Pdgf和vegf的适体及它们在治疗pdgf和vegf介导的病状中的用途

Pdgf和vegf的适体及它们在治疗pdgf和vegf介导的病状中的用途
【专利摘要】本文提供了结合PDGF的适体和结合VEGF的适体。此外，本文提供了包含PDGF适体和VEGF适体的适体构建体。本文提供了包含适体和适体构建体的药物组合物，以及使用所述适体和适体构建体治疗病状的方法。
【专利说明】PDGF和VEGF的适体及"S们在治疗PDGF和VEGF介导的病 状中的用途 发明领域
[0001] 本公开一般涉及核酸领域，和更具体地涉及能够结合血小板源性生长因子（PDGF) 的适体和能够结合血管内皮生长因子（VEG巧的适体领域。在一些实施方案中，此类适体可 用作为预防、治疗和/或改善增殖性病症的治疗剂，所述增殖性病症包括但不限于动脉粥 样硬化、黄斑变性、纤维化、癌症和PDGF和/或VEGF牵涉其中的其它病症。在一些实施方 案中，本公开涉及能够同时或W相互排除的方式结合VEGF和PDGF并可用作治疗剂的适体 构建体。
[000引背景
[0003]W下描述提供信息总结，并且不承认任何提供的信息或本文参考的公开是对本公 开可用的现有技术。
[0004] 血小板源性生长因子（PDGF-A、-B、-C和-D)是许多结缔组织细胞普遍存在 的有丝分裂原和趋化因子（化日化；Lksson,L等人，（2004)切tokineGrowthFactor Rev. 15 (4) : 197)。PDGFW二硫化物-连接的二聚体的形式出现，并含有通过结合至细胞表 面的PDGF受体a和目起作用的半脫氨酸结折叠生长因子结构域（Claesson-Welsh，L. 等人，（1989)Proc.化tl.Acad.Sci.USA86:4917)。PDGF结合包括受体二聚化，该导 致细胞内酪氨酸残基处的自磯酸化（Claesson-Welsh，J. (1994)Biol.Chem. 269:32023)。 PDGF-BB参与了几种增殖性病症，包括动脉粥样硬化、纤维化、黄斑变性和癌症（Ostman, A.等人，（2001)Adv.CancerRes. 80:1 ;Appelmann,I.等人，（2010)RecentResults CancerRes. 180:51 ;Trojanowska,M.等人，（2008)Rheumatology(Oxford)47(增 刊 5):2;Rutherford等人（1997)Atheroscle;rosis130:45;Smits等人（1992) Am.J.化thol. 140:639;Heldin等人（1991化ndocrinology129:2187;Floege和 Johnson(1995)Miner.ElectrolyteMetab. 21:271；Raines等人(1990)Experimental PharmacoloRY,PeptideGrowthFactorsandTheirReceptors'Sporn&Roberts,第 173-262 页，Springer,Heide化erg.)。
[0005]VEGF是一种选择性刺激内皮细胞增殖、迁移并产生基质降解酶的分泌性二硫 化物-连接的同源二聚体，所有该些是新血管形成所需的过程（Conn,G.等人，（1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1323 ;Ferrara,N.等人（1989)Biochem.Biophys.Res. Commun. 161:851 ;Gospodarowicz,D.等人，（igsWProc.P'Jatl.Acad.Sci.USA86:7311; Pe卵er,M.S.等人，（1991)Biochem.Biophys.Res.Commun. 181:902;Unemori,E.N.等 人，（1992)J.Cell.Physiol. 153:557)。除了为唯一已知的内皮细胞-特异性促分裂 原之外，VEGF在血管生成生长因子之中的独特性在于其诱导大分子血管通透性瞬间增 加的能力值vorak,H.F.等人，（1979)J.Immunol. 122:166 ;Senger,D.R.等人，（1983) Science219:983 ;Senger，D.R.等人，（1986)CancerRes. 46:5629)。增加的血管通 透性和所导致的血浆蛋白在血管外空间的沉积，通过为内皮细胞迁移提供临时基质 而促进新血管形成。高通透性的确是新血管的性能特点值vorak，H.F.等人，（1995) Am.J.Pathol. 146:1029)。此外，由组织缺氧诱导的补偿性血管生成还由VEGF介导 (Levy，A.P.等人，（1996)J.Biol.Chem. 271:2746;aiwe化i，D.等人，（1991)化Uire 359:843)。将VEGF鉴定为缺氧诱导蛋白连同缺氧导致VEGF表达受抑制的辅助观察， 提供了将氧需求与血管供应匹配的动人机巧!| (Benjamin,LE.等人，（1999)J.Clin. Invest. 103:159 ;Alon,T.等人，（1995)化1:.Med. 1:1024)。
[0006] VEGF蛋白的几种亚型由编码VEGF的基因的八个外显子的可变剪接所产生 (血ing,S.A.等人，（2006)J.Invest.Dermatol.Symp.Proc. 11:79)。最常见的亚型是 VEGF-12UVEGF-165和VEGF-189。VEGF的蛋白水解过程可产生额外的亚型。可通过在 Arg-IlO和Ala-Ill之间用纤溶酶切割VEGF-165W产生VEGF-110,其在功能上等效于 VEGF-121Ofeyt,B.A.等人，（1996)J.Biol.Chem. 271:7788)。可用尿激酶在外显子 6 结构域 内切割VEGF-189,并然后可用纤溶酶进一步切割W产生VEGF-IlO(Pl〇ugt，J.等人，（1997) J.Biol.Chem. 272:13390)。此外，一个亚组的基质金属蛋白酶（MMP)(包括MMP-3、-7、-9 和-19)能够W连续的步骤切割VEGF-165和VEGF-189来产生在功能上等效于VEGF-IlO的 VEGF-113。因此，在给定组织中，VEGF的基质-结合相对丰度和可扩散性通过发生于组织细 胞中的可变剪接和蛋白水解过程的结合而确定（Ferrara,N.等人，（2006)Retina26:859)〇
[0007] 年龄相关性黄斑变性（AMD)仍然是超过55岁的人失明的主要原因。该疾病的特征 在于在黄斑（具有最高密度的感光器并参与中央视觉的视网膜部分）中形成了被称为璃膜 巧的不溶性沉积物。在AMD的起始阶段，沉积物是无血管的，并且所述疾病一般进展缓慢。 然而，在约10%的患者中，该种所谓"干"式AMD变为血管化并转变为"湿"式AMD,在此期间 所述疾病变得更为进行性并且视力W较快的速率恶化。在许多情况下，在两年之内，中央视 觉的模糊不清进展为实质失明。在该疾病的晚期，渗出性或湿性AMD,新血管从脉络膜血管 层渗透至视网膜的中央部位（黄斑），封闭了中央视觉。在美国，湿性AMD在约1，800, 000 人中流行，并且有望在2020年增加至接近3, 000, 000。在美国，湿性AMD的发病率为每年约 210, 000 人。
[0008] 最近，已经通过直接注射结合至VEGF的高亲和性枯抗剂至眼部，预防VEGF与内皮 细胞上的其细胞表面受体的相互作用，从而阻断VEGF-介导对血管生成和血管泄露的诱导 治疗了AMD。
[0009] 存在VEGF和PDGF-B信号传导的双重抑制导致更有效阻断血管生成W及新血管 消退的大量证据。例如，临床证据表明VEGF和PDGF-B的双重抑制可在AMD患者中实现 对眼部血管生成的更完全抑制。最初发现于NeXstar化armaceuticals(Green,LS.等 人，（1996)Biochemistry35:14413 ;美国专利号 6, 207,816 ;美国专利号 5, 731，144 ;美国 专利号5, 731，424 ;和美国专利号6, 124, 449)的PDGF-B的适体抑制剂巧10030)，正在由 化hthotech公司开发用于AMD治疗。E10030(Fovista猿）是一种基于DNA的经修饰的适 体，其结合至PDGF-AB或PDGF-BB且Kd为大约10化M，并且在体外和体内抑制PDGF-B的功 能。
