿激酶，或木聚糖酶。
[0101] 在另一个方面，多肤是白蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白原、弹性蛋白或明胶。
[0102] 在另一方面，多肤是杂合多肤，其包含获得自至少两种不同多肤的部分的或完整 的多肤序列的组合，其中一种或多种对于乳杆菌宿主细胞而言可W是外源的。
[0103] 在另一方面，多肤是融合多肤，其中另一多肤融合在该多肤或其片断的N-末端或 C-末端。通过将编码一种多肤的核巧酸序列（或其一部分）融合于编码另一种多肤的核巧 酸序列（或其一部分）来生产融合多肤。产生融合多肤的技术是本领域中已知的，并且包 含连接编码多肤的编码序列，W使得它们同框，并且融合多肤的表达受到相同的一种或多 种启动子和终止子的控制。
[0104]编码感兴趣的多肤的异源多核巧酸可W获得自任何原核的、真核的、或其他来源。 出于本发明的目的，如在此使用，术语"获得自"与给定来源一起使用时应指该多肤是由该 来源或由其中已经插入了来自该来源的基因的细胞产生的。
[0105] 用于分离或克隆编码感兴趣的多肤的异源多核巧酸的技术是本领域已知的并且 包括从基因组DNA分离，从CDNA制备，或其组合。自此类基因组DNA克隆感兴趣的DNA可 W通过例如使用熟知的聚合酶链式反应（PCR)来实现。参见，例如，Innis(英尼斯）等人， PCRProtocols=AGuidetoMethodsandApplication(PCR实验方案：方法和应用的指 南），AcademicPress(学术出版社），纽约，1990。克隆程序可W涉及切除和分离包含编码 多肤的核酸序列的希望的核酸片段，将该片段插入载体分子，并将该重组载体惨入乳杆菌 突变体，其中将会复制多个拷贝或克隆的该核酸序列。DNA可W是基因组来源的、CDNA来源 的、RNA来源的、半合成来源的，合成来源的、或它们的任何组合。
[0106] 可W按多种方式操作编码感兴趣的多肤的异源多核巧酸，W提供该多肤在突变乳 杆菌菌株中的表达。取决于表达载体，在其插入载体W前操作多核巧酸序列可W是希望的 或必需的。利用重组DNA方法修飾核巧酸序列的技术是本领域熟知的。
[0107] 可W将包含编码多肤的多核巧酸的核酸构建体可操作地连接至一个或多个（若 干个）控制序列，在与该些控制序列相容的条件下，该些控制序列能够指导突变乳杆菌菌 株中编码序列的表达。
[010引控制序列可W是适当的启动子序列、由本发明的突变乳杆菌菌株识别的核巧酸序 列，用于表达编码该多肤的多核巧酸。启动子序列包含介导多肤表达的转录控制序列。该 启动子可W是在突变乳杆菌菌株中示出转录活性的任何核巧酸序列，包括突变型、截短型 及杂合型启动子，并且可W获得自编码与该突变乳杆菌菌株原生抑或外源的细胞外或细胞 内多肤的基因。
[0109]在突变乳杆菌菌株中，适合指导核酸构建体转录的启动子的实例是获得自W下 各项的启动子：解淀粉芽抱杆菌a-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽抱杆菌a-淀粉酶基因 (amyL)、地衣芽抱杆菌青霉素酶基因（pen巧、嗜热脂肪芽抱杆菌麦芽淀粉酶基因（amyM)、 枯草芽抱杆菌果聚糖藏糖酶基因（sacB)、枯草芽抱杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌Iac 操作子、大肠杆菌trc启动子巧gon(埃贡）等人，Gene(基因）1988, 69, 301-315)，天蓝 色链霉菌琼脂酶基因（dagA)、和原核目-内醜胺酶基因（Villa(维拉）-Kamaroff(卡 玛诺夫）等人，Proc.化tl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊）1978, 75, 3727-3731)， 连同tac启动子值eBoer(德波尔）等人，Proc.化tl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院 院刊）1983, 80,21-25)。另外的启动子描述于佑Hbed(吉尔伯特）等人，Scientific American(科学美国人）1980, 242, 74-94)中的"来自重组细菌的有用蛋白扣Se化1 proteinsfromrecombinantbacteria)";W及Sambrook(萨姆布鲁克）等人，1989,同上 中。
[0110] 控制序列也可W是适合的转录终止子序列，由突变乳杆菌菌株识别的序列，W终 止转录。该终止子序列可操作地连接至编码该异源多肤的核巧酸序列的3'末端。可W使 用在乳杆菌菌株中具有功能的任何终止子。
[0111] 控制序列也可W是适合的前导子序列，对突变乳杆菌菌株翻译重要的mRNA的非 翻译区。该前导子序列可操作地连接至编码该异源多肤的核巧酸序列的5'末端。可W使 用在突变乳杆菌菌株中具有功能的任何前导子序列。
[0112] 控制序列也可W是信号肤编码序列，该编码序列编码与多肤氨基末端相连的氨基 酸序列，并且指导编码的多肤进入细胞的分泌通路。核巧酸序列的编码序列的5'端可W固 有地包含信号肤编码序列，该信号肤编码序列在翻译读码框中与编码分泌的多肤的编码序 列天然连接。可替代地，编码序列的5'端可W包含对编码序列是外源的信号肤编码序列。 在编码序列不天然地包含信号肤编码序列的情况下，可能需要外源信号肤编码序列。可替 代地，外源信号肤编码序列可W单纯地替代天然信号肤编码序列W便增强多肤的分泌。然 而，将表达的多肤引入突变乳杆菌菌株的分泌通路（即分泌进入培养基）的任何信号肤编 码序列可W用于本发明。
[0113] 包含核巧酸序列、启动子、W及转录和翻译停止信号的重组表达载体可W用于重 组产生感兴趣的多肤。可W将在此描述的不同核酸和控制序列连接起来W产生重组表达载 体，该重组表达载体可包括一个或多个（例如两个、若干个）方便的限制位点，来允许在该 些位点插入或取代编码多肤的核巧酸序列。可替代地，可W通过将核巧酸序列或包含该序 列的核酸构建体插入用于表达的适当的表达载体，来表达核巧酸序列。在产生表达载体时， 编码序列是位于该载体中，W使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0114] 重组表达载体可W是可便利地经受重组DNA程序并且可引起核巧酸序列表达的 任何载体（例如，质粒或病毒）。载体的选择将典型地取决于它与有待引入该载体的突变乳 杆菌菌株的相容性。该载体可W是一种线性的或闭合的环状质粒。
[0115] 该载体可W是一种自主复制载体，即，作为一种染色体外实体存在的一种载体，该 载体的复制独立于染色体复制，例如一种质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。 该载体可W包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可W是该样一种载体，当 它被引入突变乳杆菌菌株中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染 色体一起复制。此外，可W使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒（该些载体或 质粒共同包含有待引入到突变乳杆菌菌株的基因组中的总DNA)、或转座子。
[0116] 该载体可W包含一个或多个（例如两个、若干个）选择性标记，该些选择性标记允 许容易选择转化的突变乳杆菌菌株。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物 剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
[0117] 用于在突变乳杆菌菌株中使用的选择性标记的实例包括但不局限于来自枯草芽 抱杆菌或地衣芽抱杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性（例如氨予青霉素、氯霉素、卡那霉 素、或四环素抗性）的标记。酵母宿主细胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、W及URA3。
