环糊精在原核可溶性表达系统中降低细胞毒性的用途
【专利摘要】本发明公开一种环糊精在原核可溶性表达系统降低细胞毒性的用途，解决由于可溶性表达核糖核酸酶所产生的细胞毒性，通过添加环糊精，不仅降低IPTG对使大肠杆菌BL21-onconase的细胞毒性和生长抑制，而且减少由于可溶性表达蛋白造成对细胞生长的影响，增加可溶性蛋白的表达，为下一步通过分离纯化药用蛋白奠定基础。
【专利说明】环糊精在原核可溶性表达系统中降低细胞毒性的用途
[0001]
【技术领域】： 本发明公开一种环糊精在原核可溶性表达系统中降低细胞毒性的用途，解决由于可溶 性表达外源蛋白（如蛙卵核糖核酸酶）所产生的细胞毒性，增加具有生物活性蛋白的产量， 属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 原核细胞表达系统，具有方法简单、产物便于纯化和易鉴定等优点，是构建基因工 程菌首选的表达系统。在基因重组技术中，以大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物往 往因为环境不利而产生细胞毒性，一方面抑制细胞的生长，另一方面会使外源基因在体内 形成无活性的蛋白质聚集体(包涵体)。使无活性的蛋白质变成有活性的过程为蛋白质复 性。文献中曾报道过多种蛋白质复性技术，但结果不是十分理想。
[0003] 对于解决细胞毒性表达产物的方法，一般可以采用三种方法，一是用真核生物表 达系统，但由于真核表达系统的复杂性和发酵时间相对较长，限制其进一步应用；二是采用 基因融合的表达方法，即将细胞毒性产物的编码基因和另外的基因序列连接在一起进行表 达，然后再把产物剪切，得到具有细胞毒性的产物，但因纯化过程繁琐导致其产量不高；三 是仍然利用原核系统，通过包涵体形式经复性得到重组蛋白，而包涵体复性一直是蛋白纯 化领域的难题。
[0004]
【发明内容】
本发明提供一种环糊精在原核可溶性表达系统降低细胞毒性的用途，将环糊精作为小 分子伴侣，添加到可溶性表达核糖核酸酶（onconase)的基因工程菌BL21-〇nconase培养基 中，考察其对大肠杆菌BL21_onconase可溶性表达Onconase时细胞毒性的影响，提供一种 通过降低细胞毒性从而提高原核中可溶性表达外源蛋白的方法。
[0005] 本发明通过对大肠杆菌BL21-〇nc〇naSe的发酵实验表明环糊精在原核可溶性表 达系统中降低细胞毒性的用途，具体操作过程如下： 1) 挑取单克隆 BL21-〇nconase 接种于 5ml LB 培养基（100g/ml Ampicillin)，37°C培 养过夜，按1.2%(v/v)接种于100ml LB培养基（100 g/ml Ampicillin)中，37°C培养，当 菌液的〇D6(?为0. 6时，加入0. 1 mM IPTG和1.0%β-环糊精，30 °C诱导表达4h; 2) 诱导表达结束后，离心（6000 rpmX 10 min),收集菌体； 3) 菌体于20 mM，pH 6. 5 PBS中反复洗漆两次，离心，重悬于等体积的20 mM，pH 6. 5 PBS中，加入PMSF (100 μ g/ml异丙醇)，采用反复冻融裂解和冰浴下超声破碎法破碎菌体， 离心（15000 rpmX30 min)，收集上清液，进行12% SDS-PAGE分析，结果用凝胶成像定量分 析软件分析，以沉淀重量表示细胞的生长情况，目的蛋白表达量占全菌可溶性蛋白量的比 例为指标，进行比较分析，结果见图1和图2。
[0006] 图1结果表明，在未添加环糊精，当IPTG浓度从0. 1-lmM逐渐增加时，菌体的重量 从4. 5 g/L降低到3. 5 g/L，说明IPTG诱导的可溶性表达产生细胞毒性；加入β -环糊精 后在IPTG浓度不变，如0. 1 mM，当环糊精的含量从0. 2%增加到1. 0%的时候，菌体的重量从 5. 1 g/L增加到7.2 g/L，表明加入环糊精增加了菌体的重量，减少了 IPTG造成的细胞毒性 和生长抑制，促进了细胞生长。
[0007] 图2结果表明，在1.0% β-环糊精，0· ImM IPTG下，BL21_onconase细胞中的 onconase可溶性表达量最高，是对照组的4. 7倍。小分子化学伴侣不仅可以降低细胞毒性 促进重组蛋白表达，而且可以显著提高表达的onconase在可溶性蛋白中的组分。总之，环 糊精可降低IPTG诱导产生的细胞毒性作用。
[0008] 本发明的积极效果在于：通过添加环糊精，不仅降低IPTG对使大肠杆菌 BL21-〇nc〇naSe的细胞毒性和生长抑制，而且减少由于可溶性表达蛋白造成对细胞生长的 影响，增加可溶性蛋白的表达，为下一步通过分离纯化药用蛋白奠定了基础。
