电化学活性细菌及其筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物电化学系统中应用的细菌品种，旨在提供电化学活性细菌新种及其电化学活性新种的筛选方法。该该电化学活性细菌的16S?rRNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；该种电化学活性细菌的筛选方法，是选择富集了电化学活性微生物的阳极生物膜作为分离菌源，利用微型生物电化学反应器作为分离装置，并以生物电化学反应器的产电能力为筛选指标。本发明获得的电化学活性细菌是泥土杆菌属的一个新种，为研究生物电化学系统阳极微生物的胞外电子传递机理提供了宝贵的微生物资源；且电化学活性细菌具有高电化学活性的和耐盐特征，能提高生物电化学系统的性能，并能在高盐体系的生物电化学系统中应用。
【专利说明】电化学活性细菌及其筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物电化学系统中应用的细菌品种，特别涉及电化学活性细菌新种及其电化学活性新种(Geobacter anodereducens SD-1)的筛选方法。
【背景技术】
[0002]生物电化学系统(BES) —类利用微生物阳极催化氧化反应，将电子传递到阴极进行还原反应，从而将化学能转化为电能的装置，主要包括微生物燃料电池(MFC)和微生物电解池(MEC)。当以废水为阳极基质时，这类系统能在处理废水的同时以不同的能源形式(例如电能、氢能等)回收废弃生物质中的能量。因此，生物电化学系统在近10年中被广泛研究，成为一个新的研究热点。其中系统所依赖的生物催化剂(阳极微生物)，叫做电化学活性细菌。硫还原泥土杆菌(Geobacter sulfurreducens)是电化学活性微生物的模式菌株，它的电化学活性和混合培养菌群的相当，并且往往是混菌阳极生物膜中的优势种群。但是，该细菌最初是以它的铁还原能力从底泥中分离获得，随后被用于生物电化学系统中。最近的研究发现微生物还原金属氧化物的过程和细胞将电子导到电极的行为是不一样的。有的微生物不能还原金属氧化物但却能在BESs中单独产电，反之亦然。这表明相比于矿物质的电子受体，细菌在电极上生长需要不同的特性。因此，我们推测以细菌的电化学活性(接种该细菌的生物电化学反应器的产电能力)而不是金属还原能力为指标，以高度富集电化学活性细菌的混菌阳极生物膜为分离菌源，能获得电化学活性更高，更能适应生物电化学系统的电化学活性细菌。
[0003]新的电化学活性细 菌一方面能优化生物电化学系统的阳极工作性能，另一方面能为生物电化学系统阳极电子传递机理的研究提供新的微生物资源。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种电化学活性细菌及其筛选方法。
[0005]为解决技术问题，本发明的解决方案是:
[0006]提供一种电化学活性细菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为阳极还原泥土杆菌SD-1 (Geobacter anodereducens SD-1),保藏号为CGMCCNo:8662，保藏日期为:2013.12.30，保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0007]本发明中，所述该电化学活性细菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本发明还提供了电化学活性细菌的筛选方法，是采用稀释-绝迹法进行电化学活性细菌的分离、纯化和筛选；其特征在于，是选择富集了电化学活性微生物的阳极生物膜作为分离菌源，利用微型生物电化学反应器作为分离装置，并以生物电化学反应器的产电能力为筛选指标；具体包括:
[0009](I)所述富集了电化学活性微生物的阳极生物膜取自生物电化学反应器，该生物电化学反应器最初由城市生活废水处理厂初沉池的出水接种，以甲酸为基质，稳定运行至少半年，以便在其阳极材料上沉积形成阳极生物膜；经克隆文库的群落分析表明，阳极生物膜中的优势种群为数量>50%的硫还原泥土杆菌和数量>20%的乙酸杆菌；在该生物电化学反应器中，通过乙酸杆菌将甲酸转化成浓度<50ppm的乙酸，然后硫还原泥土杆菌利用该乙酸作为基质进行产电；
[0010](2)筛选过程所使用的分离装置是微型生物电化学反应器:由5mL血清瓶构建，阳极材料为1.5cmX Icm的石墨板，阴极材料为1.5cmX Icm不锈钢网；经砂纸清理后的不锈钢丝或者钛丝与阴阳两个电极连接，作为引出线导出电流；电极的引出线分别穿过一个直径20_ 丁基橡胶塞；反应器由铝箔盖密封后，用高压蒸气灭菌；取生物电化学反应器的阳极生物膜样品，用磷酸缓冲溶液(PBS)倍比稀释后接种于灭过菌的微型生物电化学反应器；
