本
技术实现要素：
属于生化物品的制备技术领域，涉及一种纳豆发酵花粉的生产方法。
背景技术：
花粉是植物的雄性繁殖细胞，类似于动物的精子。花粉虽小，但由它可以繁殖成新的植物体，所以称花粉是植物的“生命之源”，它集中了整个植物体的精华，含有丰富的营养成分和药用成分，国际上誉之为完全细胞营养素。它不仅携带着生命的遗传信息，而且包含着孕育新生命所必需的全部营养物质，是植物传宗接代的根本，含有丰富的细胞学水平的营养成分，如蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、活性酶、黄酮类化合物、脂类、核酸、芸苔素、植酸等，其中氨基酸含量及比例是最接近联合国粮农组织(FAO)推荐的氨基酸模式，这在天然食品中极其少见。花粉由蜜蜂采集的称为蜂花粉，因为它不仅仅是花粉，还包含蜜蜂在采集过程中加入的特殊的腺体分泌物，因而具有独特的天然保健作用与医疗及美容价值。
花粉是蜜蜂营养来源的保证，蜂王浆是花粉经蜜蜂体内转化后得到的“营养精华的结晶”。然而，蜂王浆的产量是有限的，所以如何人为的将花粉转化，使其营养更加丰富并产生类似蜂王浆的营养价值，长期以来也一直是本领域技术人员致力解决的问题。微生物发酵就是利用微生物生长过程中产生的大量酶类(酵素)，将营养物质进行转化的技术,微生物发酵可以化腐朽为神奇,将平淡无奇的米、面、大豆转化为酒、醋、酱等美味和营养易于吸收的新物质。人们平日生活中常见的酒、醋、酱、腐乳等等均是发酵产品。花粉在蜜蜂体内酶类的作用下转化为蜂王浆，以往人们就是利用不同微生物组合，产生所需酶类，将花粉转化为类似蜂王浆作用的“类皇浆”。其特点是，1、维生素含量增加，特别是人体不能自己合成的维生素K2可以将血钙转化为骨钙，预防和治疗老年骨质疏松；2、大分子蛋白降解形成大量的活性多肽，对降压、降血糖、降血脂有帮助；3、黄酮类含量增加，降血压、血脂、抗病毒能力增强；4、形成一些特有多糖，刺激免疫功能增强；另外它们还会产生一些特殊酶类，如纳豆激酶，可以预防心梗，疏通和软化血管，预防心血管疾病。因此，发酵花粉所形成的“类皇浆”不失为强生健体的保健圣品。
可用于发酵的菌株众多，其中纳豆芽孢杆菌是目前研究热点之一。纳豆在日本已经有1000多年的历史，其最初是利用厨房稻草上的枯草芽孢杆菌发酵黄豆制成，是素食僧侣们的重要食物营养来源，而后在皇室也逐渐流行起来。1996年日本掀起了全民食纳豆的热潮。日本政府在其开展的“食育计划”中专门将纳豆作为专项进行部署，即从小培养儿童青少年食用纳豆。日本全民食用纳豆不到10年，就成为了世界上公认的第一长寿大国。黄豆在纳豆芽孢杆菌发酵作用下，100g的纳豆中就包括不同的氨基酸(16g)，维他命B1(0.07mg)，维他命B2(0.56mg)，维他命B6(0.24mg)，纤维(6.7g)等，特别是发酵产生的纳豆激酶具有溶栓功能，可以口服吸收清楚血栓，用于冠心病，脑血栓和动脉硬化的治疗。
目前，国家药监局已经批准的国产纳豆保健食品共有14种，其功能为增强免疫力和辅助降血脂。日本，韩国等国家近年来也研制出了多种以纳豆激酶为主要功效的产品，仅美国和欧洲的营养品及功能性食品每年的营销额就达5000亿美元，纳豆激酶作为功能性食品和保健品的发展迅速，拥有广阔的前景。
