人胸腺肽β4三倍体蛋白、编码基因及其分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及人胸腺肽β4三倍体蛋白、编码基因及其分离纯化方法。所涉及的人胸腺肽β4三倍体蛋白的氨基酸序列如SED?ID?NO：1所示；所涉及的编码基因序列如SED?ID?NO：2所示；所涉及的分离纯化方法是采用亲和层析柱进行分离纯化。本发明的重组人胸腺肽β4串联三倍体经玫瑰花环实验检测，能够明显提高T-淋巴细胞免疫反应性能；小鼠皮毛生长实验表明重组人胸腺肽β4串联三倍体可以明显促进脱毛剂处理小鼠皮毛处的生长。
【专利说明】人胸腺肽β 4三倍体蛋白、编码基因及其分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术研究领域，具体涉及一种利用基因工程技术生产重组人胸腺肽β4串联三倍体的生产方法。
【背景技术】
[0002]胸腺是人体免疫系统中重要的免疫器官，能够分泌数十种胸腺素(thymosins)以调节机体的免疫功能，因其最早从小牛胸腺中提取而得名。
[0003]人类已经认知的数十种胸腺素因等电点不同而被区别为胸腺素α、β、Y三大类，每一类包含多种亚型。β族胸腺素(thymosin-β )是等电点在pI5.0-7.0之间的一组胸腺素，大小为40-44个氨基酸残基，相对分子质量约5kD，序列结构高度保守。不同物种中发现的β族胸腺素有十多种，人体中主要是thymosin-β 4、thymosin_ β 10和thymosin-β 15,在维持肌动蛋白的动态平衡以及肿瘤发病与转移、细胞凋亡、炎症反应、血管生成和创伤愈合等很多生理、病理过程中发挥重要作用。
[0004]胸腺素类制剂己成为各界十分关注的免疫增强剂。临床上应用的胸腺素类制剂均是由牛或猪胸腺中提取的多肽类分子混合物，有较稳定的免疫话性，临床上适用于免疫缺陷病或免疫机能失调所引起的一系列疾病，如胸腺发育不全、重症混合性免疫缺乏症、运动失调性毛细血管扩张症、麻风、重症感染、复发性口疮等伴有细胞免疫功能低下的患者。亦可用于病毒性肝炎、恶性肿瘤和抗衰老。
[0005]尽管从动物组织中提取制备的胸腺素类制剂具有比较稳定的临床疗效，但是也存在潜在病原物污染的风险。而且，由于提取产物是多种肽类分子的混合物，其作用效果在不同批次间存在差异，也可能是导致现行胸腺肽制剂常见不良反应如发热、少数病人出现荨麻疹、皮疹、头昏等的内在·原因。
[0006]天然的人胸腺肽β 4，只有44个氨基酸残基，相对分子质量偏小，只有5kD左右。现有技术虽然有采用基因工程技术对其进行生产，但是表达量和在宿主细胞中的稳定性一直未能很好地解决。因此，在技术上通常选择将其与其他蛋白融合表达，初步纯化后，再利用蛋白质水解酶从融合蛋白上将其切出。增加了分离纯化的工艺步骤与成本。
【发明内容】
[0007]针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之一为提供一种人胸腺肽β 4三倍体蛋白。
[0008]为此，本发明提供的人胸腺肽β 4三倍体蛋白的氨基酸序列如SED ID NO:1所示。
[0009]针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之二为提供一种人胸腺肽β 4三倍体的编码基因。
[0010]为此，本发明提供的人胸腺肽β 4三倍体的编码基因的序列如SED ID NO:2所示。
[0011]针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之三为提供一种人胸腺肽β 4三倍体蛋白的分离纯化方法。[0012]为此，本发明提供的分离纯化方法包括:采用亲和层析柱进行分离纯化。
[0013]优选的，所述分离纯化方法包括:
[0014]第一步，粗纯化:将诱导表达人胸腺肽β 4三倍体蛋白菌体用水或PBS重悬，煮沸后离心收集上清液；
