一种具有缓解罗非鱼铝毒性的益生菌饲料及其应用的制作方法

本发明涉及一种具有缓解罗非鱼铝毒性的益生菌饲料及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

铝是地壳中最丰富的金属元素，在环境中无处不在。近年来，由于环境恶化酸雨频发，导致越来越多的铝进入河流和湖泊，对水体造成污染，影响水生生物的健康和生长性能。金属铝不仅对生命体没有生物学功能，而且是一种对生命体具有极大危害的有毒金属之一。一些研究报道0.11-0.22mg/L的铝就会对鱼类造成损伤。铝对水体生物的毒害首先表现在对鱼生长性能和存活率的影响。鱼类暴露于铝污染的水体后，其生理变化主要表现在心血管、血液系统、新陈代谢、呼吸系统和神经系统等方面。铝对鱼类的毒性主要与活性氧形成相关，其具有很强的促氧化特性。罗非鱼是一类市场占有率很高的鱼类制品食材，高含量的铝污染会导致在鱼肌肉组织中蓄积，当人类摄入铝污染的鱼肉以后会导致铝在人类组织器官内蓄积。研究表明铝的蓄积可以造成人体多种器官系统的损伤。因此，水体铝污染不仅能够导致水产业的经济损失，而且也会对人体健康产生毒害风险。

迄今为止，缓解水生动物铝毒性的研究较少，其主要思路是吸附铝或者是缓解铝造成的毒害作用。当前研究对水生生物的铝中毒治疗方法主要是在饲料中添加一定抗氧化剂或者是铝螯合剂。抗氧化剂主要是一些维生素及抗氧化物质包括维生素、植物提取物、以及微量元素等，铝螯合吸附剂的研究在蒙脱土、泡沸石和凹凸棒土上有所涉及。而抗氧化剂使用成本较高，螯合吸附剂使用可能会破坏水生生物体内的离子平衡。鉴于当前的研究现状以及治疗方法的有限性，针对水生生物的铝蓄积和铝中毒探索一种新的干预或治疗方法显得十分必要；而上述几种治疗方法的可行性也促使我们继续寻找应用更广泛、潜力更巨大，同时又具有缓解铝毒性作用的手段。

目前，已经有大量学者研究了益生菌饲料对水生动物的益生作用，但在缓解水生生物铝毒性方面的研究仍未有报道。因此，探索益生菌饲料在环境水体中对毒性金属铝的减除能力，以及缓解水生生物体内铝蓄积导致的毒性效应中的作用，对益生菌饲料的功能进一步地进行挖掘，为改善污染水体和降低金属铝暴露水生生物的毒害作用开辟出新的方法和策略。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种益生菌饲料，含有活性的≥10⁸CFU/g饲料的植物乳杆菌CGMCC No.9664。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌CGMCC No.9664于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9664，并公开于申请号为201510090228.9的发明专利申请中。

在本发明的一种实施方式中，所述益生菌饲料是由植物乳杆菌CGMCC No.9664的菌剂与食品学上可接受的载体组成的。

在本发明的一种实施方式中，所述益生菌饲料含有鱼粉，次粉，玉米淀粉，大豆油，豆粕，酪蛋白，明胶，复合维生素，复合矿物盐，氯化胆碱，VC磷酸酯钠，磷酸二氢钙，微晶纤维素中的至少一种。

在本发明的一种实施方式中，所述益生菌饲料按质量百分比含有鱼粉8～12％，次粉22～28％，玉米淀粉18～23％，大豆油4～8％，豆粕22～24％，酪蛋白8～12％，明胶1～4％，复合维生素0.5～2％，复合矿物盐0.5～2％，氯化胆碱0.1～1％，VC磷酸酯钠0.1～1％，磷酸二氢钙0.5～2％，微晶纤维素1～4％。