[0009]
【专利附图】
【附图说明】： 图1环糊精对菌体重量的影响； 图2环糊精对蛋白含量的影响。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 娃核糖核酸酶（onconase)的来源有两种，一是从林娃卵中提取，但由于来源有限，并 在提取过程中常采用有机溶剂会影响其生物活性，限制了其应用；二是采用基因工程方法 构建工程菌，原核表达中通常采用pFlag-CTS表达系统，载体有甲硫氨酸（M)引导的0ΜΡΑ 信号肽，在原始表达产物的N末端，它可以引导表达产物到达细胞的周质腔，并在细胞内 被酶水解0ΜΡΑ，产生有活性蛋白。也是基于这个原因，在细胞内会产生细胞毒性，影响细胞 生长并进一步影响外源基因的表达，常规实验室表达条件下较难难得到表达产物，Western blot检测常常显示阴性。本发明将提供一种环糊精在原核可溶性表达系统降低细胞毒性 的用途，不但降低细胞毒性，而且提高目标蛋白的表达。
[0011] 将表达核糖核酸酶的基因工程菌BL21-0nconase在37°C培养至菌液的0D600达 到0.6时，加入0.1 mM IPTG和1.0% β-环糊精，30 °C诱导表达4h;收集菌体；菌体破碎， 收集上清液，进行12% SDS-PAGE分析，结果用凝胶成像定量分析软件分析，以沉淀重量表示 细胞的生长情况，目的蛋白表达量占全菌可溶性蛋白量的比例为指标。由图1结果显示， 在未添加环糊精，当IPTG浓度从0. 1-lmM逐渐增加时，菌体的重量从4. 5 g/L降低到3. 5 g/L，说明IPTG诱导的可溶性表达产生细胞毒性；加入β -环糊精后在IPTG浓度不变，如 0. ImM，当环糊精的含量从0. 2%增加到1. 0%的时候，菌体的重量从5. 1 g/L增加到7. 2 g/ L，表明加入环糊精增加了菌体的重量，减少了 IPTG造成的细胞毒性和生长抑制，促进了细 胞生长。
[0012] 图2结果表明，在1.0% β-环糊精，0· ImM IPTG下，BL21_onconase细胞中的 onconase可溶性表达量最高，是对照组的4. 7倍。小分子化学伴侣不仅可以降低细胞毒性 促进重组蛋白表达，而且可以显著提高表达的onconase在可溶性蛋白中的组分。
[0013] 结论：环糊精可降低IPTG诱导产生的细胞毒性作用。
[0014] 实施例2 以具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的单链抗体（ScFv)为例，构建了大肠杆菌Rosetta 含有重组质粒pPelB-ScFv的原核可溶性表达系统，表达蛋白时菌体浓度0D_ = 0. 6,诱导 剂IPTG浓度1.0 mM，诱导时间为5 h，结果在1 L培养液中菌体的湿重为1.7 g，菌体裂解 液上清中总蛋白量为57 mg，单链抗体在裂解液上清液中所占的比例是10%;在上述条件完 全相同的情况下，加入1.0%β-环糊精，结果是1 L培养液中菌体的湿重为3.3 g，菌体裂解 液上清中总蛋白量为120 mg，单链抗体在裂解液上清液中所占的比例是22%。
[0015] 结论：通过加入环糊精，降低了 IPTG诱导引起的细胞毒性，维持了细胞的生产，并 促进了蛋白的表达。
[0016] 实施例3 乙醇脱氢酶Il(adhll)原核可溶性表达时，选择pET-32a(+)表达载体，构建了重组质 粒pET-adhll，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到BL21-adhII基因工程菌，培养细菌至菌体浓 度0D_ = 0.6,诱导剂IPTG浓度0.5 mM，诱导时间为5 h，结果在1 L培养液中菌体的湿重 为2.0 g，菌体裂解液上清中总蛋白量为69 mg，单链抗体在裂解液上清液中所占的比例是 12%，；在上述条件完全相同的情况下，加入0.5%β-环糊精，结果是1 L培养液中菌体的 湿重为3. 9g，菌体裂解液上清中总蛋白量为150 mg，单链抗体在裂解液上清液中所占的比 例是31%。
[0017] 结论：通过加入环糊精，降低了 IPTG诱导引起的细胞毒性，维持了细胞的生产，并 促进了蛋白的表达。
【权利要求】
1.环糊精在原核可溶性表达系统中降低细胞毒性的用途。
【文档编号】C12N9/22GK104140960SQ201410363908
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】林凤, 李博超, 邱芳萍 申请人:吉林大学