[0015]第二步，利用亲和层析柱对上清液进行纯化分离，所用柱材料是特异性结合亲和标签的柱材料。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0017](I)本发明的人胸腺肽β 4三倍体蛋白结构为单一多肽链结构，包含3拷贝长44个氨基酸残基的人源胸腺肽氨基酸序列，对应的编码基因即核酸序列长度是该多肽链氨基酸残基数目的3倍，即474bp长的核酸序列。其相对分子质量从单倍体所具有的5kD增加至15kD左右，比现有的单倍体人胸腺肽β 4更加容易分离纯化，提高分离纯化的收率。
[0018](2)本发明的人胸腺肽β4三倍体蛋白的氨基酸序列包括按照5' —3'方向串联重组的三拷贝人胸腺肽β4序列和利于每个拷贝重组人胸腺肽β4正确折叠的柔性接头氨基酸序列，即GGGSGGGS。利用该柔性接头序列由小侧链的甘氨酸和丝氨酸构成，在多肽链折叠过程中倾向于形成β折叠或不规则卷曲，有利于其两翼的目的蛋白进行各自的天然折叠过程，倾向于形成接近天然结构状态的蛋白质分子。也就是有利于形成有活性的重组蛋白。
[0019](3)本发明的人胸腺肽β 4三倍体蛋白的氨基酸序列所包含的每个拷贝的人胸腺肽β 4的氨基酸序列与天然的人胸腺肽β 4的氨基酸序列完全一致。
[0020](4)本发明的重组人胸腺肽β 4串联三倍体具有部分天然人源胸腺肽β 4的活性。动物实验表明，该串联三倍体重组人胸腺肽能够促进实验鼠毛发再生，显示天然人胸腺肽免疫活性。
[0021](5)本发明的纯化方法经亲和层析、精制、冷冻干燥获得目的蛋白纯品。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为实施例1中重组人胸腺肽β 4串联三倍体表达载体的酶切检测，其中1-4号泳道分别为:1、2、3、4号重组表达载体DNA的NcoI与XhoI双酶切产物；5_8号泳道分别为:1、2、3、4号重组表达载体DNA ；9号泳道为:原核表达载体pET22b DNA ；10号泳道为:125bpDNA Ladder ；
[0023]图2为实施例2重组人胸腺肽β 4串联三倍体在工程菌中的表达效果，其中泳道I为Marker、泳道2为诱导前样品、泳道3为诱导lh、泳道4为诱导2h、泳道5为诱导3h、泳道6为诱导4h、泳道7为诱导5h、泳道8为诱导6h ；
[0024]图3为实施例2重组人胸腺肽β 4串联三倍体在工程菌中的表达结果的westernblotting鉴定，其中泳道1-6泳道分别为:重组人胸腺肽β 4串联三倍体样品，泳道7为空载体转化细胞裂解液，泳道8为Marker ；
[0025]图4为实施例2重组人胸腺肽β 4串联三倍体分离纯化结果，M泳道为Marker、A泳道为未纯化样品、B泳道为粗纯化样品、C、D、E泳道分别为His-tag亲和层析后依次浓缩的纯化结果；
[0026]图5为实施例2纯化的重组人胸腺肽β 4串联三倍紫外吸收图；[0027]图6为实施例2的玫瑰花环实验检测重组人胸腺肽β 4串联三倍体免疫学活性；
[0028]图7为实施例2的重组人胸腺肽β 4串联三倍体处理2周对实验鼠毛发生长的促进作用；
[0029]图8为实施例2的HE染色检测重组人胸腺肽β 4串联三倍体处理2周对实验鼠毛囊细胞的作用。
【具体实施方式】
[0030]本发明考虑将人胸腺肽β 4编码基因串联排列在一起，每个重复单位之间利用寡聚柔性接头(GGGSGGGS)的编码基因相隔。依据蛋白质折叠研究的相关数据，柔性接头富含甘氨酸和丝氨酸，这两种氨基酸残基在多肽链中交替出现，往往会形成β折叠结构。有利于其两翼的氨基酸序列在一级结构基础上折叠产生具有活性的高级结构。根据这一认知，发明人设计了密码子经过优化的人胸腺肽β 4基因序列、构建其原核表达载体及其表达工程菌。已有的实验结果表明，人胸腺肽β 4串联三倍重组蛋白可以在大肠杆菌中过表达，表达工艺简单；分离纯化方法相对简单；表达的串联三倍体具有相应生物学活性。
[0031]本发明的人胸腺肽β 4三倍体蛋白的生产方法包括:
[0032](I)用于表达、生产重组人胸腺肽β 4串联三倍体的工程菌的构建；构建过程中引入相应的亲和标签，以利于后续分离纯化；现有的亲和标签均用于本发明，例如:镍柱亲和性组氨酸标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白等；
[0033](2)工程菌的发酵培养；
[0034](3)重组人胸腺肽β 4串联三倍体的诱导与表达；