[0011](3)以微型生物电化学反应器的产电能力为指标，选择能产生电流的最大稀释倍数下的微型反应器进行下一个分离周期，直至获得纯培养微生物——阳极还原泥土杆菌；所述分离周期是指:稀释——接种新的微型反应器——运行微型反应器——监测电流产生的整个过程。
[0012]本发明中，运行所述微型生物电化学反应器时，使用的培养基的成分为:
[0013]每升水中，包含乙酸钠Ig ；NH4Cl0.31g ；KC10.13g ;50mM磷酸缓冲溶液；Wolfe微量元素液12.5mL ；ffolfe维生素液5mL ；
[0014]所述磷酸缓冲溶液的成分为:
[0015]每升水中，包含NaH2PO4.2H205.618g ；Na2HP04.12Η206.155g ； [0016]所述Wolfe微量元素液的成分为:
[0017]每升水中，包含氨三乙酸1.5g ；MgS04.7Η203.0g ； MnSO4.H2O0.5g ；NaCll.0g ；FeSO4.7H200.1g ；CoCl2.6H200.1g ；CaCl20.1g ；ZnS04.7H200.1g ；CuS04.5H200.01g ；AlK(SO4)2.12H200.01g ；H3B030.01g ；Na2Mo04.2H200.01g ；
[0018]所述Wolfe维生素液的成分为:
[0019]每升水中，包含生物素2.0mg ;叶酸2.0mg ;维生素B610.0mg ;维生素B15.0mg ;核黄素5.0mg ;烟酸5.0mg ；D-泛酸钙5.0mg ;维生素B120.1mg ;对氨基苯甲酸5.0mg ;硫辛酸
5.0mg0
[0020]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0021]1、本发明获得的电化学活性细菌是泥土杆菌属的一个新种，为研究生物电化学系统阳极微生物的胞外电子传递机理提供了宝贵的微生物资源。
[0022]2、本发明提供的电化学活性细菌具有高电化学活性的和耐盐特征，能提高生物电化学系统的性能，并能在高盐体系的生物电化学系统中应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明电化学活性细菌在乙酸-柠檬酸铁培养基中的透射电镜图。
[0024]图2是本发明电化学活性细菌在生物电化学反应器中形成阳极生物膜的扫描电镜图。
【具体实施方式】[0025]本发明中，保藏名称为阳极还原泥土杆菌(Geobacter anodereducens SD-1)的电化学活性细菌的生理生化和分子生物学鉴定结果证实为一个新种，它的生物学特征:
[0026]1、形态特征:阳极还原泥土杆菌SD-1为单细胞生长的规则短杆菌(长
0.8-1.3 μ m,宽0.3 μ m);革兰氏阴性菌；无鞭毛；无芽孢。
[0027]2、生理生化特征:阳极还原泥土杆菌SD-1为耐氧厌氧细菌，可以在15-42 °C，PH6-8.5,0-3% NaCl条件下生长，最适生长温度为30_35°C，最佳生长pH值为7左右；能以乙酸为电子供体，铁氧化物为电子受体生长，但是不能以硫单质和延胡索酸盐为电子受体生长。当以乙酸盐为电子供体，以柠檬酸铁为电子受体，在最优生长条件30°C和pH7下，代时为18h。细菌在生物电化学系统中的产电能力与混合培养物(废水)相当(在50mM磷酸缓冲溶液中)或者1.5倍于(在200mM磷酸缓冲溶液或者盐水中)混菌,产电能力居于已获得纯培养电化学活性微生物的前列。
[0028]3、分子生物学鉴定结果:与其最相近种属硫还原泥土杆菌(Geobactersulfurreducens)的相似性为98%,但是阳极还原泥土杆菌SD-1和硫还原泥土杆菌PCA的DNA-DNA杂交率为61.6%。因此，该阳极还原泥土杆菌为一个新种。
[0029]具体实施例:
[0030]阳极还原泥土杆菌SD-1 (Geobacter anodereducens SD-1)按照下述步骤进行选育:
[0031]一、菌株的 分离、纯化和筛选:
[0032]采用传统稀释-绝迹法，选择富集了电化学活性微生物的阳极生物膜作为分离菌源，使用微型生物电化学反应器(min1-MEC)为分离装置进行电化学活性细菌的分离，其具体步骤如下:
[0033]从富集了电化学活性微生物的生物电化学反应器的阳极碳刷上剪下一些石墨纤维，转移到一个5mL血清瓶中(装有5mL50mM磷酸缓冲溶液和玻璃珠)，震荡瓶子得到细胞悬浮液。然后将细胞悬浮液在厌氧管中用50mM磷酸缓冲溶液从KT1-KT9连续倍比稀释。每个稀释倍数下的样品以10%接种量接种至微型生物电化学反应器，然后在30°C运行反应器。阳极微生物的生长通过产生的电流监控。检测到电流生成的反应器运行到这个产电周期结束(20%峰值电流)。震荡能检测到电流生成的最大稀释倍数下的反应器，得到阳极微生物的细胞悬浮液，然后重复上诉的分离步骤(稀释、接种和运行)，直至获得纯培养细菌。细菌的纯度通过显微观察和16S rRNA克隆测序监测。
