肺炎衣原体检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及生物【技术领域】，特别涉及肺炎衣原体检测试剂盒。本实用新型提供了一种肺炎衣原体检测试剂盒，包括：盒体（1）；盒体（1）内设置有海绵垫（2）、八联PCR反应管（3）和说明书（4）；海绵垫（2）设置有5个容器孔（5），容器孔放置有：样本处理液管（51）、反应液A管（52）、反应液B管（53）、阳性对照管（54）、阴性对照管（55）。本实用新型提供的试剂盒组成结构简单，其中配制有八联PCR反应管（3），提高了使用的方便性，能够实现对肺炎衣原体的快速准确检测。
【专利说明】肺炎衣原体检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及生物【技术领域】，特别涉及肺炎衣原体检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，CP)是一种严格真核细胞内寄生的原核细胞 微生物，与鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣^体共同 组成嗜衣原体属。肺炎衣原体基因组大小约1. 2Mbp、由21个Pmp基因、一个III型分泌毒 力因子系统基因、3个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和2个磷脂酶一D样蛋白基因组成。其 染色体DNA G+Cmol%含量为40%,但与沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体的同源性小于10%，限制 性内切酶图谱极不相同。世界不同地区分离得到的肺炎衣原体不同株 DNA的同源性可达 94%以上，限制性内切酶图谱基本一致，标准株为TW-I83和AR-39。肺炎衣原体只有一个血 清型，代表株为TWAR。肺炎衣原体具有属特异性抗原和种特异性抗原，属特异性抗原主要 有两个抗原决定簇表位，一个是肺炎衣原体LPS核心多糖的第三个KD0残基，一个是分子量 为39. 5KDa的主要外膜蛋白（M0MP)，这两个抗原决定簇均对甲醇敏感，与其它衣原体种间 存在交叉；肺炎衣原体的种特异性抗原为98KDa的主要外膜蛋白（M0MP)，该抗原对丙酮敏 感，并不与沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体抗血清发生交叉反应。
[0003] 肺炎衣原体的感染极为普遍，无显著的性别和地区差异，一年四季均可发生，主要 引起人类的呼吸道感染和非典型性肺炎，与人口密度呈正相关，临床上多以隐性、持续性感 染的形式存在，其反复迁延导致难以治疗的并发症。研究发现肺炎衣原体与哮喘、支气管 炎、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病等心脑血管疾病的发生和发展密 切相关。肺炎衣原体的感染率随着年龄的增加迅速上升,儿童感染率在20%左右，青壮年 感染率可达50-60%，老年的感染率为70-80%。肺炎衣原体通过呼吸道分泌物进行人与人 传播，在家庭、学校、军队以及其他人口集中的工作区域可存在小范围的流行。目前，肺炎 衣原体已是继肺炎链球菌和流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎（community acquired pneumonia, CAP)的主要病原体，肺炎衣原体急性感染率占23%，肺炎病人仅占感染者的小 部分，70-90%为亚临床表现。肺炎衣原体感染的潜伏期为15-23天，可引起上呼吸道感染， 如鼻窦炎、中耳炎和咽炎，也可引起下呼吸道感染，如支气管炎和肺炎。呼吸道感染多数表 现为咽痛、发热、咳嗽，病情通常较轻，有自限性。老年肺炎衣原体肺炎病人症状可能较为严 重，有时甚至致死，尤其是在合并细菌性感染或存在慢性阻塞性肺疾病时，其致死几率大大 增加。因此，肺炎衣原体感染早期诊断对于尽早发现和治疗肺炎衣原体感染性疾病非常重 要。
[0004]目前对肺炎衣原体的实验室诊断方法主要有病原体分离培养技术、血清学诊断技 术和核酸检测技术等方法。因为肺炎衣原体是一种极难培养的衣原体，其抵抗力较弱，对室 温或冰冻敏感，难以从临床标本中分离培养成功，传代也比较困难，所以不适合采用病原体 分离培养技术进行诊断。目前临床上常用的肺炎衣原体的检测方法主要是检测特异性抗体 的方法。由于病原体进入机体进行复制、抗原刺激到产生抗体需要一定时间，导致这种方法 仍不能满足早期病原体确诊的需要，进而不能满足进行早期积极治疗的临床需求。
[0005] 实时荧光定量PCR技术是近些年来迅速发展起来的一种核酸检测技术。实时荧光 定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个p CR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。因为实时焚光定量PCR技术的 检测物为致病病原体基因核酸，所以能够准确检测处于疾病各个时期的病原体。目前实时 荧光定量PCR所使用的荧光化学可以分为两种：荧光探针和荧光染料。由于 Tacpan探针具 有特异性强、准确性高、对引物及试剂要求不高等优点，使该类型的荧光探针常用于实时荧 光定量PCR。