[0035](4)重组人胸腺肽β 4串联三倍体`的分离纯化，经粗纯后，利用亲和层析柱作进一步分离纯化:`
[0036]第一步，粗纯化:将诱导表达后收取的菌体用1.5倍水或PBS (质量比)彻底重悬，煮沸后用以富集重组胸腺肽串联三倍体，离心收集上清液；
[0037]第二步，利用亲和层析柱对上清液进行纯化分离:所用柱材料是特异性结合上述亲和标签的主材料。用磷酸缓冲液作为洗脱液，从亲和柱材料上洗脱目的蛋白，经过脱盐、低温浓缩、冷冻干燥后制备成目的蛋白制剂。
[0038]其中工程菌构建方法包括:
[0039](I)人工合成密码子优化的重组人胸腺肽β 4串联三倍体的编码基因序列，利用基因重组技术在核酸限制性内切酶和核酸连接酶次序作用下将其克隆在指定克隆载体中。
[0040](2)在核酸限制性内切酶和核酸连接酶次序作用下将包含3拷贝重组人胸腺肽β4串联三倍体的编码基因序列从克隆载体中切出并与表达载体连接重组；
[0041](3)用于重组人胸腺肽β 4串联三倍体表达生产的表达载体可以是任何一种适合于在原核细胞中高效表达外源基因的表达载体。
[0042](4)将重组的携载重组人胸腺肽β 4串联三倍体的载体DNA导入合适的宿主细胞。
[0043](5)导入重组人胸腺肽β 4串联三倍体的宿主细胞是大肠杆菌。
[0044]以下通过发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0045]以下实施例中所用材料和试剂为:
[0046]包含3个拷贝人胸腺肽β 4的基因序列:委托大连宝生物生物工程有限公司合成；
[0047]pUC18:大连宝生物生物工程有限公司提供；
[0048]大肠杆菌:E.coli ToplO用于载体构建，BL21 (DE3)用于基因表达；
[0049]重组有目的基因载体的E.coli大肠杆菌:BL21 (DE3)；
[0050]质粒提取试剂盒:购自北京舟鼎国生物技术有限公司；
[0051]凝胶回收试剂盒:购自北京舟鼎国生物技术有限公司；
[0052]宿主细胞:BL21(DE3)；
[0053]亲和层析柱:Ni柱；
[0054]磷酸缓冲液:氯化钠Sg、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.42g、磷酸二氢钾0.27溶解于I升去离子水中；
[0055]含质量百分比为1.7%咪唑的磷酸缓冲液。
[0056]实施例1
[0057]该实施例为重组人胸腺肽β 4串联三倍体的工程菌的构建。
[0058](I)委托大连宝生物生物工程有限公司合成包含3个拷贝人胸腺肽β 4的基因序列，将合成的序列定向克隆在克隆 载体PUC18中并提供重组该载体的Ε.coli菌体细胞(JM109)；
[0059](2)质粒制备:将公司提供的重组有目的基因载体的Ε.coli菌体细胞于37°C、200rpm/min培养12_16h,于12000rpm/min离心30~60s收集菌体，采用市售质粒提取试剂盒制备高纯度质粒DNA，将DNA浓度调整至I μ g/ μ L ;
[0060](3)核酸限制性内切酶消化:在50 μ L反应体系中，加入5μ L核酸限制性内切酶(NcoI与XhoI各2.5 μ L)、5 μ LlOX核酸限制性内切酶反应缓冲液、40 μ L上一步骤制备的高纯度质粒DNA，于37°C水浴中作用3h，酶切反应液在1%琼脂糖凝胶、80V电压下电泳lh，在紫外灯下从凝胶中切出基因片段，利用市售凝胶回收试剂盒回收基因片段。
[0061](4)线性化的表达载体片段的制备:将携载表达载体pET22b质粒的E.coli菌体细胞于37°C、200rpm/min培养12_16h，于12000rpm/min离心30~60s收集菌体，采用市售质粒提取试剂盒制备高纯度质粒DNA，将DNA浓度调整至I μ g/ μ L ;在50 μ L反应体系中，加入5yL核酸限制性内切酶(NcoI与XhoI各2.5μυ、5μL IOX核酸限制性内切酶反应缓冲液、40 μ L高纯度pET22b质粒DNA，于37°C水浴中作用3h，酶切反应液在1%琼脂糖凝胶、80V电压下电泳lh，在紫外灯下从凝胶中切出线性化载体片段，利用市售凝胶回收试剂盒回收基因片段。