[0010] 在1期研究中，用测试的E10030进行的抗-PDGF疗法联合Lutxnns.化抗-VEGF疗 法可导致12周治疗之后59%经治疗患者的视力提高H行。与历史上用Lucentis单独进 行的治疗所观察到的34-40%相比，该是视敏度改进的患者的相当较高的比率。此外，在所 有研究参与者中，联合治疗伴随有显著的新血管消退。对449名患有湿性AMD的患者的2 期研究最近确证使用联合治疗使功效增强。与接受Lucentis单疗法（P= 0.019)的患者 获得的6. 5个字母相比，接受联合的化vista(1. 5mg)和Lucentis的患者在24周获得平均 10. 6个字母的视觉，该代表了 62%额外的视敏度益处。
[0011] 概要
[0012] 本公开提供结合至血小板源性生长因子B(PDGF-B，包括PDGF-BB和PDGF-AB)的 适体，结合血管内皮生长因子（VEGF，包括VEGF-121和VEGF-165)的适体，W及包含结合 PDGF-B的适体和结合VEGF的适体的适体构建体。公开的适体和适体构建体可用作预防、治 疗和/或改善包括但不限于动脉粥样硬化、黄斑变性、纤维化、糖尿病性视网膜病变和癌症 的增殖性疾病或病状和/或PDGF和/或VEGF牵涉其中的其它疾病或病状的治疗剂。在各 种实施方案中，适体构建体能够单独结合VEGF和PDGF-B的每一个，和/或同时结合VEGF 和PDGF-B。包括了包含PDGF适体、VEGF适体或VEGF/PDGF-B适体构建体或者上述任一者 的药学上可接受的盐，W及至少一种药学上可接受的载体的的药物组合物或制剂。可W任 何适合的药学上可接受的剂型制备此类组合物。
[0013] 在另一方面，本公开提供用于预防、治疗和/或改善由PDGF和/或VEGF介导的疾 病或病状的方法。在一些实施方案中，方法包括向诸如哺乳动物的受试者施用PDGF适体、 VEGF适体和/或VEGF/PDGF-B适体构建体或者包含该些物质的任一个的药物组合物。在一 些实施方案中，所述受试者是人。具体来讲，提供了用于治疗、预防和/或改善纤维化、动脉 粥样硬化、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和/或癌症的方法。在一些实施方案中，由PDGF 和/或VEGF介导的疾病或病状是一种其中PDGF和/或VEGF活性可直接或间接有助于所 述疾病或病状的疾病或病状。此类疾病或病状包括但不限于纤维化、动脉粥样硬化、黄斑变 性、糖尿病性视网膜病变和癌症。在一些实施方案中，待治疗、预防和/或改善的疾病或病 状是年龄相关性黄斑变性（AMD)、糖尿病性视网膜病变或其它眼部疾病，诸如青光眼、慢性 干眼、AIDS-相关的视力减退、弱视、偏盲、视网膜静脉闭塞、沙眼、圆锥角膜、脉络膜视网膜 炎症、中也性浆液性视网膜病、葡萄膜炎、视网膜炎、高血压性视网膜病变、视网膜营养不良 症等。在一些实施方案中，待治疗、预防和/或改善的疾病或病状是肾纤维化或肾癌症。
[0014] 在一些实施方案中，本文公开的适体和适体构建体在从生物标志物发现和诊 断（0stroff，R.M.等人，（2010)PL〇SOne5:el5003 ;Mehan，M.等人，（2012)PL〇SOne 7:e35157)到组织化学和成像（Gupta,S.等人，（2011)Appl.Immunohistochem.Mol. Mo巧hoi. 19:273)的范围内有潜在的应用。
[0015] 在一些实施方案中，疗效（如，治疗、预防和/或改善纤维化、动脉粥样硬化、黄斑 变性或癌症等）可通过施用PDGF适体、VEGF适体和/或PDGF/VEGF适体构建体来使得适 体或适体构建体暴露于并可结合至PDGF和/或VEGF来实现。在一些实施方案中，无论递 送适体至正在治疗的受试者的方法如何，此类结合都发生。在一些实施方案中，疗效可通过 施用PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体，使得其暴露于和结合至PDGF和/或 VEGF并预防或减少PDGF和/或VEGF与一种或多种细胞受体的结合来实现。
[0016] 在一些实施方案中，PDGF适体与PDGF-BB或PDGF-AB的结合干扰了PDGF-BB或 PDGF-AB与PDGF-a受体的结合。在一些实施方案中，PDGF适体与PDGF-BB或PDGF-AB的 结合干扰了PDGF-BB或PDGF-AB与PDGF-目受体的结合。在一些实施方案中，PDGF-BB或 PDGF-AB的PDGF适体减少了PDGF受体（诸如PDGF-a受体和/或PDGF-目受体）的磯酸 化。
[0017] 在一些实施方案中，VEGF适体与VEGF-121、VEGF-110、VEGF-165、VEGF-189 或VEGF 的另一种可变剪接或功能活性的蛋白水解片段的结合干扰了生长因子与VEGFR-I(Flt-I) 的结合。在一些实施方案中，VEGF适体与VEGF-121、VEGF-110、VEGF-165、VEGF-189 或VEGF 的另一种可变剪接或功能活性的蛋白水解片段的结合干扰了生长因子与VEGFR-2(KDR)的 结合。在一些实施方案中，VEGF适体减少了VEGF受体（诸如VEGF-I受体和/或VEGF-I受 体）的磯酸化。
[0018] 在一些实施方案中，PDGF/VEGF适体构建体降低了PDGF受体（诸如PDGF-a受体 和/或PDGF-目受体）的磯酸化水平并降低了VEGF受体（诸如VEGFR-I和/或VEGFR-2) 的磯酸化水平。在一些实施方案中，PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体减少了 沿PDGF受体和/或VEGF受体的信号传导通路的信号传导。
[0019] 在一些实施方案中，将PDGF适体、VEGF适体或PDGF/VEGF适体构建体与一种或多 种额外的活性剂一起施用。此类施用可为连续或联合的。
[0020] 在一些实施方案中，体外诊断方法包括使PDGF适体与疑似包含PDGF的样品接触。 在一些实施方案中，体内诊断方法包括向疑似患有PDGF-介导的疾病或病症的个体施用适 当标记的PDGF适体，其中检测所述标记的PDGF适体W诊断或评估个体的健康状况。可根 据待使用的成像方式选择使用的标记。
[0021] 在一些实施方案中，体外诊断方法包括使VEGF适体与疑似包含VEGF的样品接触。 在一些实施方案中，体内诊断方法包括向疑似患有VEGF-介导的疾病或病症的个体使用适 当标记的VEGF适体，其中检测所述标记的VEGF适体W诊断或评估个体的健康状况。可根 据待使用的成像方式选择使用的标记。
[0022] 在一些实施方案中，体外诊断方法包括使PDGF/VEGF适体构建体与疑似包含PDGF 和/或VEGF的样品接触。在另一方面，本公开提供体内诊断方法W诊断或评估个体的健康 状况，所述方法包括获得适当标记的PDGF/VEGF适体构建体、向疑似患有PDGF/VEGF-介导 的疾病或病症的个体注射标记的PDGF/VEGF适体构建体和检测标记的PDGF/VEGF适体构建 体。可根据待使用的成像方式选择使用的标记。
[0023] 在一些实施方案中，本发明提供包含PDGF适体和VEGF适体的适体构建体。
[0024] 在一些实施方案中，本公开提供W2.2A和2.3A的分辨率解析的两个离散共晶 结构，每个含有两个拷贝的结合至PDGF-BB的适体。
[00巧]在一些实施方案中，本公开提供主要通过疏水相互作用有效结合至蛋白的适体。
[0026] 在一些实施方案中，本公开提供适体-蛋白复合物，其中所述适体基本上通过疏 水相互作用结合至蛋白。
[0027] 在一些实施方案中，本公开提供能够与蛋白祀形成共晶复合物的适体，其中所述 复合物包含少于7个氨键。
[0028] 在一些实施方案中，本公开提供能够与蛋白祀形成共晶复合物的适体，其中所述 复合物包含涉及16个或更少核巧酸的假结结构域。
[0029] 在一些实施方案中，本公开提供能够结合蛋白祀的适体，其中所述适体结合至蛋 白祀且极性接触为每I(X)A2的界面面积小于或等于1，其中所述极性接触包括一个活多个 氨键和一种或多种电荷-电荷间的相互作用，并且其中所述界面面积是由适体占据的蛋白 表面积的部分。
[0030] 附图简述