在本发明的一种实施方式中，所述益生菌饲料质量百分比含有鱼粉10％，次粉25％，玉米淀粉20.5％，大豆油6.0％，豆粕20％，酪蛋白9.6％，明胶2.4％，复合维生素1％，复合矿物盐1％，氯化胆碱0.5％，VC磷酸酯钠0.2％，磷酸二氢钙1.5，微晶纤维素2.3％。

在本发明的一种实施方式中，所述复合维生素含有(按mg/kg饲料计)：维生素A，10；维生素D，0,05；维生素E，400；维生素K，40；维生素B₁，50；维生素B₂，200；维生素B₃，500；维生素B₆，50；维生素B₇，5；维生素B₁₁，15；维生素B₁₂，0.1；维生素C，1000；肌醇，2000；胆碱，5000。

在本发明的一种实施方式中，所述复合矿物盐含有(按mg/kg饲料计)：FeSO₄·7H₂O，372；CuSO₄·5H₂O，25；ZnSO₄·7H₂O，120；MnSO₄·H₂O，5；MgSO₄，2475；NaCl，1875；KH₂PO₄，1000；Ca(H₂PO₄)₂2500。

本发明的第二个目的是提供所述益生菌饲料的制备方法，所述方法包括：(1)将植物乳杆菌CGMCC No.9664接种至MRS培养基中，30～37℃培养16～64h，离心，收集活菌浓度≥10¹¹CFU/mL的植物乳杆菌CGMCC No.9664；(2)配制预混饲料；(3)将步骤(1)制备的活菌与步骤(2)制备的预混饲料混合，获得活菌数≥10⁸CFU/g的饲料。

在本发明的一种实施方式中，所述预混饲料按质量百分比具体为：鱼粉10％，次粉25％，玉米淀粉20.5％，大豆油6.0％，豆粕20％，酪蛋白9.6％，明胶2.4％，复合维生素1％，复合矿物盐1％，氯化胆碱0.5％，VC磷酸酯钠0.2％，磷酸二氢钙1.5，微晶纤维素2.3％；

在本发明的一种实施方式中，所述复合维生素(mg/kg饲料)含有：维生素A，10；维生素D，0,05；维生素E，400；维生素K，40；维生素B₁，50；维生素B₂，200；维生素B₃，500；维生素B₆，50；维生素B₇，5；维生素B₁₁，15；维生素B₁₂，0.1；维生素C，1000；肌醇，2000；胆碱，5000。

在本发明的一种实施方式中，所述复合矿物盐(mg/kg饲料)含有：FeSO₄·7H₂O，372；CuSO₄·5H₂O，25；ZnSO₄·7H₂O，120；MnSO₄·H₂O，5；MgSO₄，2475；NaCl，1875；KH₂PO₄，1000；Ca(H₂PO₄)₂2500。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将浓缩菌液与所述预混饲料混合；所述浓缩菌液是将植物乳杆菌CGMCC No.9664菌种以2-4％的接种量接种至MRS培养基中，37℃下培养16～24h，用pH7.0～7.2的磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用生理盐水重悬使活菌浓度达到10¹¹CFU/mL，得到浓缩菌液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将冻干菌粉与所述预混饲料混合；所述冻干菌粉按下述步骤制备：(1)配制含100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的冻干保护剂溶液；(2)将植物乳杆菌CGMCC No.9664菌种以2-4％的接种量接种至MRS培养基中，37℃下培养16～24h，用pH7.0～7.2的磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用冻干保护剂重悬使活菌浓度达到10¹¹CFU/mL，将该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的冻干菌粉。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将海藻酸钠微胶囊菌剂与所述预混饲料混合；所述的海藻酸钠微胶囊菌剂的按下述步骤制备：(1)将植物乳杆菌CGMCC No.9664菌种按照以2-4％的接种量接种至MRS培养基中，37℃下培养16～24h，用pH7.0～7.2的磷酸盐缓冲液清洗2-4次，(2)加入10倍体积20g/L的海藻酸钠溶液与菌体充分混合，并加入0.4％的Tween-80，磁力搅拌器搅拌乳化15min，使用压力喷嘴喷入0.2mol/L的CaCl₂溶液中，固化15min，用纱布过滤，生理盐水冲洗2～3次，得到海藻酸钠微胶囊菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述的罗非鱼基础饲料配方及营养组成按质量百分比含有：鱼粉8～12％，次粉22～28％，玉米淀粉18～23％，大豆油4～8％，豆粕22～24％，酪蛋白8～12％，明胶1～4％，复合维生素0.5～2％，复合矿物盐0.5～2％，氯化胆碱0.1～1％，VC磷酸酯钠0.1～1％，磷酸二氢钙0.5～2％，微晶纤维素1～4％。

