一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法
【专利摘要】本发明公开一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法，包括菌种的活化、种子液制备及液体摇瓶发酵，在所述液体药瓶发酵中，向液体发酵培养基加入高浓度KCl，所述高浓度KCl为0.5-30g/L；所述菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）GXA-28，保藏编号为CCTCCNO：M2012347，保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。该方法在发酵初期在液态发酵培养基中添加质量体积浓度为0.5-30g/L的KCl，在保持高分子量高产量γ-聚谷氨酸的基础上，将粘度降为原来的10-80%，解决γ-PGA发酵生产发酵液粘度大的瓶颈问题，有很好的应用前景；且成本低，为工业化生产中产物的分离纯化降低成本。
【专利说明】一种降低Y-聚谷氨酸发酵液粘度的方法 【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵领域，特别涉及到一种降低聚谷氨酸发酵液粘度的方 法。 【背景技术】
[0002] Υ -聚谷氨酸是由L-谷氨酸或者D-谷氨酸通过Υ -酰胺基结合形成的一种水溶 性的生物高分子聚合物。具有很强的吸水性，可降解性，水解性等众多特性，因此被广泛用 于食品、农业、医药、绿化以及水处理等多个领域，具有极大的开发价值和应用前景。
[0003] 根据现在文献报道，Y -PGA是某些细菌荚膜的主要成分，其作用是为了保护菌体 免受外界恶劣环境的影响。故其合成一般是在菌体发酵的中后期，大量代谢废物积累，营养 物质缺乏促进了细菌分泌合成Y-PGA进行自身保护。因此可以认为合成分泌γ-PGA是细 菌应对外界恶劣环境的一种适应机制。目前研究的热点多集中于微生物发酵生产，提高产 量，对如何提高分离提取收率的相关报道非常少。
[0004] 一般认为Y -PGA发酵液的粘度随着产量和分子量的增加而增大，因此在液态发 酵的后期由于Y-PGA浓度增大导致发酵液粘度大大增加，影响氧的传质，进而影响γ-PGA 的合成，这也是提高Y -PGA浓度的一个最大的瓶颈问题。通过加酸或碱调节发酵液ρΗ〈5或 ρΗ>8可明显降低发酵液的粘度（其中ρΗ3. 5时粘度仅为ρΗ6. 5时的1/50左右）。将ρΗ3. 5 的发酵液离心除菌（l〇〇〇〇g，l〇min)后超滤浓缩（滤膜孔径0· 45 μ m，平均压力0· 08Mpa) 1 倍，再加入95%乙醇提取γ -PGA，与pH中性时相比，可减少50%以上的能量消耗及40 %的 溶剂，但聚谷氨酸损失约10%。加酸或加碱处理可使发酵液中Y-PGA的分子结构发生 改变，分子质量降低，这对生产高分子质量的聚谷氨酸不利的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种降低Y -聚谷氨酸发酵液粘 度的方法，该方法在发酵初期在液态发酵培养基中添加质量体积浓度为〇. 5_30g/L的KC1， 在保持高分子量高产量聚谷氨酸的基础上，将粘度降为原来的10-80%，解决Y-PGA发 酵生产发酵液粘度大的瓶颈问题，有很好的应用前景；且成本低，为工业化生产中产物的分 离纯化降低成本。
[0006] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种降低聚谷氨酸发酵液粘度的方法，包括菌种的活化、种子液制备及液体 摇瓶发酵，其特征在于：在所述液体药瓶发酵中，向液体发酵培养基加入高浓度KC1，所述 高浓度KC1为0. 5-30g/L ;所述菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GXA-28,保藏编 号为CCTCC N0:M2012347,保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏 中心。
[0008] 以上所述高浓度KC1为5-30g/L。
[0009] 以上所述液体发酵培养基成分还包括葡萄糖30_50g/L、谷氨酸钠20_40g/L、酵母 膏 2· 5-4. 0g/L、KH2P040. 5-lg/L、MgS040. 1-0. 15g/L，ρΗ6· 5-7. 5,蒸馏水配制。
[0010] 以上所述液体摇瓶发酵的发酵条件为：种子液按体积比1-6%的接种量接入已灭 菌的液体发酵培养基中，在40-50°C摇瓶培养20-30h。
[0011] 以上所述菌种的活化，是将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GXA-28接于固体 斜面培养基上，40?50°C培养8-16h，于2?8°C作短期保藏；所述固体斜面培养基的组成 为：葡萄糖8?12g/L，酵母膏3?6g/L，谷氨酸钠3?6g/L，MgS0 4 · 7H200. 1?0. 2g/L， ΚΗ2Ρ040· 3 ?0· 5g/L，琼脂 10 ?15g/L，pH 值 6· 5 ?7· 5,蒸馏水配制。