[0031] 图1显示了（A) H解离速率修饰的适体和适体E10030的Kd值的测定；炬）由本文 描述的H个PDGF适体和乱序重排寡核巧酸抑制PDGFR目的PDGF-BB-刺激的磯酸化；（C)经 修饰的适体对比亲本适体4149-8_130的Kd比率，其中相对于亲本适体，特定的化-加核碱 基已被另一种修饰的加核碱基所替代（值为1表明修饰的适体与母本一样能较好地抑制 PDGFR目的磯酸化，而值〉1表明与母本相比，修饰的适体具有较少的潜在抑制活性）。
[0032] 图2显示了（A)适体4149-8_260分子内接触和适体-PDGF接触的表格；炬）非极 性分子内和适体-PDGF接触的代表；和（C)极性分子内和适体-PDGF接触的代表；如在实施 例2中所述。疏水性（非极性）相互作用包括相互作用（面对面和边对面芳族相互 作用）和范德华接触（vW)。如图B和C所示，极性相互作用包括氨键（虚线）和电荷-电 荷相互作用（实线。某些适体残基（如，dC4、dG6、dA9、dC10、dC12、dG13、dC14、dG15、dG22、 dC23和2' -0-甲基G24)参与规范的碱基配对和碱基堆积，并且挤出2' -0-甲基All。
[0033] 图3显示了（A)如由454焦磯酸测序和每个位置处的核巧酸频率W及六个克隆的 序列所确定的来自SELEX库的一组克隆的共有序列；和炬）基于亲本适体4149-8的修饰的 适体的Kd值，所述亲本适体如实施例1所示、所述来修饰。
[0034] 图4说明了如实施例2所述的PDGF-BB:4149-8_260复合物的某些立体观。
[0035] 图5显示了（A)在存在或不存在200nMtRNA的情况下，不同PDGF二聚体亚型 的各种适体的结合亲和性；和做成熟形式的PDGF-A、-B、-C和-D的氨基酸序列的比 对；如实施例3所描述。粗体显示的PDGF-A的氨基酸残基参与前肤结合，并且粗体显示 的PDGF-B的氨基酸残基参与PDGFR目结合（Shim等人，（2010)Proc.化tl. Acad. Sci. USA 107 (25) : 11307)。框阴影表明参与适体4149-8_260结合至PDGF-B链1 (深阴影）和PDGF-B 链2(浅阴影）的残基。
[003引 图6显示（A)通过用H碳C-3接头取代适体4149-8_38佛D ID N0:38)中每个指 出的位置制备的经修饰的适体的Kd比率，和PDGF-BB结合、PDGF-AB结合的Kd值，W及五个 基于亲本适体4149-8的经修饰的适体的细胞ICw ;和炬）基于亲本适体4149-8_130(SEQ ID NO: 130)的修饰的适体的Kd比率，其中相对于亲本适体，特定的化-加核碱基已被另一 种修饰的加核碱基所替代（数<1表明修饰的适体具有比母本适体更佳的亲和性，而数〉1 表明修饰的适体具有比母本适体更低的亲和性）；如实施例1所描述。
[0037]图 7 显示了（A)结合至适体 4149-8_260(SEQIDN0:211)的PDGF-BB同源二聚体 的连续剖面图；和炬）当结合至PDGF-B亚单位时，适体构象的示意图和结构示意图；如实 施例2所描述。根据Leontis和Westhof命名法，对非规范碱基对编号（LeontisN.B.等 人（2003)Curr.Opin.Struct.Biol. 13 (3) : 300)。深灰色=PDGF-B链 1 ;浅灰色=PDGF-B 链2 ;化=&1-加，化=Pe-加，Th=化-加。
[003引图8A-L说明了来自PDGF-BB: 4149-8_260适体复合物的晶体结构的PDGF适体的 某些结构特征，如实施例2所描述。图8A说明适体结构，显示了结构域、碱基配对和堆积相 互作用。小结的茎显著源自由于明显弯曲和螺旋角度W及螺旋欠旋所致的B型DNA。Bn20 是通过与U8堆积与5'茎相互作用的较链。图8B说明茎I(Sl)的端视图。图8C说明了SI 和L2的侧视图。经修饰的核巧酸与来自5'茎的化2、Bn7和化8 (其与来自小结的化16、 Pel7、化18和化20相互作用）形成了疏水簇。Bn8与化16和化20有边对面31 -JI相互 作用。非规范加-加碱基对使用与化20的醜胺接头的H-键合。图8D说明了Pe-加17和 Bn-加20之间的非规范碱基对的细节。图8E说明稳定小结Sl的碱基的芳族相互作用。图8F 说明在Sl和L2核巧酸中的C10-G15沃森-克里克对与A21形成的碱基H体。该碱基H体的 Leontis-Westhof分类是顺式沃森-克里克/沃森-克里克、反式糖边/Hoogsteen(Leontis N.B.等人（2003)Curr.Opin.Struct.Biol. 13:300)。碱基H体并非平面的，因为在A21 和 G15之间存在34°的螺旋奖状扭曲角度，W及在沃森-克里克碱基对之间相当弯曲和螺旋 奖状扭曲（表5)。图8G说明了残基mAll，即Ll和主链转弯中的单个挤出碱基的。图細 说明了S2的轴视图。图81说明了 5'茎基序的轴视图，其强调了显著偏离B型DNA。总体 Cl' -Cl'螺旋参数表明加-加对过度扭曲（40° )，从而导致主链中?124°的弯曲，其使 Bn-加1和化-加2之间变平至近乎线性（?172° )。Bn-加7-Bn-加8之间显著的径向位移和 Bn-加2-dA3之间近零位移导致碱基2-4和6-7之间更佳的堆积重叠。图8J说明了化-加2 和化-加8之间的非规范碱基对。图8K说明了由经修饰的核巧酸形成的结构域内连接。图 化说明了与化16和化20形成边对面31-JI相互作用的化8,所述31-JI相互作用限定了 结构域内接合处的拓扑结构。用iB-加(SEQIDN0:255)取代在适体4149-8_260(SEQID N0:211)的位置8处的Bn-加的有害影响在图8M和图8N中显示的空间填充图片中较为明 显。BnS巧M)能够与相邻的芳族基团进行能量有利的相互作用，并使得SOMAmer包装 得更紧。相反，iB8巧脚不是芳族的，并因此缺乏与相邻芳族基团进行堆积相互作用的 能力。此外，iB基团并非如此大并且在疏水簇中间留下了一个洞。
[0039] 图9说明了如实施例2所描述的某些蛋白-适体相互作用。在图9A中，Bn-加1 占据了同源二聚体界面处盐桥下的一个袋。Ul碱基使得氨键在Val39处连接到蛋白主链， 而予基环被夹在Arg56的脂肪族侧链和切s43-切巧2的二硫键之间。在图9B中，Bn2与 T巧40具有沿边的相互作用，并且安置在Asn55和Leu38的亚甲基侧链之间。图9C说明了 Bn7的芳族环折起对着Asn54和Asn55侧链脂肪族部分。图9D说明了Leu38和Ile75侧链 针对化-加8的予基环呈现了疏水表面W接触蛋白。图犯说明了化16与T巧40具有边对面 n-堆积，并与Arg73的脂肪族区域具有范德华接触。图9F说明了化17被Leu38、T巧40、 Arg73和Ile75的疏水性侧链所围绕。Arg73与化-加17的醜胺接头有氨键，和与适体主链 进行电荷-电荷相互作用。图9G说明了化18被Arg73、Ile75和化e84的疏水性侧链环绕。 图9H说明了蛋白和适体之间的堆积相互作用呈现于Pro82和化20及U8之间，并且化e84 与U20进行边对面接触。化20与Ile77和LysSO进行额外的疏水性接触。
[0040] 图10显示了传统适体的六种共晶结构（PDB10:乂胖。，3版0;凝血酶，391口间诚3 tRNA，IEXD;人IgG, 3AGV;MS2外壳蛋白，6MSF;NF-kB，100A)，分析其的极性接触（氨键+电 荷-电荷相互作用）的数量和接触表面面积。将所述结果对比针对该些六种适体-祀复合 物（深灰色条）和H种SOMAmer(浅灰色条）（包括PDGF-SL5 (4149-8_260)复合物和两种 未公开的SOMAmer-祀结构）报道的结合亲和性作图。通过线性回归分析六种传统适体的 极性接触数量和接触表面积之间的关系，并且99%的置信区间由图底部的灰色阴影表明。 图IOB说明了如由Pe-加17和Th-加18展现的PDGF-SOMAmer复合物的形状互补性。左边， PDGF链1显示为深灰色表面，Pe-加17和化-加18显示为空间填充表示。右边，与左图框相 同的视图，除了Pe-加17显示为条形表示。图IOC说明了Bn-加1与PDGF相互作用的细节， 其中PDGF链I显示为深灰色表面、PDGF链2显示为浅灰色表面和化-加I显示为空间空间 填充表示。