本发明的第三个目的是提供一种罗非鱼饲喂方法，是将所述益生菌饲料按罗非鱼总体重的1～5％每天饲喂1～2次。

本发明还提供所述益生菌饲料在制备含罗非鱼成分的食品、保健品领域的应用。

有益效果：本发明含植物乳杆菌CGMCC No.9664的水生动物饲料，还具有如下特性：

(1)提高罗非鱼的生长性能；

(2)改善铝暴露罗非鱼的血清生化指标；

(3)缓解铝暴露罗非鱼体内氧化应激损伤；

(4)降低铝暴露罗非鱼体不同组织器官和鱼肉中的铝含量，提高罗非鱼鱼肉的安全性。

(5)恢复铝暴露罗非鱼的肠道菌群组成。

将该益生菌饲料用于饲喂铝暴露罗非鱼，能够提高罗非鱼的生长性能，使罗非鱼平均增重和日增重分别提高10.41％和12.12％，使铝暴露罗非鱼存活率提高8％，降低铝暴露罗非鱼鱼肉内的铝含量至正常水平，提高肉质安全性，并能够缓解铝暴露罗非鱼体内的铝毒性，改善铝暴露罗非鱼的肠道微生态环境，具有非常广泛的应用前景。

附图说明

图1是罗非鱼肝脏氧化应激指标变化情况；

图2是罗非鱼肠道微生物门类多样性变化情况；

图3是罗非鱼肠道微生物属类多样性变化情况。

具体实施方式

实施例1

按表1所示的基础配方及营养组成配制饲料配料，具体步骤如下：

(1)将植物乳杆菌CGMCC No.9664按体积比以2-4％的接种量接种到MRS培养基中，37℃下培养18h，pH7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用生理盐水重悬浮，使活菌浓度≥10¹¹CFU/mL。

(2)按表1的配方配制预混饲料，按质量百分比具体为：鱼粉10％，次粉25％，玉米淀粉20.5％，大豆油6.0％，豆粕20％，酪蛋白9.6％，明胶2.4％，复合维生素1％，复合矿物盐1％，氯化胆碱0.5％，VC磷酸酯钠0.2％，磷酸二氢钙1.5，微晶纤维素2.3％；

其中复合维生素(mg/kg饲料)含有：维生素A，10；维生素D，0,05；维生素E，400；维生素K，40；维生素B₁，50；维生素B₂，200；维生素B₃，500；维生素B₆，50；维生素B₇，5；维生素B₁₁，15；维生素B₁₂，0.1；维生素C，1000；肌醇，2000；胆碱，5000；

复合矿物盐(mg/kg饲料)含有：FeSO₄·7H₂O，372；CuSO₄·5H₂O，25；ZnSO₄·7H₂O，120；MnSO₄·H₂O，5；MgSO₄，2475；NaCl，1875；KH₂PO₄，1000；Ca(H₂PO₄)₂2500。

