用于艾美尔属球虫病毒的简并引物rt-pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开一种用于艾美尔属球虫病毒的简并引物RT-PCR检测方法，提供了一对全新的简并引物，应用反转录和降落PCR技术对艾美尔属球虫病毒进行特异性的简并引物RT-PCR扩增。本发明简并引物RT-PCR方法可有效检测柔嫩艾美尔球虫病毒和斯氏艾美尔球虫病毒存在，并且专一性好(电泳条带单一)。为首次用于艾美尔属球虫病毒检测的方法，可以快速准确的识别待检球虫样本中是否含有携病毒的虫株。
【专利说明】用于艾美尔属球虫病毒的简并引物RT-PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明公开一种用于艾美尔属球虫病毒的简并引物RT-PCR检测方法，提供了一对全新的简并引物，应用反转录和降落PCR技术对艾美尔属球虫病毒进行特异性的简并引物RT-PCR扩增。所应用的技术为简并引物设计、反转录、降落PCR(TD-PCR)，属于分子生物学检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]鸡球虫病(Coccidiosis)是由一种或多种艾美尔属球虫引起，且危害十分严重的寄生虫病。作为一种细胞内寄生虫,艾美尔球虫导致全球养禽业的巨大损失,每年大约80亿美元的损失。双链RNA病毒首先在真菌中于1948年发现，此后又在原虫中发现了 dsRNA病毒。原虫病毒是一类存在于原虫体内的病毒粒子，大多为双链RNA (dsRNA)病毒,球形20面体，直径30-50nm，具有RNA依赖RNA聚合酶活性。在球虫病毒研究方面，已报道在柔嫩艾美尔球虫、斯氏艾美尔球虫、尼氏艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫以及堆型艾美尔球虫内存在病毒样粒子或病毒样核酸。但目前关于球虫病毒的许多特性尚不十分清楚。
[0003]在艾美尔球虫的研究中，发现球虫的致病力与其是否携带病毒存在相关性。目前对于艾美尔球虫病毒研究刚刚起步，大量的研究还集中在对病毒样粒子的电镜观察。目前对球虫病毒的检测方法尚无标准。传统的方法是电镜观察病毒样粒子的存在，然而此方法成本高，而且检出率低。另一种方法是检测病毒核酸，但由于自然感染病例往往是混合感染，携带病毒的虫株比例低，特别是在有其他生物材料污染的情况下其检测的灵敏度非常低，而且误检率高，对结果的判断没有具体标准。因此开发一种灵敏的、准确的、成本低以及对所有艾美尔属球虫病毒进行通用性检测的方法，是非常有必要的。
[0004]简并引物PCR是因为遗传密码具有简并性，大部分的氨基酸都有不止一个密码子来编码，而且同源同工蛋白往往在一些重要区段具有较高的氨基酸序列保守性，所以对未知目的基因可以通过已知的多个同源同工基因的保守区大概推测，并以此设计具有简并位点的简并引物来进行PCR扩增。简并引物PCR因此具有同源同工基因扩增的一定的通用性。简并引物的设计是简并引物PCR成功与否的关键步骤。要获得可供检测的目的核酸片段，必须使用RT-PCR的方法将RNA扩增为DNA。传统反转录反应针对ssRNA采用单一的下游引物进行。目前尚无用于检测艾美尔属球虫病毒的简并引物RT -PCR检测方法的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是公开一种用于艾美尔属球虫病毒的简并引物RT-PCR检测方法，为简并引物RT-PCR检测方法，解决了目前尚无检测艾美尔球虫属病毒方法的难题，该方法应用高保守区域的低变异特性，使用简并引物对艾美尔属球虫病毒进行检测，达到特异性与通用性相结合，为检测艾美耳属球虫病毒提供了新的可行的办法。
[0006] 包括以下步骤:1)在STE缓冲液的条件下，使用苯酚氯仿对经过液氮研磨的球虫材料进行抽提，获取总核酸，总核酸中的DNA经由DNaseI消化处理，获取RNA的粗提产物；
2)该粗提产物直接作为模板进行反转录(RT)，因为球虫病毒基因组为dsRNA，所以反转录使用CF和CR两条简并引物同时进行；
上游引物:CF:5’ -CBGCIGCTBYIGTVGCH-3’
下游引物:CR:5’ -GTVGRCTCDATCCARAASHAD-3’
以上CF引物使用了 I (次黄嘌呤)，代替N (N=A/T/C/G)；
其中兼并碱基代码:
R=A/G、S=G/C、Y=C/T、V=A/G/C、H=A/C/T、D=A/G/T、B=G/C/T、N=A/G/C/T ；
3)经由反转录所得到的cDNA使用PCR方法扩增为dsDNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0007]由于dsRNA的反转录较为困难，通过对比使用多个公司的多种反转录酶，最后确定了 PrimeScript ? Reverse Transcriptase (2680Q)反转录酶，PCR 使用 TaKaRa LA Taq(RR02MQ)核酸聚合酶。本发明所使用的各种试剂价格低廉，同时可有效扩增目的片段，扩增产物专一性好，电泳结果容易判断。
[0008]本发明的积极效果在于:简并引物RT-PCR方法可有效检测柔嫩艾美尔球虫病毒和斯氏艾美尔球虫病毒存在，并且专一性好，电泳条带单一；通用性好，可对艾美尔属球虫病毒进行通用检测；灵敏 度高，少量目的核酸:0.05ng/yl即能获得检测结果。为首次用于艾美尔属球虫病毒检测的方法，可以快速准确的识别待检球虫样本中是否含有携病毒的虫株。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]附图1为上游引物CF、下游引物CR设计图。
[0010]附图2为模板RNA浓度梯度优选。
[0011]附图3为引物浓度梯度优选。