[0118] 该些载体可W包含允许载体整合到乳杆菌基因组中或者允许载体在细胞中独立 于基因组自主复制的一个或多个（例如两个、若干个）元件。
[0119] 对于整合到突变乳杆菌菌株的基因组中，该载体可W依靠编码感兴趣的多肤的 多核巧酸的序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他 元件。可替代地，载体可包含另外的核巧酸序列用于指导通过同源重组在一个或多个染 色体中的一个或多个确定位置整合进入突变乳杆菌菌株基因组中。为了增加在精确位置 处整合的可能性，整合元件应优选包含足够数目的核酸，例如如100-1，500碱基对、优选 400-1，500碱基对和最优选800-1，500碱基对，其与相应的祀序列具有高的一致性程度W 增强同源重组的概率。该些整合元件可W是与突变乳杆菌菌株的基因组中的祀序列同源的 任何序列。此外，整合元件可W是非编码的或编码的核巧酸序列。另一方面，该载体可W通 过非同源重组整合到突变乳杆菌菌株的基因组中。
[0120] 对于自主复制，载体可W进一步包含使该载体能够在突变乳杆菌菌株中自主复 制的复制起点。复制起点可W是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术 语"复制起点"或"质粒复制子"在此定义为使质粒或载体能够在体内复制的核巧酸序列。 在突变乳杆菌菌株中有用的细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质 粒地R322、PUC19、PACYC177、W及PACYC184W及允许在芽抱杆菌内进行复制的pUBllO、 口6194、9了41060、^及941目1的复制起点。
[0121] 用于连接在此描述的元件来构建重组表达载体的程序是本领域普通技术人员熟 知的（参见例如J.Sambrook(萨姆布鲁克），E.F.化itsch(弗里奇），和T.Mania化S(曼尼 亚特斯），1989,MolecularCloning,AL油oratoryManual(分子克隆实验指南），第二版， 冷泉港，纽约）。
[0122] 该DNA还可W是控制序列，例如启动子，用于操作感兴趣的基因的表达。W上描述 了控制序列的非限制性实例。
[0123] 该DNA可W进一步是用于在乳杆菌细胞中灭活感兴趣的基因的核酸构建体。
[0124] 该DNA不局限于W上披露的特定实例的范围，因为该些实例旨在作为本发明若干 方面的说明。
[01巧]可W使用本领域已知的技术，例如，如在W下实例部分中描述的电穿孔，进行该DNA进入突变乳杆菌菌株的转化。
[0126] 可W使用本领域熟知的标准技术，该些技术包括但不局限于划线平板分离、在富 集培养基或选择培养基中生长、温度生长选择、过滤、或单细胞分离技术（例如流式细胞术 和微流体技术），来分离在此描述的转化体。
[0127] 在此描述的乳杆菌突变体的一些方面中，在转化后修复了对编码I型限制修饰系 统亚基的内源基因的破坏。I型限制修饰系统亚基基因的修复使对于识别和降解会是例如 细胞稳定性的有害物的外源DNA而言是重要的天然保护系统得到恢复。如在此使用，"修复 对I型限制修饰系统亚基基因的破坏"是指增加破坏的基因的表达，和/或增加由该一破坏 的基因编码的多肤的活性。可W使用本领域已知的技术，连同在此描述的那些，例如用于直 接修饰破坏的基因的技术（例如将破坏的基因反转回它的原生基因序列），和/或用于将功 能基因转化进入乳杆菌宿主的技术（例如宿主基因组中在不同基因座的基因的整合），进 行由该基因编码的多肤的增加的基因表达和增加的活性。因此，在一个方面，获得在此描述 的乳杆菌转化体的方法进一步包括修复对编码I型限制修饰系统亚基的内源基因的破坏。 [012引产生多肤和发酵产物的方法
[0129]名fi太
[0130] 如W上提到，在此描述的乳杆菌突变体可W增加在产生乳杆菌转化体方面的效 率，该些乳杆菌转化体例如在产生具有生物活性的多肤方面是有用的。因此，在一个方面， 产生具有生物活性的多肤的方法包括；(a)在有助于产生该多肤的条件下，培养用编码该 多肤的异源多核巧酸转化的乳杆菌宿主细胞，其中该乳杆菌宿主细胞是在此描述的乳杆菌 突变体（例如包含对编码I型限制修饰系统亚基的内源基因的破坏的乳杆菌突变体） 及（b)回收该多肤。
[0131] 在另一方面，描述的是产生多肤的方法，该方法包括；(a)培养在此描述的乳杆菌 转化体（例如用编码该多肤的异源多核巧酸转化的在此描述的乳杆菌突变体）；W及化） 回收该多肤。
[0132] 该些感受态乳杆菌宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肤的 一种营养培养基中培养的。例如，可W通过摇瓶培养，在实验室或工业发酵罐中于适合的培 养基中并且在允许感兴趣的多肤表达和/或分离的条件下进行小规模或大规模发酵（包括 连续、分批、补料分批或固态发酵）培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种 适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合培养基是自商业供应商 可获得的，或可W根据公开的组成（例如，美国典型培养物保藏中也的目录中）来制备。感 兴趣的分泌物质，例如多肤或发酵产物，可W直接回收自培养基。
[0133] 可W使用本领域已知的、对于该物质是特异性的方法来检测具有生物活性的多 肤。该些检测方法可W包括特异性抗体的使用、高效液相层析、毛细管层析、酶产物的形 成、酶底物的消失、或SDS-PA(iE。例如，酶试验可用来确定具有酶活性的多肤的活性。确 定酶活性的方法在本领域中对许多酶都是已知的（参见，例如，D.Schomburg(施姆堡）和 M.Salzmann(萨尔兹曼；）（编辑），Enzyme化nclbook(酶手册），SpringerVerlag(施普林 格出版公司），纽约，1990)。
[0134] 可W通过本领域已知的方法分离具有生物活性的生成的多肤。例如，感兴趣的多 肤可W用常规程序从培养基中分离，常该些规程序包括但不局限于离也，过滤，提取，喷雾 干燥，蒸发，或沉淀。分离的多肤可进一步用本领域已知的多种程序纯化，该些程序包括但 不局限于层析（例如离子交换层析，亲和层析，疏水层析，聚焦层析、W及大小排阻层析）， 电泳程序（例如制备级等点聚焦电泳（IEF))，溶解度差异（例如硫酸按沉淀），或提取（参 见例如，Protein化rification(蛋白纯化），J. -C.Janson(詹森）和LarsRyden(拉尔斯 赖登），编辑，VCH化Wishers(VCH出版社），纽约，1989)。 。"引 发酵产物
[0136] 在此描述的乳杆菌突变体可W用于代谢工程，例如用于产生发酵产物。增加的突 变体的转化效率可W提供超过现存宿主的使用乳杆菌的工具，并且可W允许针对现存的和 新的代谢通路的过表达异源基因的迅速筛选。
[0137]"发酵"或"发酵过程"是指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵过程 还包括用于消费性醇工业（例如啤酒和酒）、乳品工业（例如发酵乳制品）、皮革工业、烟草 工业、和精细化学工业或散装化学工业的发酵过程。
[013引在一个方面，描述的是产生发酵产物的方法，该方法包括；(a)在有助于产生发酵 产物的条件下，培养在此描述的乳杆菌转化体（例如用编码发酵通路的一种或多种多肤的 一种或多种异源多核巧酸转化的在此描述的乳杆菌突变体）；W及化）回收发酵产物。
[0139] 乳杆菌转化体可W是用一个或多个异源发酵通路基因转化的在此描述的任 何乳杆菌突变体，导致增加产生希望的发酵产物。用于多种希望的发酵产物的发酵的 代谢通路基因和相应的工程化转化体是本领域已知的，例如产生异丙醇和正丙醇（WO 2012/058603)、3-轻基丙酸（WO2005/118719)、苹果酸（WO2011/028643)、1，4-下二 醇（W02008/115840)、l, 3-下二醇（WO2010/127319)、2-下醇（W02010/144746)、THF(W0 2010/141920)、己内醜胺（WO2010129936)、己撑二胺（WO2010129936)、己醜丙酸（WO 2010129936)、2/3-轻基异下酸（WO2009/135074)、甲基丙帰酸（WO2009/135074)、己二酸 (WO2009/151728)、下二帰（WO2011/140171)、粘康酸盐（醋）（W02011/017560)和 4-轻基 下酵（WO2011/047101)(该些申请的内容通过引用结合在此）。在此描述的乳杆菌突变体 可W提供用来进一步改进W上参考文献中发酵产物生产的工具。