(3)将步骤(1)制备的菌液与步骤(2)制备的预混饲料混合，以小型颗粒饲料机进行制粒，制粒温度为65℃，得到含该菌的颗粒饲料；颗粒饲料成型后，将新鲜浓缩菌液使用压力喷嘴均匀混入颗粒饲料中，得到含该菌的颗粒饲料。所得颗粒饲料的活菌数≥10⁸CFU/g成品饲料，该益生菌饲料中蛋白含量为29.3％，脂肪含量7.8％。

表1罗非鱼基础饲料的组成及含量

实施例2植物乳杆菌CGMCC No.9664对铝暴露罗非鱼生长指标的影响

选取健康的尼罗罗非鱼192尾，初始体重为34.01±0.19g(平均值±标准差)。随机分成四组，分别为对照组、益生菌组、金属组和金属+益生菌组，每组48尾，随机分为三个平行，每个平行16尾。对照组：饲喂基础日粮(即按表1配方配制的不含益生菌成分的基础饲料)；益生菌组：饲喂含益生菌(CGMCC No.9664)饲料；金属暴露组，饲喂基础日粮，暴露于含金属(2.73mg/L的Al³⁺溶液)溶液的水体中；金属+益生菌(CGMCC No.9664)组，饲喂含益生菌饲料，暴露于含金属铝溶液的水体中。罗非鱼按罗非鱼总体重的3％每天饲喂两次，分别为上午9点和下午3点。实验周期为4周，罗非鱼的体重变化，进食量和存活率等生长性能指标被记录。增重率＝(终体重-初始体重)/初始体重×100％；饲料系数＝总进食量/(终体重-初始体重)。

这些实验结果如表2所示。由表2可知，益生菌组罗非鱼的平均增重和日增重显著高于对照组，与对照相比平均增重和日增重分别提高了10.41％和12.12％，说明益生菌促进了罗非鱼的生长。与金属组相比，益生菌处理后明显提高了铝暴露组罗非鱼的存活率，且罗非鱼的体重被很好的恢复。

表2罗非鱼的生长指标变化

注：不同字母代表的组别间具有显著性差异(P<0.05)

实施例3植物乳杆菌CGMCC No.9664对铝暴露罗非鱼体内铝含量的降低作用实验

按照实施例2所述以罗非鱼进行动物实验和分组，实验结束后处死罗非鱼进行解剖，取各部位的组织器官，放入微波消解炉中消解20min，得到的消解液使用电感藕合等离子体质谱(ICP-MS；NexIon-300X；PerkinElmer)测定铝含量。实验结果如表3所示。

表3罗非鱼不同部位的铝含量

注：-表示未检测到；单位均为μg/g组织湿重；标有不同字母的组表示差异显著(P<0.05)。

对比金属+益生菌组与金属组可以发现，益生菌显著降低了罗非鱼肠道、肝脏和脾脏组织中的铝含量。虽然对鳃没有显著性降低，但是其趋势仍然是益生菌干预组要低于金属暴露组。这一数据说明含有植物乳杆菌CGMCC No.9664的益生菌饲料能够降低铝暴露罗非鱼体内的铝含量。

实施例4植物乳杆菌CCFM 8610对铝暴露罗血清生化指标改善作用实验

按照实施例2所述以罗非鱼进行动物实验和分组，实验结束后对罗非鱼进行尾部静脉取血，每个处理组取15条，血液经静置1h后离心(3000g，10min)得到血清，使用全自动生化分析仪(BS-400；Mindray,China)进行血清生化分析。测定结果如附表4所示。

表4罗非鱼血清生化指标的变化：TP、Glu、TC、TG、LDL-C和HDL-C。

注：不同字母代表的组别间具有显著性差异(P<0.05)

与对照组相比，铝暴露能显著降低罗非鱼血清中Glu、TG、LDL-C和HDL-C含量(P<0.05)和显著增加TC的含量，而通过益生菌饲料干预，TC、TG、LDL-C和HDL-C含量被明显调节至接近正常水平。以上数据表明，植物乳杆菌CGMCC No.9664能够改善铝暴露罗非鱼的血清生化指标，使铝暴露罗非鱼基本恢复到未受铝毒害的健康状态。