[0012] 以上所述种子液制备，是将斜面上1. 0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养 基的250ml三角瓶中，摇床转速160?250rpm，42°C -50°C摇瓶培养16h-18h ;所述液体 种子培养基浓度组成为：葡萄糖10?50g/l，酵母膏2?10g/l，谷氨酸钠5?20g/l， MgS04 · 7Η200· 1 ?0· 5g/l，ΚΗ2Ρ040· 5 ?2g/l，pH 值 6. 5 ?7. 5,蒸馏水配制。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0014] 1.本发明以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GXA_28为出发菌株，在高浓度 KC1条件下发酵生产Υ-PGA，一方面K+增加了基质的渗透压，另一面K+是Υ-PGA合成酶的 促进离子，因此给Y -PGA合成提供了有利的环境，结果是在保持甚至提高产量的基础上， 使分子量提高到了 3000-40001^&，将粘度降为原来的10-80(%，解决了￥^^^浓度增大导 致发酵液粘度增大的技术问题，有很好的应用前景。
[0015] 2.本发明添加 KC1成本低，可以为工业化生产中产物的分离纯化降低成本。 【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为聚谷氨酸的分子量电泳图，
[0017] 图上从左到右依次为Y -聚谷氨酸标品、实施例1-3 γ -聚谷氨酸对照组以及加入 1((：1浓度0.5、1、5、10、15、2(^/1后得到的￥-聚谷氨酸。
[0018] 序列表是菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GXA-28，CCTCC M2012347 的 16S rDNA核苷酸序列信息。 【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于 实施例表示的范围。
[0020] 本发明所利用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GXA-28性状特征为：
[0021] (1)菌体形态特征：
[0022] 菌株CCTCC NO :M2012347在固体斜面培养基上50°C培养16h后电镜观察，菌体呈 杆状，大小0.7-0.9Χ2.0-3.0μπι，可运动，革兰氏染色阳性。菌株CCTCC N0:M2012347在 固体斜面培养基上50°C培养30h后芽孢染色观察，可见明显芽孢。
[0023] (2)菌落形态特征：
[0024] 菌株CCTCC NO :M2012347在固体分离培养基平板上50°C培养24h后，在添加谷氨 酸的平板上，菌落圆形、表面呈树突状、边缘分泌粘稠物、菌落直径达1. 5-2. 0cm ;在不添加 谷氨酸的平板上，菌落干燥、扁平、中央凹陷、边缘不规则。
[0025] 菌株CCTCC NO :M2012347在液体分离培养基中培养，在液体表面可形成菌膜，培 养液略显浑浊。
[0026] (3)CCTCC NO :M2012347生理生化性质如下表3所示。
[0027] 表 1
[0028]
【权利要求】
1. 一种降低聚谷氨酸发酵液粘度的方法，包括菌种的活化、种子液制备及液体摇 瓶发酵，其特征在于：在所述液体药瓶发酵中，向液体发酵培养基加入高浓度KC1，所述高 浓度KC1为0. 5-30g/L ;所述菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GXA-28,保藏编号 为CCTCC NO :M 2012347,保藏日期为2012年9月14日，保藏单位：中国典型培养物保藏中 心。
2. 根据权利要求1所述的降低聚谷氨酸发酵液粘度的方法，其特征在于：所述高 浓度 KC1 为 5-30g/L。
3. 根据权利要求1或2所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法，其特征在于：所 述液体发酵培养基成分还包括葡萄糖30-50 8/1、谷氨酸钠20-40 8/1、酵母膏2.5-4.0 8/1、 ΚΗ2Ρ04 0· 5-1 g/L、MgS04 0· 1-0. 15 g/L，pH 6. 5-7. 5,蒸馏水配制。
4. 根据权利要求3所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法，其特征在于：所述液 体摇瓶发酵的发酵条件为：种子液按体积比1-6%的接种量接入已灭菌的液体发酵培养基 中，在40-50°C摇瓶培养20-30h。
5. 根据权利要求3所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法，其特征在于：所述 菌种的活化，是将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上， 4(T50°C培养8-16h，于2~8°C作短期保藏；所述固体斜面培养基的组成为：葡萄糖8~12g/ L，酵母膏：T6g/L，谷氨酸钠：T6g/L，MgS04*7H20 0· 1、· 2g/L，ΚΗ2Ρ04 0· 3、· 5g/L，琼脂 10?15g/L，pH值6.5?7.5,蒸馈水配制。
6. 根据权利要求5所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法，其特征在于：所述种 子液制备，是将斜面上1. 〇cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，摇 床转速160?250rpm，42°C -50°C摇瓶培养16h-18h ;所述液体种子培养基浓度组成为：葡 萄糖 10-30g/L、谷氨酸钠 5-10 g/L、酵母膏 5-8 g/L、KH2P04 0.5-1 g/L、MgS04 0.1-0. 15 g/ L、pH 6· 5_7· 5〇
【文档编号】C12R1/125GK104087628SQ201410174064
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】陈桂光, 王青龙, 曾伟, 梁智群 申请人:广西大学