[0140] 可W在包含任何一种或多种（例如，两种、若干种）糖的可发酵培养基中进行用 于产生发酵产物的方法，该些糖是例如葡萄糖、果糖、藏糖、纤维二糖、木糖、木丽糖、阿拉伯 糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶的低聚糖。在一些情况下，该种发酵培养基源自天然来源， 例如甘藏、淀粉、或纤维素；并且可W来自该种来源的酶水解（糖化作用）的预处理。
[0141] 除了来自一种或多种（例如，两种、若干种）糖的适当的碳源之外，该可发酵的培 养基可W包含本领域普通技术人员已知的其他营养素或刺激物，例如大量营养素（如，氮 源）W及微量营养素（如，维生素、矿物盐、W及金属辅因子）。在一些方面中，碳源优先地 可W补充有至少一种碳源，例如酵母提取物、N2、蛋白腺（例如，Bacto?蛋白腺）、或大豆蛋 白腺（例如，Bacto?大豆蛋白腺）。维生素的非限制性实例包括多种维生素、生物素、泛酸 盐、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、化唆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、W及维生素A、维生素 B、维生素C、维生素D、W及维生素E。矿物盐和金属辅因子的实例包括，但不局限于，化、P、 K、Mg、S、Ca、化、ZruMruW及化。
[0142] 典型地将发酵微生物添加至发酵培养基，并且进行发酵，持续约8至约96小时，例 如约24至约60小时。温度典型地在约26C至约6(TC之间，例如约32C或50。并且抑 为约抑3至约抑8,例如抑4-5、6、或7。
[0143] 视情况而定，可W在厌氧、基本上厌氧（微好氧）、或好氧条件下进行培养。简言 之，厌氧的是指一种缺少氧气的环境，基本上厌氧的（微好氧的）是指一种其中氧气的浓 度比空气低的环境，并且好氧是指一种其中氧气浓度大致等于或大于空气的氧气浓度的环 境。基本上厌氧条件包括例如使得在培养基中的溶氧浓度保持在小于10%的饱和度的培 养、分批发酵或连续发酵。基本上厌氧条件还包括使细胞在维持有小于1 %氧气的气氛的密 封室内的液体培养基中或固体琼脂上生长或静止。例如可W通过向培养物鼓吹N2/C02混合 物或其他一种或多种适合的非氧气体来维持氧气的百分比。在一些实施例中，在厌氧条件 或基本上厌氧条件下进行培养。
[0144]用于产生发酵产物的方法可W采用任何适合的发酵操作模式。例如，分批模式发 酵可W与一个封闭系统一起使用，其中培养基和宿主微生物（在发酵的开始设置的）除了 试剂（某些例如用于抑控制、泡沫控制或过程支持所需的其他试剂）之外，没有另外的投 入。在此描述的过程还可W在补料分批模式或连续模式中利用。
[0145] 可W在若干生物反应器构型中实践用于产生发酵产物的方法，该些生物反应器构 型例如是揽拌槽、鼓泡培、气升式反应器W及本领域普通技术人员已知的其他反应器。视情 况而定，能W游离细胞培养或固定化细胞培养的方式执行该些方法。可W使用任何用于支 持固定化细胞培养的材料，例如藻酸盐、纤维床、或菱形材料，例如温石棉、蒙脱石KSF和蒙 脱石K-IO。
[0146] 发酵产物可W是源自发酵的任何物质。发酵产物可W是而不局限于：醇（例如， 阿拉伯糖醇、正下醇、异下醇、己醇、甘油、甲醇、己二醇、1，3-丙二醇（丙二醇）、下二醇、丙 H醇、山梨糖醇、W及木糖醇）；焼姪（例如戊焼、己焼、庚焼、辛焼、壬焼、癸焼、十一焼、W及 十二焼）巧焼姪（例如，环戊焼、环己焼、环庚焼、W及环辛焼）；帰姪（例如，戊帰、己帰、 庚帰、W及辛帰）；氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、W及苏氨酸）； 气体（例如，甲焼、氨气化2)、二氧化碳（C02)、W及一氧化碳（CO));异戊二帰；丽（例如， 丙丽）；有机酸（例如，己酸、醋丽酸、己二酸、抗坏血酸、巧樣酸、2, 5-二丽-D-葡糖酸、甲 酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖酵酸、戊二酸、3-轻基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二 酸、草酸、草醜己酸、丙酸、玻巧酸、W及木糖酸）及聚丽化合物。发酵产物还可W是作为 高价值产物的蛋白。
[0147] 在一个方面，发酵产物是一种醇。将理解，术语"醇"涵盖含有一个或多个轻基部 分的物质。醇可W是任何醇，包括而不局限于；丙醇、正下醇、异下醇、异下醇、己醇、甲醇、 阿拉伯糖醇、下二醇、己二醇、甘油（glycerin)、丙H醇（glycerol)、1, 3-丙二醇、山梨糖 醇、或木糖醇。参见例如，Gong(宫）等人，1999，Ethanolproductionfromrenew油Ie resources(由可再生资源生产己酉享），inAdvancesinBiochemicalEngineering/ Biotechnology(在生化工程/生物技术进展中），Sch巧er,T.(斯卡皮尔），编辑， Springer-Verlag(施普林格出版社）柏林海德堡，德国，65:207-241 ;Silveira(西尔维 拉）M.M.,和Jonas(乔纳斯），R.,Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物学与生物技 术）2002, 59:400-408 ;Nigam,P.(尼加姆）和Sin曲,D.(辛格），ProcessBiochemistry(加 工生物化学）199530:117-124 ;Ezeji(埃塞吉）等人,WorldJournalofMicrobiologyand Biotechnology(微生物与生物技术世界杂志）200319:595-603。
[014引在一个方面，发酵产物是丙醇，例如异丙醇和/或正丙醇（参见WO2012/058603， 其内容通过引用结合在此）。
[0149] 在另一方面，发酵产物是一种焼姪。焼姪可W是任何无支链的或支链的焼姪，包括 而不局限于；戊焼、己焼、庚焼、辛焼、壬焼、癸焼、十一焼、或十二焼。
[0150] 在另一个方面，发酵产物是一种环焼，例如环戊焼、环己焼、环庚焼、或环辛焼。
[0151] 在另一方面，发酵产物是一种帰姪。帰姪可W是任何无支链的或支链的帰姪，包括 而不局限于；戊帰、己帰、庚帰、或辛帰。
[0152] 在另一方面，发酵产物是一种氨基酸。氨基酸可W是任何氨基酸，包括而不局 限于；天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见例如化chard,A.(理 查德），和Margaritis,A.(马加里蒂斯），Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工 程）2004,87,501-515。
[0153] 在另一个优选方面，发酵产物是一种气体。气体可W是任何气体，包括而不 局限于：甲焼、馬、C〇2、或C0。参见例如Kataoka(片冈）等人，WaterScienceand Technology(水科学和技术）1997, 36, 41-47 ;W及GunaseelanV.N.(古那森兰），Biomass andBioenergy(生物质和生物能），1997, 13, 83-114。
[0154] 在另一方面，发酵产物是异戊二帰。
[0巧5] 在另一方面，发酵产物是一种丽。应理解的是，术语"丽"涵盖包含一个或多个丽 部分的物质。在一个方面，该丽是丙丽。