[0041] 图11显示了SL5和PDGFR目结合至PDGF-BB的比较。（A)受体共晶显示了PDGF 同源二聚体（链1，中度灰色；链2,浅灰色）和颜色为深灰色的受体胞外结构域（参见 Shim，A.H.等人，（2010)Proc.化tl.Acad.Sci.USA107 (25): 11307)。炬）PDGF同源二聚 体（链1，中度灰色；链2,浅灰色）和SL5 (深灰色）的复合物。（C)PDGF-B成熟形式的氨 基酸序列。框阴影表明与4149-8_260、PDGFR目或该两者接触的残基。与4149-8_260有 4A接触但不接触PDGFR目的PDGF残基加框但无阴影。与PDGFR目有4A接触但不接触 4149-8_260的PDGF残基加框且具有深灰色阴影。与4149-8_260和PDGFR目两者都有4A 接触的PDGF残基加框且具有中度灰色阴影。
[0042] 图12说明可包含至适体（诸如慢解离速率适体）中的某些示例性C-5嚼巧修饰。
[0043] 图13显示了如实施例4所描述用SOMAmer4149-8_379 (标记为地-4149-8_379) 或5'氨基-接头修饰的SOMAmer4149-8_379 (标记为N-4149-8_379)在Hs27成纤维细胞 中抑制PDGF-BB-诱导的PDGFR目磯酸化的代表性曲线。
[0044] 图14显示了如实施例5所描述通过454焦磯酸测序所确定的来自沈LEX库的一 组PDGF-结合克隆的共有序列，和每个位置处的核巧酸频率。
[0045] 图15显示了相对于亲本适体基于亲本适体4867-31_143的经修饰的适体的Kd比 率，其中特别的Nap-加核碱基已被另一经修饰的加核碱基所替代（数量<1表明经修饰的 适体的亲和性比母本适体高，和数量〉1表明经修饰的适体的亲和性比母本适体低）；如实 施例7所描述。
[0046] 图16显示了如实施例7所描述通过454焦磯酸测序所确定的来自沈LEX库的一 组VEGF-结合克隆的共有序列，和每个位置处的核巧酸频率。
[0047]图 17 显示了用VEGF-121 或VEGF-165 和VEGF适体 4867-31_43 与 4867-31_192 刺激的人厮静脉内皮细胞中的百分比VEGFR2磯酸化，如实施例9所描述。
[0048] 图18显示了（A)在Hs27成纤维细胞中用PDGF适体4149-8_379(开环）和PDGF/ VEGF适体构建体4149-8_401(闭环）抑制PDGF-诱导的PDGFR目磯酸化；和炬）在HUVEC 中用VEGF适体4867-31_192 (开环）和PDGF/VEGF适体构建体4149-8_401 (闭环）抑制 VEGF-诱导的VEGFR2磯酸化；如实施例11所描述。
[0049] 图19显示了在（A)涂覆有VEGF的添加了生物素化PDGF的微量滴定板上，和 炬）在涂覆有PDGF的添加了生物素化VEGF的微量滴定板上，通过PDGF/VEGF适体构建体 SL1012 (20kDaPEG-N-4149-8_401)同时结合PDGF和VEGF，如实施例 12 所描述。
[0050] 图20显示了如实施例12所描述在添加了生物素化VEGF的涂覆有PDGF的微 量滴定板上通过PDGF/VEGF适体构建体（A)SLlO12 (20kDaPEG-N-4149-8_401)和炬） SLlOl3 (40kDA阳G-N-4149-8-401)同时结合PDGF和VEGF。
[0051] 图21显示了如实施例12所描述在（A)添加了生物素化PDGF的涂覆有VEGF的 微量滴定板上，和在炬）添加了生物素化VEGF的涂覆有PDGF的微量滴定板上，通过各种 PDGF/VEGF适体构建体同时结合PDGF和VEGF。
[00閲图22显示了（A)传统适体（菱形）和SOMAmer(环形）的极性接触的数量（定义 为氨键和电荷-电荷相互作用的和）对比界面面积的曲线（线性回归拟合的R2 = 0. 91， 斜率为0. 016 ;虚线表示该趋势的99%置信区间，SOMAmer落在那些边界外），炬）传统适 体（菱形）和SOMAmer(环形）的自由能结合对比极性接触的曲线（线性回归拟合的R2 = 0. 64,斜率为0. 073)，和（C)显示六种先前适体-蛋白晶体结构和H种SOMAmer-蛋白晶体 结构（包括PDGF-BB:4149-8_260)的各种热力学性质和接触特征的表，如实施例2所描述。 似结合至蛋白碑!的适体和SOMAmer的相互作用特征（数据参考；(a)Convery等人（1998) 化t.Struct.Biol. 5 (2) : 133 ;化）Nomura等人（2010)NucleicAcidRes. 38 (21) : 7822 ;(C) Pagano等人（2008)Biophys.J. 94 (2) : 562 ; (d)Huang等人（2003)Proc.化1:1.Acad.Sci. USA100(16) :9268 ;(e)Huang等人（2009)结构 17 (11) :1476 ;(f)Bullock等人（2000)化t. Struct.Biol. 7化）：497。自由能计算由测量的针对SOMAmer的结合亲和性或使用W下温度 的公开的Kd值来确定；MS2、凝血酶、NFkB、vWF和GlnRs,室温（296K) ;IgG，298K;S0MAmer， 310K。SOMAmer显示了W下趋势；较高的结合亲和性；对于六种适体结合的平均自由能 或-AG值为11.4±1.3kcal/mol，和对于H种S0MAmer该值为14.3kcal/mol±0.8kcal/ mol。在PyMOL中，确定每个配体的4A内的蛋白接触原子。用PISA(适体）（Krissinel等人 (2007)J.Mol.Biol. 372 (3):774)或PyMOL(SOMAmer)值eLano(2002)ThePymolMolecular GraphicsSystem,DelanoScientific,SanCarlos,CA)进行界面面积计算。在晶体学评 估的相互作用的该相对小的数据集中，相较于SOMAmer的0. 16 + 0. 04kcal/mol/非氨接触 原子，适体W0. 21 + 0.Hkcal/mol/非氨接触原子的平均配体效率连接它们的祀。每界面 面积的结合自由能也类似，对于适体其平均值为0.017生0.009kcal.mor-i.A--和对于SOMAmer其平均值为化012生0.001kcahnori.A-2。就由表中的值计算出的每极性接触 的结合自由能值而言，SOMAmer的（平均为1. 75 + 0. 36kcal/mol/极性接触）约为适体的 (0. 89 + 0. 56kcal/mol/ 极性接触）两倍。
[0053] 详述
[0054] 现在将详细参考本发明的代表性实施方案。尽管将连同列举的实施方案一起描述 本发明，将理解本发明并非意在限制于那些实施方案。相反，本发明意在覆盖所有可包括如 权利要求所定义的本发明范围内的改变、修饰和等同物。
[00巧]本领域的技术人员将认识类似于本文描述的那些方法和材料的许多方法和材料， 其可用于本发明的实践中并在本发明实践的范围内。本发明不W任何方式局限于所描述的 方法和材料。
[0056] 除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通 技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的那些方法、设备和材料类似或等同的任 何方法、设备和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法、设备和材料。
[0057] 本公开中所有公布、公开的专利文件和引用的专利申请表明了本公开所属领域技 术人员的水平。本文所有公布、公开的专利文件和引用的专利申请在此通过引用并入，就如 同每个单独的公布、公开的专利文件或专利申请特别和各自表明通过引用并入一般。
[0058] 如本公开所用，包括随附的权利要求书，除非上下文另外明确指定，否则单数形式 的"一个/ 一种（a)"、"一个/ 一种（an)"和"该（the)"包括复数指示物，并可与"至少一 个/ 一种"和"一个或多个/ 一种或多种"互换使用。因此，提及的"适体"包括适体等的混 合物。
[0059] 如本文所用，术语"约"表示数值不显著的修改或改变，使得数值所涉及的物品的 基础功能不改变。