花粉本身虽然营养丰富，但往往带有少量异味(如腥味)，部分人群不易接受，而且花粉经蜜蜂转化成蜂王浆后，营养更加全面和易于吸收，我们是否可以人为模拟蜜蜂，将花粉经微生物发酵转化成为“类蜂皇浆”哪？本发明的目的就是消除花粉的异味，同时将花粉中营养成分转化成对人体更有营养价值和更易被人体吸收的成分。人类利用微生物发酵虽然已有上千年的历史，但由于花粉来源有限，属于珍惜物品，过去从未有人曾奢侈地利用花粉为原料进行发酵。只有当今养蜂规模化，蜂花粉来源广泛，数量有了保证，人们才陆续开始了这方面的研究。而纳豆虽是风靡日本的食品，但只是近两年才开始引进我国，在国内纳豆尚未被多数人群接受，所以迄今尚未有人考虑将花粉和纳豆两者进行有机的结合，故市场上目前也尚没有这类产品。
发明内容
本发明的目的在于对现有技术存在的问题加以解决，提供一种以黄豆和花粉为原料制作纳豆发酵花粉的生产方法，在发挥花粉原有营养素的基础上，结合纳豆菌发酵产生的溶血栓的纳豆激酶和促进骨钙吸收的维生素K2，由此赋予花粉新的功能和魅力。
为实现以上目的的技术解决方案如下所述。
一种纳豆发酵花粉的生产方法，其特征在于以黄豆为营养原料对纳豆芽孢杆菌进行扩增培养，并以此培养物为基础加入花粉进行花粉发酵，具体包括固体发酵法和液体发酵法两种：
1)固体发酵法，包括下述步骤：
1a、纳豆芽孢杆菌培养液(纳豆菌液)的制备——分别选取多个品牌的纳豆原料，对各品牌纳豆原料分别用普通营养琼脂平板分离纯化得到相应的多种纳豆菌株，用纤维蛋白平板法分别测定各纳豆菌株产生纳豆激酶的能力，选出产纳豆激酶能力最强的个体，-70℃冰箱保存菌种，作为生产菌种；将生产菌种接种于LB液体营养培养基，35℃～40℃，每分钟150～200转摇床培养16～24小时过夜，获得纳豆芽孢杆菌种培养液；
1b、将黄豆用水浸泡12～24小时过夜，115℃～130℃高压灭菌20～30分钟，以高压后黄豆软糯为准，冷却至40℃；
1c、在高压后软糯黄豆上按2％～10％的质量比例接入液体培养过夜的纳豆芽孢杆菌，搅拌均匀后，培养8～24小时，培养温度为20℃～40℃，至黄豆表面生长有灰白色菌膜；
1d、将花粉隔水蒸30分钟，冷却至室温，然后将冷却后的花粉与表面生长有灰白色菌膜的黄豆按1:1～10的质量比例拌和，继续发酵24～48小时；
1e、收集发酵的黄豆和花粉的混合物，真空冰冻干燥36～48小时，真空要求≤10Pa，真空冰冻干燥起始温度为-30～-50℃，真空冰冻干燥12小时后，每小时升温5℃，温度升至25℃后维持至完全干透为止，获得干燥菌体；
1f、用冷循环粉碎机将干燥菌体粉碎成50～100目的细粉，包装，制得产品；
2)液体发酵法，包括下述步骤：
2a、纳豆芽孢杆菌培养液(纳豆菌液)的制备——分别选取多个品牌的纳豆原料，对各品牌纳豆原料分别用普通营养琼脂平板分离纯化得到相应的多种纳豆菌株，用纤维蛋白平板法分别测定各纳豆菌株产生纳豆激酶的能力，选出产纳豆激酶能力最强的个体，-70℃冰箱保存菌种，作为生产菌种；将生产菌种接种于LB液体营养培养基，35℃～40℃，每分钟150～200转摇床培养16～24小时过夜，获得纳豆芽孢杆菌种培养液；
2b、将黄豆与水按1:2～5的质量比例浸泡16～24小时，浸泡液匀浆或磨浆，以总质量的1％～5％添加甘油或葡萄糖或麦麸，115℃～130℃高压灭菌20～30分钟，冷却至40℃；
2c、在高压后黄豆浆液中按2％～5％的质量比例接入液体培养过夜的纳豆芽孢杆菌，通入无菌空气，溶氧量大于10％，以100～200转/分搅拌液体至均匀后，培养6～12小时，培养温度为30℃～42℃；