[0062](5)重组人胸腺肽β 4串联三倍体的编码基因片段与表达载体的线性化片段连接重组:将上述步骤3回收的串联三倍体人胸腺肽β 4的编码基因片段与表达载体线性化片段按照摩尔数比6:4的比例添加到含有5 μ L 了40嫩连接酶、5 4 1^ 10XT4DNA连接酶反应缓冲液的50 μ L反应体系中，吹吸混匀后分装成10 μ L/250 μ L PCR管，于16°C连接重组16h。
[0063](6)大肠杆菌细胞的制备:将冷冻保存的大肠杆菌表达菌BL21 (DE3)接种至不含抗生素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆转接至新鲜不含抗生素的LB平板上，挑取单克隆接种于5mL不含抗生素的LB液体培养基中于37°C、200rpm/min摇床培养过夜，过夜培养物以10%的接种量转接至新鲜不含抗生素的LB液体培养基中，于37°C、280rpm/min摇床培养至0D_达到0.8左右，于8000rpm/min、4°C离心收集菌体,将菌体重悬于冰冷的0.lmol/LCaCl2溶液中处理15min以上,置冰上待用。所有操作为无菌操作。
[0064](7)大肠杆菌克隆细胞的转化:将上述步骤5所述的连接重组产物添加至步骤6制备的大肠杆菌表达细胞悬浮液中，冰置15min以上，于42°C处理90s，冰上冷却2min。添加700 μ L不含抗生素的预先加热到37°C的LB液体培养基，于37°C、200rpm/min摇床培养40min,离心收集菌体并重悬于100 μ L LB液体培养基中，涂布于添加有相应抗生素的LB固体培养皿中，于37°C培养12~16h。
[0065](8)筛选重组质粒:重组人胸腺肽β 4串联三倍体原核表达载体的酶切检测，从上述步骤7得到的LB固体培养基上挑取单克隆，接种至IOmL添加有的50~100 μ g/mL抗生素的LB液体培养基中，按照上述步骤2方法制备质粒，经限制性内切酶NcoI和XhoI消化和1%琼脂糖凝胶电泳检测，酶切产物中出现载体条带和474bp目的基因条带的即携载有重组人胸腺肽β 4串联三倍体编码基因的表达载体，其来源克隆即为携载重组人胸腺肽β4串联三倍体基因的工程菌。附图1所示即为包含重组人胸腺肽β 4串联三倍体编码基因的表达载体的酶切检测结果。其中从左至右的前4个泳道是1、2、3、4号随机挑取的步骤7转化克隆中提取的质粒的NcoI和XhoI双酶切检测结果，第5-8个泳道分别是与1、2、3、4号酶切产物相对应的质粒DNA样品。第9泳道是未酶切的空载体pET22b质粒DNA样品。酶切图谱显示，随机挑取的4个克隆来源的质粒DNA都是由目的基因与载体构成的重组质粒，经过NcoI与XhoI双酶切后，都有载体条带和接近500bpMarker条带的474bp目的基因条带产生。
[0066](9)DNA序列测定:委托大连宝生物生物工程有限公司用全自动DNA序列测定仪分析。
[0067]对步骤8酶切检测后的重组质粒进行DNA序列测定检测，序列测定结果与设计合成的序列完全一致。如果需要列出测序结果，就是文档前面补充的核酸序列。
[0068]测序结果:
[0069]
【权利要求】
1.人胸腺肽β4三倍体蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SED ID Ν0:1所示。
2.人胸腺肽β4三倍体的编码基因，其特征在于，该编码基因的序列如SED ID Ν0:2所
3.人胸腺肽β4三倍体蛋白的分离纯化方法，其特征在于，该方法包括:采用亲和层析柱进行分离纯化。
4.如权利要求3所述的人胸腺肽β4三倍体蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括: 第一步，粗纯化:将诱导表达人胸腺肽β 4三倍体蛋白菌体用水或PBS重悬，煮沸后离心收集上清液； 第二步，利用亲和层析柱对上清液进行纯化分离，所用柱材料是特异性结合亲和标签的柱材料。
【文档编号】C12N15/16GK103864916SQ201410054593
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】陈凯, 季佳菲, 李红民, 陈富林, 王阳阳, 崔继红 申请人:西北大学