实施例5植物乳杆菌CGMCC No.9664缓解铝暴露罗非鱼氧化损伤实验

以实施例2所述以罗非鱼进行动物实验和分组，实验结束后处死罗非鱼进行解剖，取肝脏，按照南京建成试剂测试盒的方法分别测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化物酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、还原性谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的水平。测试结果如附图1所示。

如附图1所示，CGMCC No.9664缓解了因铝暴露造成的肝脏中SOD、GSH-Px、CAT、GSH和T-AOC的降低，以及MDA的升高。SOD是生物体内清除自由基重要的抗氧化酶，可调节因氧自由基造成的细胞损害，并修复受损细胞，是生物体内氧化应激损伤的一种标志酶。GSH是维持细胞生物功能的重要物质，GSH-Px和CAT是体内广泛存在的抗氧化酶，能将有毒的过氧化物催化成无毒物质，两者都是毒性金属暴露的生物标志物；T-AOC是用于衡量抗氧化能力的综合指标，它的大小可以反映机体自身氧化代谢的状态，在铝暴露下，会产生氧化损伤，导致T-AOC降低；而MDA是一种生物体内的自由基与脂质发生过氧化反应的终产物，是生物体内氧化应激损伤的一种标志酶。以上结果说明，含植物乳杆菌CGMCC No.9664的益生菌饲料缓解了罗非鱼铝中毒引起的氧化应激和氧化损伤。

实施例6植物乳杆菌CGMCC No.9664调节铝暴露罗非鱼肠道微生物的组成及植物乳杆菌含量水平测定实验

以实施例1所述以罗非鱼进行动物实验和分组，每2周收集肠道粪便，使用DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取样品中所含的DNA，并使用PCR扩增细菌16S rRNA中的V4V5区，扩增引物为515F(5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)，907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。

对扩增子进行电泳纯化，使用胶回收试剂盒(Axygen Biosciences,CA,US)回收纯化产物，并用荧光仪(Promega,US)进行定量。将纯化后的扩增子等量混合后，利用Illumina MiSeq^TM测序服务技术平台对混合物进行双尾测序。测序结果储存于ncbi的Sequence Read Archive(SRA)数据库中。(收录号：SRP089871)

使用QIIME(版本1.17)对测序结果进行de-multiplex以及quality-filter。使用UPARSE将相似度在97％以上的片段序列聚类成为分类操作单元(OTUs)，并利用UCHIME识别并移除嵌合序列。使用DPR分类(http://rdp.cme.msu.edu/)以及SILVA(SSU115)16S rRNA数据库对每个16S rRNA进行比对分类(置信度阈值为70％)。

罗非鱼肠道菌群分类结果如图2和3，金属暴露明显降低肠道微生物多样性以及显著改变肠道菌群的结构。金属暴露组明显影响了罗非鱼肠道内的门类和属类的组成。在属水平上，金属暴露组显著增加了罗非鱼肠道内Flavobacterium，Comamonadaceae和Enterovibrio属的数量，同时显著降低Plesiomonas和Deefgea的数量。但是，金属+益生菌组对微生物组成有显著的恢复能力，益生菌显著恢复了了罗非鱼肠道内的Comamonadaceae和Enterovibrio属和Deefgea的丰度。

使用如表5所示引物进行植物乳杆菌的定量分析，结果如表6所示，金属暴露组能够明显降低罗非鱼肠道内植物乳杆菌的丰度(第4周)，而饲喂含植物乳杆菌CGMCC No.9664饲料则能显著增加罗非鱼肠道内该种群的丰度。

表5植物乳杆菌荧光定量PCR特异性引物序列

表6罗非鱼粪便样品中植物乳杆菌的含量分析

以上数据表明植物乳杆菌CGMCC No.9664能调节铝暴露罗非鱼肠道微生物的组成及丰度。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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