[0034]所述富集了电化学活性微生物的阳极碳刷的生物电化学反应器最初由生活废水(本实施例选择了美国宾夕法尼亚州立大学废水处理厂初沉池的出水)接种，以甲酸为基质，稳定运行至少半年，在阳极材料上沉积形成了阳极生物膜；经克隆文库的群落分析表明，该微型生物电化学反应器的阳极生物膜中的优势种群为数量>50 %的硫还原泥土杆菌和〉数量20%的乙酸杆菌；在该生物电化学反应器中，通过乙酸杆菌将甲酸转化成浓度<50ppm的乙酸(该浓度远小于反应器常用的lg/L乙酸的基质浓度)，然后硫还原泥土杆菌利用极低浓度乙酸为基质高效产电(和采用lg/L乙酸基质的反应器的产电能力相当)。
[0035]筛选过程所使用的分离装置微型生物电化学反应器为:由5mL血清瓶构建；阳极材料为1.5cmX Icm的石墨板；阴极材料为1.5cmX Icm不锈钢网；经砂纸清理后的不锈钢丝或者钛丝和阴阳两电极连接，作为引出线导出电流；电极的引出线分别穿过一个厚的丁基橡胶塞(20mm直径)；反应器由铝箔盖密封后，反应器用高压蒸气灭菌；反应器在0.7V外加电压下运行
[0036]以微型生物电化学反应器的产电能力为指标，选择能产生电流的最大稀释倍数下的微型反应器进行下一个分离周期，直至获得纯培养微生物——阳极还原泥土杆菌；所述分离周期是指:稀释——接种新的微型反应器——运行微型反应器——监测电流产生的整个过程。
[0037]运行微型生物电化学反应器所使用的培养基为:乙酸钠Ig ;NH4C10.31g ;KC10.13g ;50mM磷酸缓冲溶液(PBS) ；Wolfe微量元素液12.5mL ；ffolfe维生素液5mL。上述50mM磷酸缓冲溶液(每升水)为=NaH2PO4.2Η205.618g和 Na2HPO4.12Η206.155g。上述Wolfe微量元素液(每升水)为:氨三乙酸 1.5g ；MgS04.7Η203.0g ；MnSO4.H2O0.5g ；NaCll.0g ；FeSO4.7H200.1g ；CoCl2.6H200.1g ；CaCl20.1g ；ZnS04.7H200.1g ； CuSO4.5H200.01g ；AlK(SO4)2 *12H200.01g ；H3B030.01g ；Na2Mo04 *2H200.01g。上述Wolfe维生素液(每升水)为:生物素2.0mg ;叶酸2.0mg ;维生素B610.0mg ;维生素B15.0mg ;核黄素5.0mg ;烟酸5.0mg ；D-泛酸?丐5.0mg ;维生素B120.1mg ;对氨基苯甲酸5.0mg ;硫辛酸5.0mg0
[0038]二、细菌的生理生化和形态学分析:
[0039]细菌在柠檬酸铁-乙酸培养基中的生长用吖啶橙细胞计数法检测；Fe(III)还原能力用HCl萃取Fe(II)检测法检测Fe(II)离子的生成获得；透射电镜用于观察柠檬酸铁-乙酸培养基中处于稳定期的细菌形态；扫描电镜用于观察生物电化学反应器中阳极生物膜上的细菌形态；细菌在生物电化学反应器中的电化学活性用系统的产电能力评价。口丫唳橙细胞计数法:在抽滤装置上放上背衬滤膜(MF-Millipore Membrane, 5.0 μ m孔径，25mm直径)，加入2_3mL去离子水冲洗抽滤漏斗和湿润背衬滤膜，真空抽滤。然后，在背衬滤膜放上黑色的聚碳酸酯 滤膜(Millipore, Isopore Membrane, 0.2 μ m孔径，25mm直径)，避免两滤膜间有气泡，在抽滤漏斗中加入2mL检测样品，加入200 μ I吖啶橙溶液(IOOmg/L)，用移液器反复吹吸混匀样品和吖啶橙溶液，等待2min，真空抽滤。将黑色滤膜放置在载玻片上，加一滴浸油盖上盖玻片，在荧光显微镜(Olympus BX61)下计数。注意事项:样品需事先稀释，使得荧光显微镜中一个视野的细胞个数在15-30之间。HCl萃取Fe(II)检测法为:0.1mL的培养液样品加入到5mL0.5N HC1，在室温下萃取15min。然后，0.1mL萃取液加入到 5mL 菲咯嗪(lg/L)的 SOmmoI /T, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N，_2_ethanesulfonic acid, N-(2-羟乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸)缓冲液中(pH7)。混合15秒后，测量562nm下的吸光度A562。形态学鉴定参照文献方法(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北点:科学出版社，2001.)
