一种检测胆汁淤积性黄疸致病基因的dna文库及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种通过高通量测序技术检测胆汁淤积性黄疸致病基因的DNA文库及其应用。具体说是根据60个胆汁淤积性黄疸致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确胆汁淤积性黄疸的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。本发明具有准确、灵活、快速、低成本的特点；本发明涉及的60个基因检测区域能够检测15种常见的胆汁淤积遗传缺陷，对胆汁淤积性黄疸的鉴别诊断有着重要意义和临床价值。
【专利说明】一种检测胆汁淤积性黄疸致病基因的DNA文库及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过高通量测序技术检测胆汁淤积性黄疸致病基因的DNA文库 及其应用。具体说是根据胆汁淤积性黄疸致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区 域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序 技术进行测序，寻找致病突变，明确胆汁淤积性黄疸的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学 和分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
【背景技术】
[0002] 胆汁淤积性黄疸是婴儿期常见的临床症状，其发生率约是活产新生儿的4/10000。 引起婴儿胆汁淤积性黄疸的病因较多，预后悬殊，故早期诊断和治疗极为重要。研究显示超 过25%的胆汁淤积性黄疸是由遗传缺陷造成的，许多遗传疾病的临床表型都包括婴幼儿时 期的胆汁淤积性肝病。人们最初从a 1抗胰蛋白酶缺乏性黄疸导致的新生儿胆汁淤积的研 究中，逐渐认识到多种遗传疾病都会导致胆汁淤积。随着分子医学的发展，一系列的遗传 因素引起的婴儿肝内胆汁淤积症性黄疸其相关基因突变在世界范围内被发现和认识，包括 进行性家族性肝内胆汁游积性黄痕（progressive familial intrahepatic cholestasis， PFIOl型（定位于染色体18q21的ATP8B1基因突变）、2型（定位于染色体2q24的ABCBll 基因突变）和3型（定位于染色体7q21. 1的ABCB4基因突变）、Alagille综合征（定位 于染色体20pl2的JAGl基因突变）、Citrin缺陷引起的新生儿肝内胆汁游积症（neonatal intrahepatic cholestasis caused by Citrin defi-ciency, NICCD)(定位于染色体 7q21. 3的SLC25A13基因突变）、各种胆汁酸合成缺陷病（HSD3B7，AKR1D1，CYP7B1等基因突 变）等°
[0003] 现有的诊断技术，包括肝脏病理检查等可以结合临床特征对Alagille综合征等 临床疾病进行确诊，但肝脏病理需要肝穿刺，属于创伤性检查；而PFICl型及PFIC2型临床 表型相似，药物治疗效果欠佳，部分胆汁转流术和（或）肝移植是治疗的选择之一。然而最 新研究发现许多PFICl型患者进行活体肝移植后，移植肝可出现严重肝脏病变，因此PFICl 型患者并不像PFIC2型患者那样适合肝脏移植。同时PFICl型患者有可能发生耳聋，因此 需要定期检查，了解有无听力障碍发生。但目前仅结合临床症状、生化及病理检测有时不能 将两者很好区分；同时，基于Sanger测序的基因检测方法存在通量低的弊端，一次反应只 能检测一个扩增区域，无法满足庞大的基因检测区域和多样本检测时效性的要求。
[0004] 因此，有必要寻求一种新的检测胆汁淤积性黄疸致病基因的方法，能避免创伤性 检查、提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
【发明内容】
[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种包含60个遗传性病理性黄疸相关疾病的致病 基因的DNA文库。其中60个基因如下：
[0006]
[0007]
【权利要求】
1. 一种基于Ion Torrent?高通量测序技术诊断遗传性胆汁淤积相关疾病的DNA文库， 其特征在于，该文库包括60个遗传性病理性黄疸相关的致病基因。
2. 权利要求1所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用 于诊断胆汁淤积性黄疸相关疾病。
3. 权利要求1所述的DNA文库在制备诊断装置中的应用，其特征在于，所述诊断装置用 于诊断胆汁淤积性黄疸相关疾病。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
5. 如权利要求2-4任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤： (1) 提供受:试者样本的基因组DNA ; (2) 利用权利要求1所述的DNA文库从Ion Torrent?高通量测序平台自动合成覆盖 全部60个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增； (3) 对步骤（2)得到的扩增产物进行酶切； (4) 对步骤（3)得到的酶切产物加Barcode接头； (5) 对步骤（4)得到的连接产物进行纯化； (6) 对步骤（5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增； (7) 对步骤（6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域 扩增文库； (8) 对步骤（7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于 ISP珠子，得到反应液； (9) 将步骤⑶得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion Torrent?高通量测序 进行测序； (10) 将步骤（9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突 变位点； (11) 对步骤（10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织 器官样本。
7. 如权利要求2-6任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用进一步用于指导 治疗。
8. -种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA文库。
9. 一种诊断装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1所述的DNA文库。
10. 如权利要求9的诊断装置，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
【文档编号】C12Q1/68GK104313698SQ201410591207
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】汪道文, 王宏 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院