[0156] 在另一方面，发酵产物是有机酸。有机酸可W是任何有机酸，包括而不局限于；己 酸、醋丽酸（acetonicacid)、己二酸、抗坏血酸、巧樣酸、2, 5-二丽-D-葡糖酸、甲酸、富马 酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖酵酸、戊二酸、3-轻基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、 丙酸、玻巧酸、或木糖酸。参见，例如，Chen，R.(陈，R.)，和Lee，Y.Y.(李，Y.Y.)，Appl. Biochem.Biotechnol.(应用生物化学和生物技术）1997, 63-65, 435-448。在一些方面，发 酵产物是一种氨基酸。氨基酸可W是任何氨基酸，包括而不局限于；天冬氨酸、谷氨酸、甘氨 酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见例如化chard,A.(理查德，A.)，和Margaritis,A.(马 加里蒂斯，A. )，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程）2004, 87, 501-515。
[0157] 在另一方面，发酵产物是聚丽化合物。
[0158] 可W使用本领域已知的方法，如W上描述对多肤进行的描述，进行用来测试发 酵产物的产生的适合试验。例如，可W通过多种方法（例如HPLC(高效液相层析法）、 GC-MS(气相层析-质谱法）和LC-MS(液相层析-质谱法））或使用本领域熟知的常规程序 的其他适合的分析方法对发酵产物（W及其他有机化合物，例如副产物）进行分析。还可 W用培养上清液测试发酵液中的发酵产物的释放。可W使用例如针对葡萄糖和醇类的折光 率检测器、W及针对有机酸的UV检测器通过HPLC(Lin(林）等人，Biotechnol.Bioeng.(生 物技术和生物工程）2005, 90,（775-779))、或使用本领域熟知的其他适合的试验和检测方 法量化在发酵培养基中的副产物和残余的糖（例如，葡萄糖）。
[0159] 可W使用本领域已知的任何程序从发酵培养基中回收发酵产物，该些程序包括， 但不限于层析法（例如，尺寸排阻层析法、吸附层析法、离子交换层析法）、电泳程序、溶解 度差异、蒸觸、萃取（例如，液液萃取）、渗透蒸发、萃取过滤、膜过滤、膜分离、反渗透、超滤、 或结晶化。
[0160] 通过说明的方式提供W下实例而不是旨在限制本发明。
[0161] 实例
[0162] 用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。
[0163] 巧王困株 阳164] 路氏乳杆甫ST10655伯4ZXV)
[0165] 描述为路氏乳杆菌DSM20016的菌株获得自一个公共菌株保藏处。该一菌株在MRS 培养基中继代培养，并且整分试样被冷冻为SJ10468。将SJ10468接种进MRS培养基，在 37C增殖（不摇动）持续一天，并且涂布在MRS琼脂平板上，W获得单菌落。在37C生长两 天后，在MRS琼脂平板上重新分离单菌落，该平板在37C赔育持续H天，并且在该平板上刮 去细胞生长，并且在该菌株保藏处中被储存为SJ10655 (别名；04ZXV)。
[0166] 相同的细胞生长用于接种IOmlMRS培养基，在37°C，将其赔育（不摇动）持续3 天，随后通过离也收获细胞，并且使用QIAampDNA血液试剂盒（Qiagen公司，Hilden(希尔 登），德国）制备基因组DNA并且发送用于基因组测序。
[0167] 基因组测序掲示，分离的SJ10655(04ZXV)具有与JCM1112的基因组（而不是 与紧密相关的菌株DSM20016的基因组）基本一致的基因组。JCM1112和DSM20016源自 相同的原分离物，路氏乳杆菌巧75(Morita(莫里培）等人DNAresearch值NA研究）， 2008, 15, 151-161。）
[0168]大肠巧菌S.T2(参化Diderichsen(化德單希燕)等人J.Bacteriol.(细菌学杂 志）1990, 172,4315-4321)。
[0169]大肠巧菌MG1655(参见Blattner(布拉特纳）等人Science(科 学）1997,277, 1453-1462)。
[0170]大肠杆甫TGl
[0171]TGl是常用克隆菌株并且获得自商业供应商；它具有W下基因型： F' [1:raD36lacIqAQac幻M15proA+B+]glnV(supE〇thi-1A(mcrB-hsdSM) 5CrK-mK-McrB-) thiA(lac-proAB)。
[0172] 培养基
[0173]LB平板由W下构成；37gLB琼脂（Sigma公司catno.L3027)，W及至IL的双蒸 水。
[0174]LBPGS平板由W下构成；37gLB琼脂（Sigma公司catno.L3027)，0. 5%淀粉 (Merck公司cat.no. 101252)，0.OlM馬?〇4,〇. 4%葡萄糖，W及至IL的双蒸水。
[0175]TY肉汁培养基由W下构成；20g膜蛋白腺值ifco公司catno. 211699)，5g酵母 提取物值ifco公司catno. 212750)，7*l〇-3g氯化亚铁（ferrochloride)，l*l〇-3g氯化猛 (II)，1. 5*l〇-3g硫酸镇，W及至IL的双蒸水。
[017引基本培养基（MM)由W下构成；20g葡萄糖，1. Ig皿2口04,8. 9g馬册04; 1. Og(NH4)2S04;0. 5g化-巧樣酸盐；5. Og M拆04? 7&0 ;4.8mg MnS04? &0 ;2mg硫胺 素；0. 4mg/L生物素；0. 135gFeCls? 6&0 ; IOmgZnCla? 4&0 ; IOmgCaCla? 6&0 ; IOmg Na2Mo04? 2&0 ;9. 5mg CuS04? 5&0 ;2. 5mg H3BO3; W及至IL的双蒸水，用肥1将抑调节至 7。
[0177] MRS培养基获得自Difco?，为Difco?乳杆菌MRS琼脂抑或Difco?乳杆菌MRS液 体培养基，具有W下构成一Difco?乳杆菌MRS琼脂；化蛋白腺No. 3 (10.Og)，牛肉提取物 (10.Og)，酵母提取物（5.Og)，右旋糖（20.Og)，聚山梨醇醋80 (1.Og)，巧樣酸馈化Og)，己 酸轴（5.Og)，硫酸镇化Ig)，硫酸猛（0. 05g)，磯酸氨二钟化Og)，琼脂（15.Og)W及至IL 的水。Difco?乳杆菌MRS液体培养基；由相同成分组成而没有琼脂。
[017引 LC(携带乳杆菌的）培养基（LCM)由W下构成：膜蛋白酶（IOg),膜蛋白腺（3g)， 酵母提取物巧扣，皿2口04(3扣，吐温80(11111)，己酸轴（1扣，巧樣酸馈（1.5扣，半脫氨 酸-HCl(Cystein-HCl) (0.2g)，M拆04. 7H20(12mg)，FeS04.?&0(0.68mg)，MnS04. 2H20(25mg)， W及至IL的双蒸水，抑调节至7. 0。在高压灭菌后添加无菌葡萄糖至1%巧ml的20%葡 萄糖母液/IOOml培养基）。
[0179]实例1;转化实验方案 阳180] 乳杆甫甫株
[0181] 除非另外指明，如制造商所述，使用QIAprepSpin小量制备试剂盒（Qiagen公司， Hilden(希尔登），德国），从在TY培养基中生长的、并且补充有适当抗生素的2ml的过夜培 养物纯化大肠杆菌中构建的质粒DNA。在50微升的体积中回收质粒DNA，并且一微升的该 一质粒制剂用于乳杆菌的电穿孔。
[0182] 通过电穿孔，将质粒DNA转化进入乳杆菌菌株。用于电穿孔的路氏乳杆菌菌株制 备如下：将来自冷冻储用培养物的菌株接种进LCM培养基，并且在37C，将其赔育（不摇 动）过夜。将5ml整分试样移入500mlLCM培养基，并且在37C，将其赔育（不摇动），直 至ODew达到大致0. 8。如W上通过离也收获细胞，在室温下，在50ml的离子交换的无菌水 中重新息浮并且洗涂2次，并且通过离也进行收获。最终在2. 5ml的30%阳G1500中轻轻 重新息浮该些细胞，并且在醇/干冰浴中将50微升整分试样快速冷冻，并且储存在-8(TC直 至使用。W下在各自实例中描述了对电穿孔程序的改编。