[0040]三、细菌的分类鉴定:
[0041]提取细菌基因组DNA，用于16S rDNA扩增的PCR反应引物为细菌通用引物:正向引物 27F，5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 和反向引物 1541R，5’ -AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。所述 PCR 扩增体系(50 μ L)是:2XTaq PCR MasterMix (天根)25 μ L，引物各 2 μ L，水 20 μ L，模板 luL。所述 PCR 扩增方法是:95°C 5min ；94°C Imin ；55°C Imin ；72°C 1.5min ;从第二步起共30个循环，最后延伸72°C lOmin，进行测序。
【权利要求】
1.一种电化学活性细菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为阳极还原泥土杆菌SD-1 (Geobacter anodereducens SD-1),保藏号为CGMCCNo:.8662，保藏日期为:2013.12.30。
2.根据权利要求1所述的电化学活性细菌，其特征在于，该电化学活性细菌的16SrRNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述电化学活性细菌的筛选方法，是采用稀释-绝迹法进行电化学活性细菌的分离、纯化和筛选；其特征在于，是选择富集了所述电化学活性微生物的阳极生物膜作为分离菌源，利用微型生物电化学反应器作为分离装置，并以生物电化学反应器的产电能力为筛选指标；具体包括: (1)所述富集了电化学活性微生物的阳极生物膜取自生物电化学反应器，该生物电化学反应器最初由城市生活废水处理厂初沉池的出水接种，以甲酸为基质，稳定运行至少半年，以便在其阳极材料上沉积形成阳极生物膜；经克隆文库的群落分析表明，阳极生物膜中的优势种群为数量>50%的硫还原泥土杆菌和数量>20%的乙酸杆菌；在该生物电化学反应器中，通过乙酸杆菌将甲酸转化成浓度<50ppm的乙酸，然后硫还原泥土杆菌利用该乙酸作为基质进行广电； (2)筛选过程所使用的分离装置是微型生物电化学反应器:由5mL血清瓶构建，阳极材料为1.5cmX 1cm的石墨板，阴极材料为1.5cmX Icm不锈钢网；经砂纸清理后的不锈钢丝或者钛丝与阴阳两个电极连接，作为引出线导出电流；电极的引出线分别穿过一个直径20mm丁基橡胶塞；反应器由铝箔盖密封后，用高压蒸气灭菌；取生物电化学反应器的阳极生物膜样品，用磷酸缓 冲溶液(PBS)倍比稀释后接种于灭过菌的微型生物电化学反应器； (3)以微型生物电化学反应器的产电能力为指标，选择能产生电流的最大稀释倍数下的微型反应器进行下一个分离周期，直至获得纯培养微生物——阳极还原泥土杆菌；所述分离周期是指:稀释——接种新的微型反应器——运行微型反应器——监测电流产生的整个过程。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，运行所述微型生物电化学反应器时，使用的培养基的成分为: 每升水中，包含乙酸钠Ig ；NH4C10.31g ；KC10.13g ;50mM磷酸缓冲溶液；Wolfe微量元素液12.5mL ；ffolfe维生素液5mL ； 所述磷酸缓冲溶液的成分为:
每升水中，包含 NaH2PO4.2H205.618g ；Na2HPO4.12H206.155g ； 所述Wolfe微量元素液的成分为: 每升水中，包含氨三乙酸 1.5g ；MgS04.7Η203.0g ； MnSO4.H2O0.5g ；NaCll.0g ；FeSO4.7H200.1g ；CoCl2.6H200.1g ；CaCl20.1g ；ZnS04.7H200.1g ；CuS04.5H200.01g ；AlK(SO4)2.12H200.01g ；H3B030.01g ；Na2Mo04.2H200.01g ； 所述Wolfe维生素液的成分为: 每升水中，包含生物素2.0mg ;叶酸2.0mg ;维生素B610.0mg ;维生素B15.0mg ;核黄素5.0mg ;烟酸5.0mg ；D-泛酸钙5.0mg ;维生素B120.1mg ;对氨基苯甲酸5.0mg ;硫辛酸.5.0mg0
【文档编号】C12R1/01GK103898005SQ201410010746
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】孙丹, 王爱杰, 成少安, 布鲁斯·洛根 申请人:浙江大学