[0006] 因此，为了实现将实时荧光定量PCR技术应用于肺炎衣原体的检测，很有必要提 供一种结构简单，能够快速检测肺炎衣原体的核酸检测试剂盒。 实用新型内容
[0007] 有鉴于此，本实用新型提供了肺炎衣原体检测试剂盒。该试剂盒结构简单，可用于 肺炎衣原体感染的临床快速诊断。
[0008] 为了实现上述实用新型目的，本实用新型提供以下技术方案：
[0009] 本实用新型提供了一种肺炎衣原体检测试剂盒，包括：盒体（1);
[0010] 盒体（1)内设置有海绵垫（2)、八联PCR反应管（3)和说明书（4);
[0011] 海绵垫（2)设置有5个容器孔（5)，容器孔放置有：样本处理液管（51 )、反应液A管 (52)、反应液B管（53)、阳性对照管（54)、阴性对照管（55)。
[0012] 作为优选，海绵垫（2)的体积占盒体（1)容积的二分之一。
[0013]海绵垫（2)上设置有容器孔，可将溶液管固定于盒体内。一方面使各试剂之间便 于区分，另一方面减少运输或使用过程中试剂之间的相互碰撞或倾倒。
[0014] 作为优选，八联PCR反应管（3)为0. 2mL的高管或0. lmL的矮管。
[0015] 作为优选，八联PCR反应管（3)带有八联管盖。
[0016] 优选的，八联PCR反应管（3 )装于自封袋中。
[0017] 作为优选，八联PCR反应管（3)的数量为4条。
[0018] 作为优选，样本处理液管（51)内装有样品处理液，所述样品处理液pH值为8. 0,包 括：
[0019] Tri^?l 1 Ommol/L； EDTA 1 mmol/L; NaCl 0.15mol/L; NP-40 0 lrng/mL; SDS lmg/mL?
[0020] 作为优选，反应液A管（52)内装有反应液A，包括：
[0021] Trts-Hci i 細 〇勵 KCl 5 mmol/L; MgCl2 di^TP/dUTP Mixture SOO^imol/L ； BSA Img/niL; 上游引物 100nmdl/l4 下游引物 lOOnmol/L;
[0022] ## 5QitmoML,
[0023] 优选的，上游引物序列为：5 ' -TTCCCCTTGCCMCAGACG-3 ' ；
[0024] 下游引物序列为：5' -GGCTGAGCAATGCGGATGT-3' ；
[0025] 探针序列为：5 ' FAM-CGACCATCMTTATC-MGB3 '。
[0026] 作为优选，反应液B管（53)内装有反应液B，包括：Taq DNA聚合酶与UDG酶，其中 Taq DNA聚合酶与UDG酶的体积比为10:1。
[0027] 作为优选，阳性对照管（54)内装有阳性对照液，包括：肺炎衣原体质粒。
[0028] 优选的，肺炎衣原体质粒的浓度为104Copies/y L。
[0029] 作为优选，阴性对照管（54)内装有阴性对照液，阴性对照页的PH值为8. 0,其中包 括：
[0030] Tris-HCl 10mmol/L ；
[0031] EDTA lmmol/L〇
[0032] 本实用新型提供了一种肺炎衣原体检测试剂盒，包括：盒体（1);盒体（1)内设置 有海绵垫（2)、八联PCR反应管（3)和说明书（4);海绵垫（2)设置有5个容器孔（5)，容器 孔放置有：样本处理液管（51)、反应液A管（ 52 )、反应液B管（53 )、阳性对照管（54)、阴性对 照管（55)。本实用新型提供的试剂盒组成结构简单，其中配制有八联PCR反应管（3)，且试 剂的拿取方便，不易混淆，提高了使用的方便性，且使用本实用新型提供的试剂盒能够在2h 内完成对肺炎衣原体的检测，实现了对肺炎衣原体快速准确检测的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1示本实用新型提供的肺炎衣原体检测试剂盒结构示意图；其中1为盒体，2为 海绵垫，3为八联PCR反应管，4为说明书，5为容器孔，51为样本处理液管，52为反应液A 管，53为反应液B管，54为阳性对照管，δ5为阴性对照管。
【具体实施方式】
[0034]本实用新型公开了一种肺炎衣原体检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员 来说是显而易见的，它们都被视为包括在本实用新型内。本实用新型已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本实用新型内容、精神和范围内来实现和应用本实 用新型技术。
[0035] 下面结合实施例，进一步阐述本实用新型。
[0036] 实施例1肺炎衣原体核酸扩增检测试剂盒的结构
[0037] 如图1所示，本实用新型一种肺炎衣原体核酸扩增检测试剂盒，其包括盒体（1)和 海绵垫（2)，海绵垫（2)的体积大小为盒体的二分之一，上面设有五个容器孔（5)，分别用于 放置：样本处理液管（51)、反应液A管（52)、反应液B管（53)、阳性对照管（54)、阴性对照管 (55)。盒体中另一半空间用于放置八联PCR反应管（3)和说明书（4)。
[0038] 实施例2肺炎衣原体核酸扩增检测试剂盒的制备