[0183] 电穿孔程序A;在冰上解冻冷冻细胞，并且添加在TE缓冲液中的2微升的DNA息 浮液。将40微升的混合物转移至冰冷的2mm电穿孔比色皿，保持在冰上1-3分钟，并且在 BioRadGene化Iser?中进行电穿孔，其中设置为1. 5kV;25微法；400欧姆。添加500微 升的LCM，并且在涂板前，在37C，将该混合物赔育（不摇动）持续2小时。在补充有所需 抗生素的LCM琼脂平板（用％琼脂固化的LCM培养基）抑或MRS琼脂平板上将细胞涂板， 并且在厌氧培养室（Oxoid公司，配备有不产气菌小袋）中赔育。
[0184] 电穿孔程序B;在冰上解冻冷冻细胞，并且添加在TE缓冲液中的1微升的DNA息 浮液。将40微升的混合物转移至冰冷的Imm电穿孔比色皿，保持在冰上1-3分钟，并且在 BioRadGene化Iser?中进行电穿孔，其中设置为1. 2kV;25微法；400欧姆。添加500微 升的LCM，并且在37C将该混合物赔育（不摇动）持续4小时，之后在补充有所需抗生素的 MRS琼脂平板上涂板，并且在厌氧培养室中赔育。 财 大肠杆甫甫株
[0186]通过如制造商所述，使用BioRadGene化Iser?炬ioRad公司，Hercules(赫拉克 勒斯），加利福尼亚州，美国）的电穿孔，抑或通过使用按本领域普遍知道的普通教科书程 序制备的用化学方法的感受态细胞，进行大肠杆菌的转化。
[0187] 实例2;质粒构建。 阳18引 PST10600
[0189]基于质粒pVS2(vonWri曲t(冯赖特）等人，Appl.Environ.Microbiol.(应用与 环境微生物学）1987, 53, 1584-1588)和Rud(路德）等人所述的启动子（Rud(路德）等人 Microbiology(微生物学）2006, 152, 1011-1019)构建一组组成型表达载体。由Geneart AG公司（Regenburg(雷根堡），德国）化学合成包含Pll启动子（具有选择的侧翼限制位 点的）的DNA片段，W及包含P27(具有选择的侧翼限制位点的）的另一片段。
[0190] 包含具有侧翼限制位点的Pll的DNA片段，W及包含具有侧翼限制位点的P27的 DNA片段分别示出于SEQIDN0:506和507中。WDNA制剂的形式获得该两个DNA片段， 其中已经将该些片段插入标准Geneart载体，pM。将包含Pll的载体转化进大肠杆菌SJ2 细胞，并且将转化体保持为包含质粒PSJ10560的SJ10560。将包含P27的载体转化进大肠 杆菌SJ2细胞，并且将转化体保持为包含质粒PSJ10561的SJ10561。
[0191] 从Geneart载体切下处于17化PHindIII片段形式的含启动子片段，并且连接至 HindIII消化的PUC19。从由SJ10560制备的载体切下含Pll片段，连接至PUC19,并且将大 肠杆菌SJ2的正确转化体保持为分别包含PSJ10585和PSJ10586的SJ10585和SJ10586。 从由SJ10561制备的载体切下含P27片段，连接至PUC19,并且将大肠杆菌SJ2的正确转化 体保持为分别包含PSJ10587和PSJ10588的SJ10587和SJ10588。
[0192] 在植物乳杆菌NC8(保持为SJ10491的一个菌株）中获得质粒pVS2,通过本领域已 知的质粒制备程序从该一菌株提取，并且转化进大肠杆菌MG1655,在37C，在LB琼脂平板 上，选择红霉素抗性（200微克/ml)。两个该样的转化体被保持为SJ10583和SJ10584。
[0193] 为了将Pll插入pVS2,通过琼脂糖凝胶电泳，从PSJ10585切下含Pll的17化P HindIII片段并且纯化，并且连接至化ndIII消化的、已经制备自SJ10583的pVS2。通过电 穿孔将连接混合物转化进大肠杆菌MG1655,在LB琼脂平板上，选择红霉素抗性（200微克/ ml),并且将两个转化体（二者都容纳质粒，其中启动子插入物在两个可能的方向中具体的 一个中）保持为包含PSJ10600 (图 4)和PSJ10601 的SJ10600 和SJ10601。 阳194] PST10795
[0195] 在H种有机体大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中，将在费氏丙酸杆菌中鉴定 的硫解酶基因的1152bp编码序列（不具有终止密码子）针对表达进行优化，并且合成地构 建进入PSJ10676。包含密码子优化的CDS的DNA片段被设计为具有紧密地在起始密码子之 前的序列5'-AAGCTTTC-3'(用来添加化ndin位点并且将起始区转化为化Ol相容的Bs抑I 位点）^及紧密地在下游的序列5，-1461'押464(：^6406447^^^'4〇：-3,669 10側:459) (用来添加终止密码子、和限制位点甜al-XhoI-EcoRI-Kpnl)。
[0196] 然后将生成的序列提交至GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德国）并由该 公司进行合成，并且W包含目-内醜胺酶编码基因WaTEM-I的PM骨架载体交付。通过电 穿孔，将从Geneart公司交付的DNA制品转化进大肠杆菌SJ2,选择氨予青霉素抗性（200微 克 /ml)，并且两个转化体保持为SJ10676 (SJ2/PSJ10676)和SJ10677 (SJ2/PSJ10677)。
[0197] 费氏丙酸杆菌硫解酶基因的密码子优化的核巧酸序列（CO)和推断的氨基酸序列 分别是SEQIDN0:460和461。编码序列是包括终止密码子的115化P，并且编码的预测蛋 白是384个氨基酸。使用信号P(Si即al巧程序（Nielsen(尼尔森）等人，1997,Protein 化gineering(蛋白质工程），10:1-6)，预测在该序列中没有信号肤。基于该一程序，预测的 成熟蛋白包含384个氨基酸，具有39.SkDa的预测分子量和6. 1的等电抑。
[0198] 用BspHI和EcoRI消化质粒PSJ10676,并且使用凝胶电泳纯化生成的1. 17化片 段。用化Ol和EcoRI消化质粒PSJ10600,并且使用凝胶电泳纯化5. 2化片段。混合、连接 纯化的片段，并且将连接混合物转化进TGl电感受态细胞，在37C，在LB平板上，选择红霉 素抗性（200微克/ml)。通过使用化il的限制性分析，分析生成的菌落中的四个并且将它 们视为包含希望的重组质粒，并且通过DNA测序进一步证实了该些中的一个，将其保持，由 此产生SJ10795 (TGl/pSJ10795)。 阳19引 PST10798
[0200] 设计在丙丽下醇梭杆菌中鉴定的硫解酶基因的1176bp编码序列（不具有终止密 码子），用于在H种有机体大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中优化表达，并且合成地构 建进入PSJ10705。包含密码子优化的编码序列的DNA片段被设计为具有紧密地在起始密 码子之前的序列5' -AAGCTTTC-3'(用来添加HindIII位点并且将起始区转化为化Ol相容 的839^位点）^及紧密地在下游的序列5'-1461'口'464口'〔646644口'〔6614〇：-3,669 10 N0:459)(用来添加终止密码子、和限制位点甜al-XhoI-EcoRI-Kpnl)。
[020。 然后将生成的序列提交至GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德国）并由该 公司进行合成，并且W包含目-内醜胺酶编码基因WaTEM-I的PM骨架载体交付。通过电 穿孔，将从Geneart公司交付的DNA制品转化进大肠杆菌SJ2,选择氨予青霉素抗性（200微 克 /ml)，并且两个转化体保持为SJ10705 (SJ2/PSJ10705)和SJ10706 (SJ2/PSJ10706)。
[0202] 丙丽下醇梭杆菌硫解酶基因的野生型核巧酸序列（WT)、密码子优化的核巧酸序列 (CO)、和推断的氨基酸序列分别是SEQIDNO:462、463、和464。编码序列是包括终止密码子 的1179bp，并且编码的预测蛋白是392个氨基酸。使用信号P(Signal巧程序（Nielsen(尼 尔森）等人，Protein化gineering(蛋白质工程），1997, 10, 1-6)，预测在该序列中没有信 号肤。基于该一程序，预测的成熟蛋白包含392个氨基酸，具有41. 4kDa的预测分子量和 7. 08的等电抑。