2d、将花粉置于水中以100℃煮沸15～25分钟，将花粉煮液加到上述已培养6～12小时的黄豆浆液中，至花粉煮液占总液体量的10％～60％，继续发酵24小时；
2e、收集发酵液，真空冰冻干燥36～48小时，真空要求≤10Pa，真空冰冻干燥起始温度为-30～-50℃，真空冰冻干燥12小时后，每小时升温5℃，温度升至25℃后维持至完全干透为止，获得干燥菌体；
2f、用冷循环粉碎机将干燥菌体粉碎成50～100目的细粉，包装，制得产品。
上述纳豆发酵花粉的生产方法中，步骤1a和步骤2a中所选取的纳豆原料为日本产的“纳豆生活”牌纳豆、“山大美味”牌的纳豆和极小粒纳豆、中国北京产的“日本风味燕京”牌纳豆。
上述纳豆发酵花粉的生产方法中，所述的花粉为油菜花粉、松花粉、茶花粉、枣花粉、荞麦花粉、玉米花粉、荷花花粉、党参花粉、益母草花粉、虞美人花粉、芝麻花粉、蒲公英花粉、菊花花粉、板栗花粉、五味子花粉、葵花蜂花粉、桃花花粉、哈密瓜花粉、洋槐花粉、山楂花花粉、野玫瑰花粉中的一种或多种组合。
上述纳豆发酵花粉的生产方法中，发酵产物的真空冰冻干燥采用真空冰冻干燥机进行，真空冰冻干燥的起始温度为-50℃，抽真空达到真空度后，逐渐升温至20℃～35℃后维持至干透为止。
上述纳豆发酵花粉的生产方法中，步骤1b和步骤2b中所用的最佳高压灭菌温度为121℃。
上述纳豆发酵花粉的生产方法中，纳豆芽孢杆菌是指生产纳豆所用菌种，在微生物学细菌学分类中属于的枯草芽孢杆菌种中的纳豆芽孢杆菌亚种，简称纳豆芽孢杆菌。
上述纳豆发酵花粉的生产方法中，所称的发酵指使用传统的固体发酵或发酵罐液体发酵，具体包括纯花粉发酵或添加利于纳豆芽孢杆菌生长的添加物的发酵，其中所述的添加物包括黄豆、葡萄糖、甘油、麦粉、麸皮中一种或数种配合使用。
本领域现有技术中，激酶活性能力的测定方法比较多，如纤维蛋白平板法、四肽底物法、血清板法等，本发明步骤1a和步骤2a中采用纤维蛋白平板法，即配制人工血栓平板，把纳豆激酶的样品点样于平板上，其出现的溶解圈的面积与纳豆激酶的溶纤维活性成正比。具体测定方法包括以下步骤：
A)配制纤维蛋白平板---先将0.20g牛纤维蛋白原与20ml的Tris-HlC缓冲液混合，50℃水浴20min，制成纤维蛋白原溶液备用；然后将0.3g的1.5％的琼脂与20ml的Tris-HlC缓冲液混合，沸腾后冷却至快要凝固，制成凝血酶(20U/ml)；把已准备好的纤维蛋白原溶液与凝血酶混合；每个平板倒20ml的混合溶液，待冷却后，分布均匀打6个孔(可分别用于四个纳豆品牌、阳性对照和阴性对照的纳豆激酶测定；或不同条件发酵花粉的纳豆激酶测定)，备用；
B)待检测样品悬液配制---分别称取不同品牌的纳豆、发酵花粉各1克，分别用0.05mol/l的10ml Tris-HlC缓冲液配成样品悬液，备用；
C)活性测定和结果观察---纤维蛋白平板上不同孔分别加入不同品牌的纳豆或发酵花粉样品悬液，用纳豆激酶纯品做阳性对照，0.05mol/l的10ml Tris-HlC缓冲液作为阴性对照。37℃培养箱静置过夜，观察结果；出现透明圈为阳性结果，测量透明圈直径，透明圈直径越大，纳豆激酶活性越高；
D)纳豆激酶的定量计算---用不同酶活单位的标准纳豆激酶按上述方法实验，测定不同酶活单位所形成的透明圈的直径。以透明圈直径为纵坐标，以酶活单位为横坐标作图，得到纳豆激酶活性定量标准曲线；依据试验中，不同品牌的纳豆激酶、不同发酵花粉的透明圈直径，在纳豆激酶活性定量标准曲线上确定相对应的酶活性单位；