[0039] 1、配制各溶液：
[0040] a、样本处理液：样本处理液配制使用的试剂级别均为分析纯，称取所需重量后，以 灭菌超纯水配制成，其中 Tris-HCl (ρΗ8· 0) 10mmol/L ;EDTA(pH8. 0) lmmol/L ;NaC10. 15mol/ L ；NP-401mg/mL ；SDSlmg/mL〇
[0041] b、反应液 A:
[0042] 其中包括：Tris-HCl lmmol/L ;KCl5mmol/L ;MgCl24. 8mmol/L ;dNTP/dUTP Mixture200ymol/L ;BSAlmg/mL ;上游引物 lOOnmol/L ;下游引物 lOOnmol/L ;探针 50nmol/ L〇
[0043] 上游引物序列为：5' -TTCCCCTTGCCAACAGACG-3'
[0044] 下游引物序列为：5，-GGCTGAGCAATGCGGATGT-3 '，
[0045] 探针序列为：5' FAM-CGACCATCAATTATC-MGB3'
[0046] 根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后即得。
[0047] c、反应液B :CP PCR反应液B由Taq DNA聚合酶、UDG酶组成。其中Taq DNA聚合 酶的酶活力为5U/μ L，购买自宝生物工程(大连）有限公司；UDG酶的酶活力为5U/μ L，购 买自New England Biolabs公司。根据实际需求，取Taq DNA聚合酶与UDG酶按照体积比 10:1进行混合，即得，低温保存。混合后，Taq DNA聚合酶的酶活力为4. 5U/ μ L ;UDG酶的酶 活力为〇. 4δυ/μ L，
[0048] d、阴性对照：由 Tris-Hcl 和 EDTA 组成，其中 Tris-Hcl 的浓度为 10ramol/L，EDTA 的浓度为lram〇l/L，以无菌超纯水配制调节pH为8. 0。
[0049] e、阳性对照：肺炎衣原体质粒，浓度为l〇4Copies/ μ L。
[0050] 2、按照市场需求，将所得样本处理液、反应液Α、反应液Β、阳性对照和阴性对照分 装至分别独立包装，贴标签后，置于试剂盒盒体内的海绵垫上，在盒体内装入八联PCR反应 管和说明书，即得。
[0051] 实施例3肺炎衣原体核酸扩增检测试剂盒的使用
[0052] 取实施例2制得的试剂盒，考察本实用新型提供的试剂盒在检测肺炎衣原体 98KDa Μ0ΜΡ基因中的应用。
[0053] 本实用新型提供的试剂盒适用于实时荧光定量PCR，该试剂盒适用于实时荧光定 量PCR，使用时，以试剂盒中所带的阴性对照和阳性对照作为检测模板，根据扩增曲线定性 判定检测结果。
[0054] 质控结果判定必须符合下述条件：
[0055] 阴性对照：阴性无扩增，结果为阴性。
[0056]阳性对照：结果为阳性，且在FAM荧光通道下的Ct值为25 < Ct彡29。
[0057]以上两项需在一次试验中同时满足，否则，本次实验无效，全部实验应重新进行。 [0058] 样本检测结果判定：
[0059] FAM荧光通道下结果判断：根据仪器的要求设置好基线和阈值后，仪器会自动分 析并计算出每个样本的ct值，其中扩增曲线呈现典型的"S"型且Ct < 37,则判断结果为阳 性；无 ct值或Ct值为40,则判断结果为阴性；如37 < Ct值< 40之间，建议此样本重做， 若重新检查Ct值< 40则判断为阳性，否则判断为阴性。
[0060]以104Copies/ μ L肺炎衣原体质粒为模板，按照30 μ L的体系配制PCR反应体系， 其中：
[0061] 反应液 A 27. 78 μ L，
[0062] 反应液 Β 0. 22 μ L,
[0063] 模板 2 μ L。
[0064] 按照下列反应条件进行反应：
[0065]
【权利要求】
1. 一种肺炎衣原体检测试剂盒，包括：盒体（1); 所述盒体（1)内设置有海绵垫（2)、八联PCR反应管（3)和说明书（4); 所述海绵垫（2)设置有5个容器孔（5)，所述容器孔（5)放置有：样本处理液管（51)、反 应液A管（52 )、反应液B管（53 )、阳性对照管（54)、阴性对照管（55 )。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述海绵垫（2)的体积占所述盒体（1) 容积的二分之一。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述八联PCR反应管（3)为0. 2mL的高 管或0. lmL的矮管。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述八联PCR反应管（3)带有八联管 盖。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述八联PCR反应管（3)的数量为4条。
【文档编号】C12Q1/68GK204039404SQ201420194714
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】柳辉 申请人:深圳康美生物科技股份有限公司