[0203] 用BspHI和EcoRI消化质粒PSJ10705,而用化〇1和EcoRI消化PSJ10600。使用 凝胶电泳各自纯化产生的PSJ10705的1193bp片段和PSJ10600的5147bp片段，并且随后 如在此概述的进行连接。
[0204] 通过电穿孔，将连接混合物的整分试样用于转化大肠杆菌TG1，并且在LB平板上， 用200微克/ml红毒素选择转化体。通过使用化il的限制性分析连同DNA测序，分析了 4 个菌落中3个，并且将它们视为包含希望的重组质粒，并且将该些中的两个保持，由此产生 SJ10798(TGl/pSJ10798)和SJ10799(TGl/pSJ10799)。 阳20引 PST10743
[0206] 在H种有机体大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中，将在短乳杆菌中鉴定的 硫解酶基因的1167bp编码序列（不具有终止密码子）优化表达，并且合成地构建进入 PSJ10699。包含密码子优化的CDS的DNA片段被设计为具有紧密地在起始密码子之前的序 列5' -AAGCTTCC-3'(用来添加HindIII位点并且将起始区转化为化Ol位点）W及紧密地 在下游的序列5'-1461'押464(：1'〔646644口'〔6614〇：-3'669 10側:459)(用来添加终止密 码子、和限制位点甜al-XhoI-EcoRI-Kpnl)。
[0207] 然后将生成的序列提交至GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德国）并由该 公司进行合成，并且W包含目-内醜胺酶编码基因WaTEM-I的PM骨架载体交付。通过电 穿孔，将从Geneart公司交付的DNA制品转化进大肠杆菌SJ2,选择氨予青霉素抗性（200微 克 /ml)，并且两个转化体保持为SJ10699 (SJ2/PSJ10699)和SJ10700 (SJ2/PSJ10700)。
[020引短乳杆菌硫解酶基因的密码子优化的核巧酸序列（CO)和推断的氨基酸序列分别 是SEQIDN0:465和466。编码序列是包括终止密码子的117化P，并且编码的预测蛋白是 389个氨基酸。使用信号P(Signal巧程序（Nielsen(尼尔森）等人，1997,同上），预测在 该序列中没有信号肤。基于该一程序，预测的成熟蛋白包含389个氨基酸，具有40. 4kDa的 预测分子量和6. 5的等电抑。
[0209]用化Ol和EcoRI消化质粒PSJ10699,并且使用凝胶电泳纯化生成的1. 18化片段。 用化Ol和EcoRI消化质粒PSJ10600,并且使用凝胶电泳纯化5. 2化片段。混合、连接纯化的 片段，并且将连接混合物转化进MG1655电感受态细胞，在37C，在LB平板上，选择红霉素抗 性（200微克/ml)。通过使用ClaI的限制性分析，分析生成的菌落中的16个并且将两个视 为包含希望的重组质粒，并且通过DNA测序进一步证实，将其保持，由此产生SJ10743 (TGl/ PSJ10743)和SJ10757(TGl/pSJ10757)。 阳210] PST10796
[02U] 使用W下示出的引物671826和671827,从SJ10468的染色体DNA扩增来自路氏乳 杆菌的1176bp硫解酶编码序列（不具有终止密码子）（同上）。
[0212] 引物 671826:
[0213] 5, -AGTCAAGCTTCCATGGAGAAGGTTTACATTGTTGC-3,（SEQIDN0:467)
[0214]引物 671827:
[02巧]5, -ATGCGGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGACTAAATTTTCTTAAGCAGAACCG-3'(SEQID NO:468)
[0216]PCR反应编程为；94°C持续2分钟；并且然后19个循环，每个循环在95C持续 30砂、59C持续1分钟、W及72C持续2分钟；然后一个循环，在72C持续5分钟。用 化oI+EcoRI消化大致1. 2化的PCR扩增的片段，通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并且然后连接至 质粒PSIP409的琼脂糖凝胶电泳纯化的EcoRI-NcoI载体片段（W02012/058603)。将连接混 合物转化进大肠杆菌SJ2,选择氨予青霉素抗性（200微克/ml)，并且将通过限制酶切消化 和DNA测序视为正确的转化体保持为SJ10694(SJ2/pSJ10694)。
[0217] 路氏乳杆菌硫解酶基因的密码子优化的核巧酸序列（CO)和推断的氨基酸序列分 别是SEQIDN0:469和470。编码序列是包括终止密码子的1179bp，并且编码的预测蛋白 是392个氨基酸。使用信号P(Signal巧程序（Nielsen(尼尔森）等人，1997,同上），预测 在该序列中没有信号肤。基于该一程序，预测的成熟蛋白包含392个氨基酸，具有41.OkDa 的预测分子量和5. 4的等电抑。
[021引用化Ol和EcoRI消化质粒PSJ10694,并且使用凝胶电泳纯化生成的1. 19化片段。 用化Ol和EcoRI消化质粒PSJ10600,并且使用凝胶电泳纯化5. 2化片段。混合、连接纯化 的片段，并且将连接混合物转化进TGl电感受态细胞，在37C，在LB平板上，选择红霉素抗 性（200微克/ml)。通过使用化il的限制性分析，分析生成的菌落中的四个并且将它们视 为包含希望的重组质粒，并且通过DNA测序进一步证实了该些中的两个，将其保持，由此产 生SJ10796(TGl/pSJ10796)和SJ10797(TGl/pSJ10797)。 阳21引PST10762
[0220] 在H种有机体大肠杆菌、植物乳杆菌和路氏乳杆菌中，将来自发酵乳杆菌的异丙 醇脱氨酶（SWISSPR0T:B2GD册）的1068bpCDS(不具有终止密码子）针对表达进行优化，并 且合成地构建进入PSJ10703。
[0221] 包含密码子优化的异丙醇脱氨酶CDS(sa化Lf)的DNA片段被设计为具有紧密地 在起始密码子之前的序列 5'-GGTACCACTATTACAAGGAGATTTTAGTC-3'（SEQIDN0:471) (用来添加化nl位点和乳杆菌RB巧W及紧密地在下游的XmaI和化ndIII限制位点。该些 构建体获得自GeneartAG公司，并且如前所述进行转化，产生SJ10703 (SJ2/PSJ10703)和 SJ10704(SJ2/pSJ10704)。
[0222] 发酵乳杆菌异丙醇脱氨酶基因的密码子优化的核巧酸序列（CO)和推断的氨基酸 序列分别是SEQIDN0:472和473。编码序列是包括终止密码子的107化P，并且编码的预 测蛋白是356个氨基酸。使用信号P(Signal巧程序（Nielsen(尼尔森）等人，1997,同 上），预测在该序列中没有信号肤。基于该一程序，预测的成熟蛋白包含356个氨基酸，具有 37. 9kDa的预测分子量和5. 2的等电抑。
[0223]用BspHI和XmaI消化质粒PSJ10703,并且使用凝胶电泳纯化生成的1. 1化片 段。用XmaI和化Ol消化质粒PSJ10600,并且使用凝胶电泳纯化生成的5. 1化片段。混 合、连接纯化的片段，并且将连接混合物转化进JM103连同TGl电感受态细胞，在37C，在 LB平板上，选择红霉素抗性（200微克/ml)。通过使用ClaI的限制性分析，分析转化体， 并且将两个（来自每个宿主菌株中各一个）视为包含希望的重组质粒，并且通过DNA测序 证实，将其保持为SJ10762(JM103/pSJ10762)和SJ10765(TGl/pSJ10765)。还证实转化体 SJ10766(JM103/pSJ10766)包含发酵乳杆菌异丙醇脱氨酶基因。PSJ10762的质粒图示出于 图6。 阳224] DSTl1298(热敏裁体）
[0225] 对于整合进入W及随后从乳杆菌染色体切除而有用的热敏载体是基于 pG+Host4(Aggligene，法国；参见Biswas(比斯瓦斯）等人J.Bacteriol.(细菌学杂 志）1993, 175, 3628-363巧。使用质粒pUC19(Yanisch(雅尼奇）-Perron(佩龙）等人 Gene(基因）1985, 33, 103-119)作为模板，W及W下示出的引物689229和689230,通过PCR 扩增，获得在大肠杆菌中发挥功能的质粒复制起点。