[0012]附图4为TaKaRa La Taq酶浓度梯度优选。
[0013]附图5为dNTP浓度梯度优选。
[0014]附图6为简并引物RT-PCR的方法检测柔嫩艾美尔球虫病毒。
[0015]附图7为简并引物RT-PCR的方法检测斯氏艾美尔球虫病毒。
【具体实施方式】
[0016]为进一步说明本发明在艾美耳属球虫病毒检测中的应用，以下列实施例进行说明，但本发明的应用并不限于实施例。
[0017]实施例1 引物的设计和合成
一、材料:分子生物学软件MEGA4、DNAMAN及NCBI网络资源。
[0018]二、方法与结果:
序列获得:通过对布氏艾美尔球虫病毒(疋brunetti RNA virus I)基因组分析，选取coat基因作为靶序列，并从GenBank公共数据库中获得此基因序列，登录号为:NC_002701。使用coat蛋白序列为质询序列，在NCBI上进行BlustP比对，获得330至346位(IALGTAAAVAHCDPLVP )，435至446位(PFFffIEPTTVLP )两个高度保守的蛋白区域，将其余参考序列的相应位置的核酸序列单独下载，获得了 Gremmeniella abietina RNA virusL2、Gremmeniella abietina RNA virus L1、Helicobasidium mompa totivirus 1—17、Helminthosporium victoriae virus、Beauveria bassiana RNA virus 1、Tolypocladiumcylindrosporum virus 1、Aspergillus foetidus slow virus I 七个真菌病毒，以及Leishmania RNA virus 1- 4一个利什曼原虫病毒的序列。
[0019]引物设计:所获的序列经cluster比对后，选取合适区域设计出引物。(见附图1)。简并位点使用简并碱基，简并位点为N时，使用I (次黄嘌呤)。
[0020]引物合成:由生物公司合成引物CF、CR。
[0021]上游引物:CF:5’ -CBGCIGCTBYIGTVGCH-3’
下游引物:CR:5’ -GTVGRCTCDATCCARAASHAD-3’
实施例2
核酸样品的制备
一、材料:柔嫩艾美尔球虫、2XSTE缓冲液(Ph8.0)、水饱和酚、三氯甲烷、β-巯基乙醇、10%SDS、70%乙醇、异丙醇、高速离心机。
[0022]二、方法与结果:
I)柔嫩艾美尔球虫卵囊破碎:将约IO7待检球虫进行液氮研磨，研磨后溶于lml2XSTE(PH8.0)缓冲液。
[0023]2)蛋白质抽提:在上述球虫溶液中加入30μ1β-巯基乙醇，0.6ml水饱和酚，
0.4ml三氯甲烷，140 μ 110%SDS。充分匀浆5分钟。4°C条件下，12000r/min离心5分钟，取上清。
[0024]3)总核酸获取:上清与等体积的冷异丙醇混匀，-80°C静置10分钟，4°C条件下，15000r/min离心15分钟，沉淀用70%冷乙醇溶液清洗，4°C条件下，15000r/min离心15分钟。沉淀干燥后溶于200 μ IddH2O0
[0025]4) DNA 消化:取上述总核酸溶液 172 μ 1，加入 DNaseI (TaKaRa, 2270Α)8 μ I, 10*DNase I Buffer 20 μ I。37°C消化 30 分钟，80°C 5 分钟使酶失活。
[0026]5) RNA获取:取上述溶液，加等体积冷异丙醇，-80°C静置10分钟，4°C条件下，15000r/min离心15分钟，沉淀用70%冷乙醇溶液清洗，4°C条件下，15000r/min离心15分钟。沉淀干燥后溶于100 μ IddH2Oo再15000r/min离心15分钟,取上清,弃沉淀。
[0027]实施例3
简并引物RT-PCR检测柔嫩艾美尔球虫病毒
一、材料:柔嫩艾美尔球虫RNA粗提物、PrimeScript ? ReverseTranscriptase (2680Q)反转录酶试剂盒、TaKaRa LA Taq (RR02MQ)核酸聚合酶试剂盒、琼脂糖、溴化乙锭溶液、Biorad PCR仪。
[0028]二、方法与结果:
I) Ist-Stand cDNA合成:在Microtube中配制下列混合液:
【权利要求】
1.用于艾美尔属球虫病毒的简并引物RT-PCR检测方法，包括以下步骤: 1)在STE缓冲液的条件下，使用苯酚氯仿对经过液氮研磨的球虫材料进行抽提，获取总核酸，总核酸中的DNA经由DNaseI消化处理，获取RNA的粗提产物，即为待检核酸样品； 2)该待检核酸样品直接作为模板，使用PrimeScript? ReverseTranscriptase (2680Q)反转录酶进行反转录(RT);因为球虫病毒基因组为dsRNA，所以反转录使用CF和CR两条简并引物同时进行(传统反转录反应只使用单一的下游引物)； 上游引物:CF:5’ -CBGCIGCTBYIGTVGCH-3’ 下游引物:CR:5’ -GTVGRCTCDATCCARAASHAD-3’ 以上CF引物使用了 I (次黄嘌呤)，代替N (N=A/T/C/G)； 其中兼并碱基代码:R=A/G、S=G/C、Y=C/T、V=A/G/C、H=A/C/T、D=A/G/T、B=G/C/T、N=A/G/C/T ； 3)经由反转录所得到的cDNA使用TaKaRaLA Taq (RR02MQ)核酸聚合酶进行PCR扩增为dsDNA,琼脂糖凝 胶电泳检测结果(约400bp大小的单一条带)。
【文档编号】C12Q1/68GK103898237SQ201410009964
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】李建华, 武斌, 张西臣, 宫鹏涛, 信彩岩, 张国才, 杨举, 李 赫, 杨正涛 申请人:吉林大学