E)依据上法的检测结果，在分离的不同纳豆菌株中，选取产纳豆激酶活性高的菌株为生产菌株；在不同花粉发酵条件中，同样选取产生纳豆激酶活性高的方法。本发明生产方法中，步骤1a和步骤2a中选出产纳豆激酶能力最强纳豆芽孢杆菌个体在发酵花粉中的活菌数不少于106CFU/克，纳豆激酶活性大于800U/克。
本发明采用传统的固态微生物发酵和现代的液体微生物发酵，以花粉和黄豆为原料，用纳豆芽孢杆菌进行发酵，将花粉大蛋白水解成利于人体吸收的小分子多肽(水解蛋白多肽)，同时产生纳豆激酶、维生素K2、大量的维生素B类、可溶性膳食纤维和益生菌纳豆芽孢杆菌活菌等。其技术含量高，改善和增强了黄豆及花粉的营养成分，赋予黄豆及花粉新的功能和疗效。经该生产方法制得的纳豆发酵花粉保留了花粉和黄豆中的黄酮类化合物、芸苔素、植酸、微量元素如油菜花粉中的“硒”等，同时经过发酵，产生溶解血栓的纳豆激酶、治疗骨质疏松的维生素K2、大量B族维生素、膳食纤维以及大量对人体有益的益生菌，使纳豆发酵花粉除了原有的保健作用外，又融入了纳豆的溶栓和促进骨钙吸收作用，集花粉和纳豆的营养优势有机结合，将花粉转化为“类蜂王浆”。本发明扩展了花粉的保健范围，除花粉原有保健作用外，对冠心病和骨质疏松患者亦有良好的药理作用或营养功能。
具体实施方式
实施例1
一种纳豆发酵花粉的生产方法，采用固体发酵法，其生产步骤是：
1、、纳豆芽孢杆菌培养液(纳豆菌液)的制备——分别选取如下品牌纳豆(日本进口的“纳豆生活”、日本北海道小樽市生产的“山大美味纳豆”、“极小粒纳豆”和北京生产的“日本风味燕京纳豆”)，用普通营养琼脂平板分离纯化得到4种纳豆菌株，用纤维蛋白平板法测定这四种纳豆菌株产生纳豆激酶的能力，选出产纳豆激酶能力最强的个体，-70℃冰箱保存菌种，作为生产菌种；生产菌种接种于商品化的LB液体营养培养基，35℃～40℃，每分钟150～200转摇床培养16～24小时过夜，获得纳豆芽孢杆菌种培养液；
2、黄豆用水浸泡过夜(根据黄豆品质不同浸泡24小时，黄豆吸水后的重量是其自身重量的2.3～2.7倍)，121℃高压灭菌20～30分钟(小粒黄豆可高压20分钟，大粒黄豆需要30分钟，以高压后黄豆软糯为准)，冷却至40℃；
3、在高压后软糯黄豆上按5％的质量比例接入液体培养过夜的纳豆芽孢杆菌，搅拌均匀后，培养24小时(黄豆表面生长有灰白色菌膜)，培养温度为37℃；
4、将油菜花粉隔水蒸30分钟，冷却至室温，然后将冷却后的油菜花粉与表面生长有灰白色菌膜的黄豆按1:5的质量比例拌和，继续发酵36小时；
5、收集发酵的黄豆和油菜花粉的混合物，真空冰冻干燥48小时，真空要求≤10Pa，真空冰冻干燥起始温度为-50℃，真空冰冻干燥12小时后，每小时升温5℃，温度升至25℃后维持至完全干透为止，获得干燥菌体；
6、用冷循环粉碎机将干燥菌体粉碎成100目的细粉，包装，制得产品。
表1.黄豆与油菜花粉按不同比例混合培养，不同温度培养，完成发酵所需时间(以产生纳豆菌特有的黏丝为标准，表中第2排数字为温度，第3至6排数字为产生黏丝的时间，单位为小时)
表2.真空冰冻干燥从-50℃起，逐渐升至不同平衡温度下，干燥所需时间(小时)
从表1可以看出，不同比例黄豆和油菜花粉混合，在20～45℃均可以很好生长，其中37～45℃时，生长速度更快。从表2可看出，真空冰冻干燥的平衡温度越高，干燥时间越短，但考虑保留纳豆激酶活性的需求，平衡温度控制在30℃以内为佳。
实施例2
一种纳豆发酵花粉的生产方法，采用固体发酵法，其生产步骤是：