[0226]引物 689229:
[0227] 5, -GACTAAGCTTGGGCCCTCCTCGCTCACTGACTCGCT-3'（SEQIDN0:474)
[022引 引物 689230:
[0229] 5, -GACTGAATTCGGGCCCTCATGACCAAAATCCCTTAACG-3'（SEQIDN0:475)
[0230] 用EcoRI+Hindlll消化通过PCR扩增获得大致0. 8化的DNA片段，并且通过琼脂 糖凝胶电泳进行纯化。
[023。用EcoRI+Hindlll消化pG+Host4,并且用碱性磯酸酶处理消化的载体。混合、连 接片段的和载体DNA，并且将连接混合物转化进大肠杆菌SJ2感受态细胞，选择红霉素抗性 (200微克/ml)。包含具有插入pG+Host4骨架的PUC19复制起点的质粒的转化体被保持为 SJ11298(SJ2/pSJ11298)。
[0232] 根据W上描述的程序B，将质粒pSJl1298引入SJl1294突变乳杆菌菌株（参见实 例3)，并且在补充有红霉素（10微克/ml)的MRS培养基中，在3(TC抑或37C增殖获得的转 化体（SJ11487)。过夜赔育后，将400yL的培养物接种进具有10微克/ml红毒素的1. 5mL MRS中。在30°C抑或37°C生长3小时后，在0. 8血STE缓冲液（每升包含；26. 8ml25%藏 糖、50mlIMTris(pH7. 5)、和2ml0. 5M邸TA)中洗涂细胞，并且使用Qiagen公司spin试 剂盒（Qiagen公司，Hilden(希尔登），德国），提取质粒DNA。
[023引与37C培养物相比，从3(TC培养物获得实质上更多的质粒DNA，证实了在路氏乳 杆菌中该一质粒的复制的热敏性质。 阳234] D服Q357
[0235] 将质粒载体PSIP409(WO2012/058603)用作模板，用于编码-葡萄糖酵酸酶的报 告基因gusA的PCR扩增，使用修饰的随机化引物pr029;5'-CCCATGTCGACNNNNNNNNA GTTGTTGACANNNNNNNNNNNNNNTGRTAWDN?NNNNTATAGCGTACTTAGCTGGCC-3'(SEQ IDN0:516)(由Rud(路德）等人描述，（Rud(路德）等人Microbiology(微生物 学）2006, 152, 1011-1019)，W及引物 665282:5,-GCTATCAATCAAAGCAAC-3,（沈QID NO: 517)，使用Phusion恥圾启动DNA聚合酶（Finnzymes公司，芬兰）。
[0236]PCR反应编程为；94°C持续2分钟；并且然后30个循环，每个循环在94C持续30 砂、56C持续1分钟、W及72C持续1分钟；然后一个循环，在72C持续5分钟。该生成 编码侧翼是Sail和EcoRI限制位点的启动子和gusA基因的2化片段。如制造商推荐，使 用PCR纯化试剂盒（Qiagen公司，Hilden(希尔登），德国），纯化PCR产物。然后将纯化的 PCR产物用于运行一个另外的PCR循环，用引物665282,如下；94°C持续2:30分钟，56C持 续1分钟，W及72C持续5分钟。再次如制造商推荐，使用PCR纯化试剂盒（Qiagen公司， Hilden(希尔登），德国），纯化PCR产物（2化）。
[0237] 然后用Sall+EcoRI消化PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳进行纯化，并且最终连接至 质粒PSIP411的琼脂糖凝胶电泳纯化的SalI-EcoRI载体片段（3.化b) (W02012/058603)。 将连接混合物用于转化大肠杆菌TGl，选择红霉素抗性（200微克/ml)。
[0238] 将包含质粒地KQ357(5.化b)的大肠杆菌转化体鉴定为具有质粒编码的gusA基因 的W下上游序列；5,-GTCGACCCGGAAGTAGTTGTTGACACGCACCTGCTTGTGTGATAAATTAA ATTTATAGCGTACTTAGCTGGCC-3'(沈QIDN0:518)。
[0239] P服Q357的质粒图示出于图9。 阳240] PST11460
[024^ 由GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德国）化学合成质粒PSJ11460,并且 该质粒包含编码来自植物乳杆菌的己醜己酸脱駿酶的DNA序列。在标准Geneart载体中 获得该基因，并且然后将该基因转化进大肠杆菌SJ2电感受态细胞，并且将转化体保持为 SJl1460(该质粒表示为pSJl1460)。包含己醜己酸脱駿酶基因的合成的化Ol-KpnI片段 (标为adc_D13974)具有SEQIDN0:515中示出的核巧酸序列。 阳24引PST11464
[024引由GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德国）化学合成质粒PSJ11464,并 且该质粒包含编码来自胃窦乳杆菌的仲醇脱氨酶的DNA序列。在标准Geneart载体中获 得该基因，并且然后将该基因转化进大肠杆菌SJ2电感受态细胞，并且将转化体保持为 SJl1464(该质粒表示为pSJl1464)。包含该醇脱氨酶基因的合成的化nl-Xmal片段（标为 sa&_D13976)具有SEQIDN0:514中示出的核巧酸序列。 阳244]PTRGU1065
[024引使用W下引物P540和P541，通过PCR扩增地KQ357的载体骨架。
[0246]P540 ;5' -CAATGATCTAGACTCGAGGA-3'（沈QIDN0:504)
[0247] P541 ;5' -GACGTACCATGGCTAAAATC-3'（沈QIDN0:505)
[024引对于该PCR反应，使用Phusioi悚巧启动DNA聚合酶（Finnzymes公司，芬兰），并且 该一扩增反应编程为；30个循环，在98C持续2分钟；98C持续20砂，梯度从4(TC至6(TC 持续30砂，72°C持续1分钟30砂；然后一个循环，在72°C持续5分钟。如在琼脂糖凝胶电 泳上估计，所有测试的温度，除了 47. 7C，导致3. 3化DNA片段的扩增。根据制造商的指示， 用PCR纯化试剂盒（Qiagen公司，Hilden(希尔登），德国）纯化生成的PCR产物。
[0249]在 37 °C,分别用限制性内切酶化ol+Xmal、化oI+Kpnl、和KpnI+Xmal(New 化glandBiol油S公司，Ipswich(伊普斯威奇），马萨诸塞州，美国）将W上PCR产物、pSJ10701(W02012/058603)、W及pSJ11464(同上）消化过夜。在 37°C，用IU小牛肠磯酸 酶（CIP) (New化glandBiol油S公司）将地KQ357的限制的PCR产物去磯酸化，持续30 分钟。所有H种消化物随后经历在0. 75%琼脂糖凝胶上的电泳，并且根据制造商的指示， 使用QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen公司）纯化具有大致3. 3化(P服Q357扩增子）、 0. 9化（adc_D72YKT)、W及 1. 1化（sa&_D13976)的条带。
[0巧0] 在室温下，使用包含IOmMATP的T4DNA连接酶缓冲液中的T4DM连接酶 (F.Hoffmann-LaRocheLtd公司，己塞尔，瑞± )，将纯化的消化DNA片段W-个H片段连 接反应进行连接，过夜。经由42C热休克持续2分钟，将连接混合物的5yL整分试样转化 进化学上的感受态大肠杆菌TGl。在37C，摇动下恢复3小时后，将细胞在包含200yg/ml 红霉素的LB琼脂平板上涂板，并且在37C赔育过夜。将一个菌落，大肠杆菌TRGU1065接种 进具有100yg/血红霉素的液体LB培养基中，并且在37C赔育固液。使用巧aprep?Spin 小量制备试剂盒（Qiagen公司），分离相应质粒PTRGU1065,并且经受DNA测序W证实adc_D72YKT和sadh_D13976被克隆进了载体。将来自液体过夜培养物的包含PTRGU44的大肠杆 菌TRGU1065 储存在-8(rC的30%丙H醇中。pTRGU1065 的质粒图示出于图7。 。巧。PTRGU1073