[0060]如本文所用，术语"包含/包括（comprises)"、"包含/包括（comprising)"、"包括 (includes)"、"包括（including)"、"含有（contains)"、"含有（containing)"及其任何变 体意在涵盖非排他性的包含，使得包括/包含、包括或含有要素或要素列表的工艺、方法、 由工艺得到的产品或物质组合物不仅包括那些要素而且还包括未明确列出或此类工艺、方 法、由工艺得到的产品或物质组合物固有的其他要素。
[0061] 如本文所用，术语"核巧酸"是指核糖核巧酸或脱氧核糖核巧酸或其修饰形式，W 及其类似物。核巧酸包括W下种类，包括嘿岭（如，腺嘿岭、次黄嘿岭、鸟嘿岭及它们的衍生 物和类似物）W及嚼巧（如，阿糖胞巧、尿嚼巧、胸腺嚼巧及它们的衍生物和类似物）。
[0062] 如本文所用，"核酸"、"寡核巧酸"和"多核巧酸"可互换使用W指代核巧酸的聚合 物，并包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体W及该些种类的核酸、寡核巧酸和多核巧酸的修饰，其 中包括了各种实体或部分与核巧酸单元在任何位置处的连接。术语"多核巧酸"、"寡核巧 酸"和"核酸"包括双链或单链分子W及H螺旋分子。核酸、寡核巧酸和多核巧酸是比术语 适体更宽泛的术语，并因此术语核酸、寡核巧酸和多核巧酸包括为适体的核巧酸的聚合物， 但术语核酸、寡核巧酸和多核巧酸并不限于适体。
[0063]如本文所用，术语"修饰（modify)"、"修饰的（modified)"、"修饰modification)"及 其任何变形，当用于指代寡核巧酸时，意指寡核巧酸的四种组成核巧酸碱基（即，A、G、T/U 和C)是天然存在的核巧酸的类似物或醋。在一些实施方案中，修饰的核巧酸赋予寡核巧酸 对核酸酶的耐受性。在一些实施方案中，修饰的核巧酸导致适体与蛋白祀的主要疏水相互 作用，进而产生高结合效率和稳定共晶复合物。C-5位置处存在取代的嚼巧是经修饰的核巧 酸的实例。修饰可包括主链修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合，诸如异碱基（isobases) 异胞巧和异脈等。修饰还可包括3'和5'修饰，诸如加帽。其它修饰可包括用类似物取代一 种或多种天然存在的核巧酸、核巧酸间修饰（诸如，例如那些用不带电荷的键进行的修饰 (如，麟酸甲醋、磯酸H醋、氨基磯酸醋、氨甲酸醋等）和那些用带电荷的键进行的修饰（如， 硫代磯酸醋、二硫代磯酸醋等）、那些用嵌入剂进行的修饰（如，吓巧、补骨脂素等）、那些含 有馨合剂的修饰（如，金属、放射性金属、测、氧化金属等）、那些含有焼化剂的修饰和那些 用经修饰的键进行的修饰（如，a-异头核酸等）。此外，一般存在于核巧酸糖部分上的任 何轻基可被麟酸基或磯酸基替代；被标准保护基团保护；或被活化W制备额外的与额外的 核巧酸或固体载体的键。5'和3'端OH基可被磯酸化或被胺、约1至约20个碳原子的有 机加帽基团部分、在一些实施方案中范围为约10至约SOkDa的聚己二醇（PEG)聚合物、在 一些实施方案中范围为约20至约60kDa的PEG聚合物或其它亲水性或疏水性生物聚合物 或合成聚合物所取代。在一些实施方案中，修饰是在嚼巧的C-5处的修饰。该些修饰可通 过直接在C-5位置处的醜胺键或通过其它类型的键产生。
[0064]多核巧酸还可含有本领域通常已知的类似形式的糖类；核糖或脱氧核糖（包括 2' -0-甲基核糖、2' -0-帰丙基核糖、2' -氣核糖或2' -叠氮基核糖）、碳环糖类似物、a-异 头碳糖、差向异构糖（诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖）、化喃糖、巧喃糖、景天庚丽糖、非环状 类似物和无碱基核巧类似物（诸如甲基核糖核巧）。如上所指出，一个或多个磯酸二醋键可 被替代性的连接基团所替代。该些可替代的连接基团包括其中磯酸醋被W下代替的实施方 案；P(O)S("硫代醋"）、P(S)S("二硫代醋"）、（O)NRs("醜胺醋"）、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("甲缩酵"），其中每个R或R'独立地为H或经取代或未取代的焼基（1-20个C)(任选 地含有離（-〇-)键）、芳基、帰基、环焼基、环帰基或芳焼基。并非多核巧酸中的所有键必须 相同。取代类似形式的糖、嘿岭和嚼巧可能在设计成品中是有利的，可替代的主链结构（像 聚醜胺主链）也可有利。
[0065] 如本文所用，术语"核酸酶"是指能够切割寡核巧酸的核巧酸亚单位之间的磯酸二 醋键的酶。如本文所用，术语"内切核酸酶"是指在寡核巧酸内部位点处切割磯酸二醋键的 酶。如本文所化术语"外切核酸酶"是指切割连接寡核巧酸的末端核巧酸的磯酸二醋键的 酶。生物体液通常含有内切核酸酶和外切核酸酶的混合物。
[0066] 如本文所用，术语"核酸酶耐受的"和"核酸酶耐受性"是指寡核巧酸作为内切核 酸酶或外切核酸酶的底物的能力降低，使得当与此类酶接触时，所述寡核巧酸既不降解也 不比由未修饰的核巧酸组成的寡核巧酸降解得更慢。
[0067] 如本文所用，术语"C-5修饰的嚼巧"是指在C-5位置处具有修饰的嚼巧，包括但不 限于那些在图12中说明的部分。C-5修饰的嚼巧的实例包括于美国专利号5, 719, 273和美 国专利号5, 945, 527中描述的那些。C-5修饰的实例包括脱氧尿巧在C-5位置处的取代， 取代基独立选自如下立即说明的基团；予基駿基醜胺（可替代为予基氨基撰基）炬n)、蔡基 甲基駿基醜胺（可替代为蔡基甲基氨基撰基）（Nap)、色氨基駿基醜胺（可替代为色氨基撰 基）订巧）、苯己基駿基醜胺（可替代为苯己基氨基撰基）（Pe)、硫代苯甲基駿基醜胺（可替 代为硫代苯甲基氨基撰基）（Th)和异下基駿基醜胺（可替代为异下基氨基撰基）（iBu)。
【权利要求】
1?一种包括以下序列的适体：5' -NZVSLnS'V'ZACNNfCGZZZAZAGCG-3'（SEQID NO:500), 其中 V选自A、C或G; V'选自C、G或Z，其中V'与V互补； S和S'独立选自C或G，其中S和S'彼此互补； N独立选自任何天然存在或经修饰的核苷酸； Z独立选自经修饰的嘧啶； L是选自任何天然存在或经修饰的核苷酸的间隔基、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；n是0至20 ; m是0至20 ;且 其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
2. 根据权利要求1所述的适体，其包括序列： 5，-ZZVSLnS'V'ZACNN^GCGZZZAZAGCG-3' (SEQIDN0:501)， 其中 V选自A、C或G; V'选自C、G或Z，其中V'与V互补； S和S'独立选自C或G，其中S和S'彼此互补； N独立选自任何天然存在或经修饰的核苷酸； Z独立选自经修饰的嘧啶； L是选自任何天然存在或经修饰的核苷酸的间隔基、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；n是0至20 ; m是0至20 ;且 其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
3. 根据权利要求1所述的适体，其包括序列： 5'-ZZVCLnGV/ZACNMGCGZZZAZAGCG-3'(SEQIDNO：502), 其中 V选自A、C或G; V'选自C、G或Z，其中V'与V互补； N独立选自任何天然存在或经修饰的核苷酸； M选自C或A; Z独立选自经修饰的嘧啶； L是选自经取代或未取代的C2-C2(l接头和经修饰或未修饰的核苷酸的间隔基；任何天 然存在或经修饰的核苷酸、烃接头、聚乙二醇接头或其组合； n是0至20 ;且 其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
4. 根据权利要求3所述的适体，其包括序列： 5' -ZZACLnGZZACACGCGZZZAZAGCG-3'(SEQIDNO：503), 其中 Z独立选自经修饰的嘧啶；且 L是选自任何天然存在或经修饰的核苷酸的间隔基、烃接头、聚乙二醇接头或其组合；n是0至20 ;且 其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