1、纳豆芽孢杆菌培养液(纳豆菌液)的制备——分别选不同品牌的日本纳豆，用普通营养琼脂平板分离纯化得到不同纳豆菌株，用纤维蛋白平板法测定不同纳豆杆菌株产生纳豆激酶的能力，选出产纳豆激酶能力最强的个体，-70℃冰箱保存菌种，作为生产菌种。生产菌种接种液体营养培养基，35℃，每分钟150转摇床培养16小时，获得纳豆芽孢杆菌种培养液；
2、黄豆用水浸泡过夜(根据黄豆品质不同浸泡12～24小时，黄豆吸水后的重量是其自身重量的2.3～2.7倍)，121℃高压灭菌20～30分钟(小粒黄豆可高压20分钟，大粒黄豆需要30分钟，以高压后黄豆软糯为准)，冷却至40℃；
3、在高压后软糯黄豆上按8％的质量比例接入液体培养过夜的纳豆芽孢杆菌，搅拌均匀后，培养16小时(黄豆表面生长有灰白色菌膜)，培养温度为37℃；
4、将松花粉隔水蒸30分钟，冷却至室温，然后将冷却后的松花粉与表面生长有灰白色菌膜的黄豆按1:5的质量比例拌和，继续发酵36小时；
5、收集发酵的黄豆和油菜花粉的混合物，真空冰冻干燥48小时，真空要求≤10Pa，真空冰冻干燥起始温度为-50℃，真空冰冻干燥12小时后，每小时升温5℃，温度升至25℃后维持至完全干透为止，获得干燥菌体；
6、用冷循环粉碎机将干燥菌体粉碎成50目的细粉，包装，制得产品。
表3.黄豆与松花粉按不同比例混合培养，不同温度培养，完成发酵所需时间(以产生纳豆菌特有的黏丝为标准，表中第2排数字为温度，第3至6排数字为产生黏丝的时间，单位为小时)
表4.真空冰冻干燥从-50℃起，逐渐升至不同平衡温度下，干燥所需时间(小时)
从表3可以看出，不同比例黄豆和松花粉混合，在20～45℃均可以很好生长，其中37～45℃时，生长速度更快。从表4可看出，真空冰冻干燥的平衡温度越高，干燥时间越短，但考虑保留纳豆激酶活性的需求，平衡温度控制在30℃以内为佳。
实施例3
一种纳豆发酵花粉的生产方法，采用液体发酵法，其生产步骤是：
1、纳豆芽孢杆菌培养液(纳豆菌液)的制备——分别选不同品牌的日本纳豆，用普通营养琼脂平板分离纯化得到不同纳豆菌株，用纤维蛋白平板法测定不同纳豆杆菌株产生纳豆激酶的能力，选出产纳豆激酶能力最强的个体，-70℃冰箱保存菌种，作为生产菌种。生产菌种接种液体营养培养基，40℃，每分钟200转摇床培养24小时，获得纳豆芽孢杆菌种培养液；
2、将黄豆与水按1:3的质量比例浸泡24小时，浸泡液匀浆或磨浆,以总质量的3％添加甘油,121℃高压灭菌30分钟，冷却至40℃；
3、在高压后黄豆浆液中按5％的质量比例接入液体培养过夜的纳豆芽孢杆菌，通入无菌空气，溶氧值大于10％，以150转/分搅拌液体，培养10小时，培养温度为37℃；
4、将油菜花粉置于水中以100℃烧煮20分钟，将油菜花粉煮液加到上述已培养10小时的黄豆浆液中，至油菜花粉煮液占总液体量的20％～60％，继续发酵24小时；
5、收集发酵液，真空冰冻干燥48小时，真空要求≤10Pa，真空冰冻干燥起始温度为-30℃，真空冰冻干燥12小时后，每小时升温5℃，温度升至25℃后维持至完全干透为止，获得干燥菌体；
6、用冷循环粉碎机将干燥菌体粉碎成50-100目的细粉，包装，制得产品。
表5.黄豆与油菜花粉按不同比例混合培养，不同温度培养，完成发酵所需时间(以产生纳豆菌特有的黏丝为标准，表中第2排数字为温度，第3至6排数字为产生黏丝的时间，单位为小时)
液体培养结果与固体法类似，但更容易批量化和自动化，但含水量大，冰冻干燥的压力也大。