[0巧2] W基本上相同的方式，将质粒PTRGU1073构建为pTRGU1065(同上），其中adc_ D72YKT被换成adc_D13974。从载体pSJ11460(如W下描述进行合成）克隆dc_D13974。PTRGU1073的质粒图示出于图8。
[0巧引实例3 ;具有编码I型限制修饰系统的特异性亚基的破坏的基因（LAR_0818)的乳 杆菌突变体的分离
[0254] 从W下描述的转化实验最初产生包含破坏的特异性亚基的路氏乳杆菌突变体并 且进行选择。
[0巧5] 使用W上描述的实验方案（程序A)，用质粒PSJ10795、PSJ10796、PSJ10798、和 PSJ10743转化路氏乳杆菌SJ10655。在具有10微克/ml红霉素的MRS平板上，W及在具有 10微克/ml红霉素的LCM平板（具有1 %葡萄糖）上进行选择。在37C，将该些平板厌氧 赔育2天，随后对菌落进行计数。结果示于表1中。 。巧引表1 :
[0巧7]
【权利要求】
1. 亲本乳杆菌菌株的一种分离的突变体，该突变体包含对编码I型限制修饰系统亚基 的内源基因的破坏。
2. 如权利要求1所述的分离的突变体，该突变体包含对编码I型限制修饰系统的限制 性亚基的内源基因的破坏或对编码I型限制修饰系统的特异性亚基的内源基因的破坏。
3. 如权利要求2所述的分离的突变体，其中（a)该限制性亚基与SEQIDN0:8、SEQID NO: 16、或其成熟多肽序列具有至少60 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性；(b)在至少 低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下，编码该限制性亚基的基因的编码序列与SEQID N0:7或SEQIDNO: 15的全长互补链杂交；或（c)编码该限制性亚基的基因的编码序列与 SEQIDNO:7、SEQIDNO: 15、或其成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100% 的序列一致性。
4. 如权利要求2或3所述的分离的突变体，其中该限制性亚基包括SEQIDN0:8、SEQ IDNO: 16、或其成熟多肽序列或由它们组成。
5. 如权利要求2所述的分离的突变体，其中（a)该特异性亚基与SEQIDN0:2、4、6、 12、14、或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性；(b)在至少 低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下，编码该特异性亚基的基因的编码序列与SEQID NO: 1、3、5、11、或13的全长互补链杂交；或（〇)编码该特异性亚基的基因的编码序列与5￡〇 10勵:1、3、5、11、或13、或其成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、 至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序 列一致性。
6. 如权利要求2或6所述的分离的突变体，其中该特异性亚基包括SEQIDNO: 2、4、6、 12、14、或其成熟多肽序列或由它们组成。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的分离的突变体，其中破坏发生在编码该I型限制修 饰系统亚基的基因的编码序列中。
8. 如权利要求1-7中任一项所述的分离的突变体，其中当在相同条件下培养时，与亲 本乳杆菌菌株相比，该突变体产生至少25 %更少（例如至少50 %更少、至少60 %更少、至少 70%更少、至少80%更少、或至少90%更少）的由破坏的基因编码的I型限制修饰系统亚 基。
9. 如权利要求1-8中任一项所述的分离的突变体，其中编码该I型限制修饰系统亚基 的内源基因被灭活。
10. 如权利要求1-9中任一项所述的分离的突变体，该突变体进一步包括对编码一个 非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。
11. 如权利要求10所述的分离的突变体，其中（a)该非I型限制修饰系统蛋白与SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:22、或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至 少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列 一致性；(b)在至少低、中、中-高、高或非常高严谨度条件下，编码该非I型限制修饰系统 蛋白的基因的编码序列与3￡〇10勵 ：19或5￡〇10勵:21的全长互补链杂交；或（(：）编码 该非I型限制修饰系统蛋白的基因的编码序列与SEQIDNO: 19、SEQIDN0:21、或其成熟 多肽编码序列具有至少60 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、 至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
12. 如权利要求10或11所述的分离的突变体，其中该非I型限制修饰系统蛋白包括 SEQIDNO: 20、SEQIDNO: 22、或其成熟多肽序列或由它们组成。
13. 如权利要求10-12中任一项所述的分离的突变体，其中破坏发生在编码该非I型限 制修饰系统蛋白的基因的编码序列中。
14. 如权利要求10-13中任一项所述的分离的突变体，其中当在相同条件下培养时，与 亲本乳杆菌菌株相比，该突变体产生至少25 %更少（例如至少50 %更少、至少60 %更少、至 少70%更少、至少80%更少、或至少90%更少）的由破坏的基因编码的非I型限制修饰系 统蛋白。
15. 如权利要求10-14中任一项所述的分离的突变体，其中编码该非I型限制修饰系统 蛋白的内源基因被灭活。
16. 如权利要求1-15中任一项所述的分离的突变体，其中当在相同条件下培养时，与 亲本乳杆菌菌株相比，该突变体具有改进的转化效率。
17. 如权利要求16所述的分离的突变体，其中当在相同条件下培养时，与亲本乳杆菌 菌株相比，使用PSJ10762、pTRGU1065、或pTRGU1073作为转化体DNA，该突变体具有改进的 转化效率。
18. 如权利要求1-17中任一项所述的分离的突变体，其中当在相同条件下转化并且培 养时，与亲本乳杆菌菌株相比，该突变体能够产生至少10倍（例如至少100倍、至少1000 倍、至少10000倍、或至少100000倍）更多的转化体。
19. 如权利要求1-18中任一项所述的分离的突变体，其中该乳杆菌菌株选自植物乳杆 菌、食果糖乳杆菌、和路氏乳杆菌。
20. 用于获得如权利要求1-19中任一项所述的分离的突变体的一种方法，该方法包 括：(a)培养一种亲本乳杆菌菌株；(b)在（a)的亲本乳杆菌菌株中，破坏编码该I型限制修 饰系统亚基或非I型限制修饰系统蛋白的内源基因；以及（c)分离生成自（b)的突变体菌 株。
21. 用于获得乳杆菌转化体的一种方法，该方法包括：(a)培养如权利要求1-19中任一 项所述的分离的乳杆菌突变体；(b)将一种异源多核苷酸转化进（a)的乳杆菌突变体；以及 (c)分离生成自（b)的转化体菌株。
22. 如权利要求21所述的方法，该方法进一步包括修复对编码该I型限制修饰系统亚 基或非I型限制修饰系统蛋白的内源基因的破坏。
23. 通过如权利要求21或22所述的方法产生的一种乳杆菌转化体。
【文档编号】C12N15/74GK104379734SQ201380025964
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2012年5月18日
【发明者】S·T·约根森, T·B·雷盖拉, B·克伯曼, P·B·奥尔森, B·克里斯坦森 申请人:诺维信公司