5. 根据权利要求4所述的适体，其包括序列： 5'-ZZACGACZACGZZACACGCGZZZAZAGCG-3/(SEQIDNO：504), 其中 Z独立选自经修饰的嘧啶；且其中任选地包含一种或多种核苷酸插入。
6. -种特异性结合TOGF的适体，其中所述适体包含至少一种经修饰的核苷，所述核苷 包含疏水性核碱基修饰，其中所述适体以小于10nM的亲和性结合TOGF，并且其中所述适体 与PDGF适体 4149-8_260(SEQIDNO211)竞争结合PDGF。
7. 根据权利要求6所述的适体，其中所述疏水性核碱基修饰是经修饰的嘧啶。
8. 根据权利要求7所述的适体，其中所述适体包含至少两个、至少三个、至少四个、至 少五个或至少六个经修饰的嘧啶。
9. 根据权利要求7或权利要求8所述的适体，其中每个经修饰的嘧啶独立选自 5-(N-苄基羧基酰胺）-2'-脱氧尿苷（BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺）-2'-0-甲基尿苷、 5-(N-苄基羧基酰胺）-2'_氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺）-2'_脱氧尿苷（PedU)、 5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2' -脱氧尿 苷（iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2'-0-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2'-氟尿 苷、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿 苷、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2'_氟尿苷、5-(N-[l-(3-三甲铵）丙基]羧基酰胺）-2'_脱 氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰 胺）-2' -0-甲基尿苷、5- (N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -氟尿苷和5- (N- [ 1- (2, 3-二羟丙基）] 羧基酰胺）_2'_脱氧尿苷）。
10. 根据权利要求6至9中任一项所述的适体，其中所述适体包括序列： 5'-ZABLpGYZABKqGCGZZYDYAG-3'(SEQIDNO： 505), 其中每个Z独立为经修饰的嘧啶； 每个B独立选自C和经取代或未取代的C2-C1(l接头； 每个L独立选自经取代或未取代的C2-C1(l接头、聚乙二醇接头和经修饰或未修饰的核 苷酸，其中P是1至10; 每个Y独立选自经修饰或未修饰的嘧啶； 每个K独立选自经取代或未取代的C2-C1(l接头、聚乙二醇接头和经修饰或未修饰的核 苷酸，其中q是1至5 ;且 D选自A和经取代或未取代的C2-C1(l接头。
11. 根据权利要求10所述的适体，其包括序列： 5'-XZABLpGYZABKqGCGZZYDYAGBE-3'(SEQIDNO： 506), 其中X选自经修饰或未修饰的嘧啶和经取代或未取代的C2-C1(l接头，或者不存在；且E选自G和经取代或未取代的C2-C1(l接头，或者不存在。
12. 根据权利要求10或权利要求11所述的适体，其中每个经修饰的嘧啶独立选 自5-(N-苄基羧基酰胺）-2'-脱氧尿苷（BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺）-2'-0-甲基尿 苷、5-(N-苄基羧基酰胺）-2' -氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（PedU)、 5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2' -脱氧尿 苷（iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2' -氟尿 苷、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿 苷、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2'_氟尿苷、5-(N-[l-(3-三甲铵）丙基]羧基酰胺）-2'_脱 氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰 胺）-2' -0-甲基尿苷、5- (N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -氟尿苷和5- (N- [ 1- (2, 3-二羟丙基）] 羧基酰胺）_2'_脱氧尿苷）。
13. 根据权利要求10至12中任一项所述的适体，其中每个经取代或未取代的C2-C1(l接 头是经取代或未取代的C2-C8接头、经取代或未取代的C2-C6接头、经取代或未取代的C2-C5 接头、经取代或未取代的C2-C4接头或经取代或未取代的C3接头。
14. 根据权利要求10至13中任一项所述的适体，其中至少一个L是聚乙二醇接头且p 是 1、2、3、4、5 或 6。
15. 根据权利要求10至14中任一项所述的适体，其中至少一个L是六乙二醇接头。
16. 根据权利要求14或权利要求15所述的适体，其中p是1、2或3。
17. 根据权利要求10至16中任一项所述的适体，其中至少一个K是聚乙二醇接头且q 是1或2。
18. 根据权利要求10至17中任一项所述的适体，其中至少一个K是六乙二醇接头。 20. 19.根据权利要求10至18中任一项所述的适体，其中q是1。根据权利要求10至 18中任一项所述的适体，其中至少一个K是经取代或未取代的C2-C1(l接头且q是1或2。
21. 根据权利要求20所述的适体，其中所述经取代或未取代的C2-C1(l接头是经取代或 未取代的(：2-(：8接头、经取代或未取代的C2-C6接头、经取代或未取代的C2-C5接头、经取代或 未取代的C2-C4接头或经取代或未取代的C3接头。
22. 根据权利要求10至21中任一项所述的适体，其中至少一个L是经取代或未取代的 C2_C1Q 接头且p是 1、2、3、4、5、6、7 或 8。
23. 根据权利要求22所述的适体，其中所述经取代或未取代的C2-C1(l接头是经取代或 未取代的(：2-(：8接头、经取代或未取代的C2-C6接头、经取代或未取代的C2-C5接头、经取代或 未取代的C2-C4接头或经取代或未取代的C3接头。
24. -种特异性结合TOGF的适体，其中所述适体包含以下序列： 5'-ACALnZGZAZGLmZLZ-3'(SEQIDNO. 512)； 其中每个Z独立为经修饰的嘧啶； 每个L独立选自经取代或未取代的C2-C5(l接头、聚乙二醇接头和经修饰或未修饰的核 苷酸； n是1至5 ;且 m是1至10。
25. 根据权利要求24所述的适体，其中每个Z独立选自5-(N-苄基羧基酰胺）-2'-脱 氧尿苷（BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺）-2' -氟尿 苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺）-2' -脱 氧尿苷（ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2'_脱氧尿苷（iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰 胺）-2' -0-甲基尿苷、5- (N-异丁基羧基酰胺）-2' -氟尿苷、5- (N-色氨基羧基酰胺）-2' -脱 氧尿苷（TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -氟 尿苷、5-(N-[l-(3-三甲铵）丙基]羧基酰胺）-2'_脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基 酰胺）-2' -脱氧尿苷（NapdU)、5- (N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿苷、5- (N-萘基甲基 羧基酰胺）-2' _氟尿苷和5-(N-[ 1-(2, 3-二羟丙基）]羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷）。
26. 根据权利要求25所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或每 个Z是5-(N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（NapdU)。
27. 根据权利要求24至26中任一项所述的适体，其中n是1、2、3或4 ;且其中m是1、 2、3、4、5、6、7、8 或 9。
28. 根据权利要求1至27中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至 少四个或至少五个核苷包含2' -〇Me。
29. 根据权利要求1至28中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、至 少四个或至少五个核苷间键是硫代磷酸酯键。
30. 根据权利要求1至29中任一项所述的适体，其中所述适体以小于10nM、小于5nM、 小于2nM或小于InM的亲和性结合TOGF。
31. 根据权利要求1至30中任一项所述的适体，其中所述适体抑制TOGF-介导的TOGF 受体磷酸化。
32. -种以小于10nM、小于5nM、小于2nM或小于InM的亲和性结合VEGF-121的适体， 其中所述适体包含至少一个经修饰的核苷，所述核苷包含疏水性核碱基修饰。
33. 根据权利要求32所述的适体，其中所述疏水性核碱基修饰是经修饰的嘧啶。
34. 根据权利要求33所述的适体，其中所述适体包含至少两个、至少三个、至少四个、 至少五个或至少六个经修饰的嘧啶。
35. 根据权利要求33或权利要求34所述的适体，其中每个经修饰的嘧啶独立选 自5-(N-苄基羧基酰胺）-2'_脱氧尿苷（BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺）-2'-0_甲基尿 苷、5-(N-苄基羧基酰胺）-2' -氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（PedU)、 5-(N-硫代苯甲基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2' -脱氧尿 苷（iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2'-0-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2'-氟尿 苷、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿 苷、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2'_氟尿苷、5-(N-[l-(3-三甲铵）丙基]羧基酰胺）-2'_脱 氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰 胺）-2' -0-甲基尿苷、5- (N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -氟尿苷和5- (N- [ 1- (2, 3-二羟丙基）] 羧基酰胺）_2'_脱氧尿苷）。
36. 根据权利要求33至35中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、 至少四个、至少五个或至少六个经修饰的嘧啶是5-(N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷 (NapdU)。
37. 根据权利要求32至36中任一项所述的适体，其中所述适体与适体4867-31_192竞 争结合VEGF-121。
38. 根据权利要求32至37中任一项所述的适体，其中所述适体包括以下序列： 5' -GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3', 其中每个Z是经修饰的嘧啶； Q选自任何经修饰或未修饰的核苷酸和经取代或未取代的C2-C5(l接头，或者不存在； 每个E独立选自G和经取代或未取代的C2-C5(l接头； D选自A和经取代或未取代的C2-C5(l接头；且R选自任何经修饰或未修饰的核苷酸和经取代或未取代的C2-C5(l接头。
39. 根据权利要求37所述的适体，其中所述适体包括选自以下的序列： 5' -CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZG-3'； 5' -GZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGC-3'； 5，-CGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-S';和 5' -CVGZZQAAEZECZZEZDRGAZZZAAAZGG-3'。
40. 根据权利要求37或权利要求38所述的适体，其中每个Z独立选自5-(N-苄基羧 基酰胺）-2'-脱氧尿苷（BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺）-2'-0-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基 酰胺）-2' _氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（PedU)、5-(N-硫代苯甲基羧基 酰胺）_2' _脱氧尿苷（ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2' -脱氧尿苷（iBudU)、5-(N-异丁 基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺）-2' -氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰 胺）-2' _脱氧尿苷（TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰 胺）_2'_氟尿苷、5-(N-[l-(3-三甲铵）丙基]羧基酰胺）-2'_脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘 基甲基羧基酰胺）-2' _脱氧尿苷（NapdU)、5-(N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -0-甲基尿苷、 5_ (N-萘基甲基羧基酰胺）-2' -氟尿苷和5- (N- [ 1- (2, 3-二羟丙基）]羧基酰胺）-2' -脱氧 尿苷）。
41. 根据权利要求37至39中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少 三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个Z是5-(N-萘基甲基羧基酰 胺）-2' -脱氧尿苷（NapdU)。
42. 根据权利要求37至40中任一项所述的适体，其中每个经取代或未取代的C2-C5(l接 头独立选自经取代或未取代的C2-C2(l接头、经取代或未取代的C2-C1(l接头、经取代或未取代 的(：2-(： 8接头、经取代或未取代的C2-C6接头、经取代或未取代的C2-C5接头、经取代或未取代 的C2-C4接头和经取代或未取代的C3接头。
43. 根据权利要求42所述的适体，其中每个经取代或未取代的C2-C5(l接头是经取代或 未取代的〇2-(：1(|接头。
44. 根据权利要求43所述的适体，其中每个经取代或未取代的C2-C1(l接头是经取代或 未取代的(：2-(：8接头、经取代或未取代的C2-C6接头、经取代或未取代的C2-C5接头、经取代或 未取代的C2-C4接头或经取代或未取代的C3接头。
45. 根据权利要求32至39中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、 至少四个或至少五个核苷包含2' -OMe。
46. 根据权利要求32至45中任一项所述的适体，其中至少一个、至少两个、至少三个、 至少四个或至少五个核苷间键是硫代磷酸酯键。
47. 根据权利要求32至46中任一项所述的适体，其中所述适体以小于10nM、小于5nM、 小于2nM或小于InM的亲和性结合VEGF-121。
48. 根据权利要求32至47中任一项所述的适体，其中所述适体抑制VEGF-121-介导的 VEGF受体磷酸化。
49. 一种表10至14中任一个中显示的适体，其以小于10nM的亲和性结合VEGF-121。
50. -种适体构建体，其包含选自根据权利要求1至31中任一项所述的适体的第一适 体和选自根据权利要求32至49中任一项所述的适体的第二适体。
51. 根据权利要求50所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体非共价连 接。
52. 根据权利要求50所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体共价连 接。
53. 根据权利要求50至52中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体能够同时 结合PDGF和VEGF-121。
54. 根据权利要求50至53中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体以小于 10nM的亲和性结合TOGF。
55. 根据权利要求50至53中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体以小于 10nM的亲和性结合VEGF-121。
56. -种包含第一适体和第二适体的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体 各自独立地选自根据权利要求1至31中任一项所述的适体。
57. 根据权利要求56所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体相同。
58. 根据权利要求56所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体不同。
59. 根据权利要求56至58中任一项所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二 适体非共价连接。
60. 根据权利要求56至58中任一项所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二 适体共价连接。
61. 根据权利要求56至60中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体能够同时 结合两个TOGF单体。
62. 根据权利要求56至61中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体以小于 10nM的亲和性结合TOGF。
63. -种包含第一适体和第二适体的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体 各自独立选自根据权利要求32至49中任一项所述的适体。
64. 根据权利要求63所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体相同。
65. 根据权利要求63所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二适体不同。
66. 根据权利要求63至65中任一项所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二 适体非共价连接。
67. 根据权利要求63至65中任一项所述的适体构建体，其中所述第一适体和所述第二 适体共价连接。
68. 根据权利要求63至67中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体能够同时 结合两个VEGF单体。
69. 根据权利要求63至68中任一项所述的适体构建体，其中所述适体构建体以小于 10nM的亲和性结合VEGF。
70. -种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至49中任一项所述的适体和药 学上可接受的载体。
71. 根据权利要求70所述的药物组合物，其包含根据权利要求1至31中任一项所述的 第一适体和根据权利要求32至49中任一项所述的第二适体。
72. -种药物组合物，其包含根据权利要求49至69中任一项所述的适体构建体和药学 上可接受的载体。
73. 根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于玻璃 体内注射。
74. -种用于治疗黄斑变性的方法，其包括向患有黄斑变性的受试者施用治疗有效量 的根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。
75. -种预防黄斑变性的方法，其包括向处于患有黄斑变性的风险的受试者施用治疗 有效量的根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。
76. -种治疗眼科病状的方法，其包括向患有眼科病状的受试者施用治疗有效量的根 据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。
77. 根据权利要求76所述的方法，其中所述眼科病状选自视网膜炎、黄斑变性、脉络膜 炎、视网膜病变、高血压性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、慢性干眼、AIDS-相关视力减 退、弱视、偏盲、视网膜静脉闭塞、沙眼、圆锥角膜、脉络膜视网膜炎症、中心性浆液性视网膜 病、葡萄膜炎、视网膜营养不良症、水肿、青光眼和白内障。
78. 根据权利要求74或权利要求75所述的方法，其中所述黄斑变性是年龄相关性黄斑 变性。
79. 根据权利要求78所述的方法，其中所述黄斑变性是干性年龄相关性黄斑变性或湿 性年龄相关性黄斑变性。
80. -种治疗纤维化的方法，其包括向患有纤维化的受试者施用治疗有效量的根据权 利要求70至72中任一项所述的药物组合物。
81. 根据权利要求80所述的方法，其中所述纤维化选自肺纤维化、肾纤维化和囊性纤 维化。
82. -种治疗心血管疾病的方法，其包括向患有心血管疾病的受试者施用治疗有效量 的根据权利要求69至72中任一项所述的药物组合物。
83. 根据权利要求82所述的方法，其中所述心血管疾病选自动脉粥样硬化、再狭窄、心 脏肥大相关的病状和血管病症。
84. -种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的受试者施用治疗有效量的根据权利要 求69至72中任一项所述的药物组合物。
85. 根据权利要求84所述的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、 结肠癌和直肠癌、淋巴瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、白血病和甲状腺癌
【文档编号】C12Q1/68GK104379764SQ201380026124
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年3月28日 优先权日:2012年3月28日
【发明者】T·C·亚尔维斯, J·C·罗洛夫, A·D·热利纳, C·张, D·W·德罗莱, S·M·沃, N·亚尼奇 申请人:私募蛋白质体公司