一种药性稳定的用于对虾免疫增强和杀菌的中草药制剂及方法与流程

本发明涉及一种药性稳定的用于对虾免疫增强和杀菌的中草药制剂及方法，属于水产配合饲料添加剂技术领域。

背景技术：

目前，对虾养殖已成为水产养殖业中举足轻重的支柱产业。随着对虾养殖密度和集约化程度的提高，由病毒、细菌等导致病害日趋严重，给对虾养殖业造成了巨大经济损失。针对这些疾病，药物防治是最直接、最有效的方法，但是，长期地使用抗生素和其他化学类药物来防治养殖病害，导致了一系列负面影响如药物残留，耐药菌的产生等。随着人们对生态环境和人类健康的愈发重视，抗生素及化学药物的使用管控日趋严格，人们开始探求高效安全途径来提高水产养殖动物的抗病力。中草药由于天然、高效、低残留，不易导致耐药性等优点，已经成为目前水产养殖病害防治的研究热点，其中复方中草药包含多种有效成分，且各成分能协同作用，极大增强了药效作用，因此复方中草药在防治对虾病害方面具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种药性稳定的用于对虾免疫增强和杀菌的中草药制剂及方法，通过提取的三种中草药的活性成分与其他两种成分，共同作为对虾饲料添加剂，既能起到增强对虾免疫防御能力和杀菌作用，有效防治对虾病害，减少抗生素和化学药物的使用，又能够提高药效稳定性和促进摄食，不仅为对虾养殖健康可持续发展提供了技术支撑，也为水域生态环境保护提供技术保障。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：

一种药性稳定的用于对虾免疫增强和杀菌的中草药制剂，其特征在于以质量分数计，它包括黄芪多糖20％-50％、绿原酸20％-50％、大蒜素20％-50％、亚硫酸氢钠5％-10％、二甲基-β-丙酸噻啶3％-6％。

一种药性稳定的用于对虾免疫增强和杀菌的中草药制剂，其特征在于该中草药制剂由以下成分组成，黄芪多糖：绿原酸：大蒜素：亚硫酸氢钠：二甲基-β-丙酸噻啶的质量比为14：14：7：2：1。

上述该配方主要用于日常投喂，可显著增强对虾免疫能力。

一种药性稳定的用于对虾免疫增强和杀菌的中草药制剂，其特征在于该中草药制剂由以下成分组成，黄芪多糖：绿原酸：大蒜素：亚硫酸氢钠：二甲基-β-丙酸噻啶的质量比为14：14：14：2：1。

上述该配方更加适合于对虾细菌性传染性疾病的发生季节来临之前投喂，如养殖中后期，此阶段投饵量不断加大，水质逐渐老化，残饵和排排泄物增多，病原菌数量大大增加，虾池底质恶化，水质难以控制，此时病害极易爆发。该配方具有更显著的杀菌功效。

所述的黄芪多糖提取自黄芪，所述的绿原酸提取自杜仲，黄芪多糖采用水提纯沉法提取；绿原酸采用乙酸乙酯提取。所述的大蒜素为化工合成品，购自济南德高生物科技有限公司；所述的亚硫酸氢钠为化工合成品，购自山东凯龙化工科技发展有限公司：所述的二甲基-β-丙酸噻啶为化工合成品，购自武汉丰竹林化学科技有限公司。

本发明的优点和有益效果：

(1)提高了凡纳滨对虾血细胞数量。在对虾非特异免疫系统中，血细胞扮演着重要的角色，既是细胞免疫的执行者又是体液免疫的提供者。在投喂复方中草药免疫增强剂的21天内，试验组对虾血细胞数量均显著高于对照组(p<0.05)，而对照组无显著差异。

(2)提高了凡纳滨对虾血细胞吞噬活性。血细胞能通过吞噬作用包裹、破坏和消除外来物质，因此，血细胞吞噬活性可以用于衡量凡纳滨对虾抵抗外来入侵病原菌的能力。在投喂复方中草药免疫增强剂的21天内，试验组对虾血细胞吞噬活性均显著高于对照组(p<0.05)，而对照组无显著差异。

(3)提高了凡纳滨对虾酚氧化酶活力。在投喂复方中草药免疫增强剂的21天内，凡纳滨对虾血清酚氧化酶活力有明显提高，各试验组与对照组之间差异显著(p<0.05)。

(4)提高了凡纳滨对虾血清溶菌酶活力。溶菌酶能够破坏细菌细胞壁，因此被视为重要的体液免疫因子。在投喂复方中草药免疫增强剂的21天内，凡纳滨对虾血清溶菌酶活力有明显提高，各试验组与对照组之间差异显著(p<0.05)。

(5)提高了凡纳滨对虾对致病弧菌的抵抗能力。注射哈维氏弧菌后7d,对照组对虾的累积死亡率为68.35％，试验组1对虾的累积死亡率为33.35％，试验组2对虾的累积死亡率为30％，试验组和对照组之间差异显著(p<0.05)。

(6)提高了中草药复方药效的稳定性。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分，会因氧化作用而引起有效成分含量降低。同时，大蒜素稳定性较差,在外界条件影响下，颜色易加深甚至变得粘稠，很快被分解而产生多种烯丙基硫化物，使大蒜加工制品产生明显的蒜臭味及绿褐变，生物学功能和饲用功效也随之降低。如何预防氧化，提高有效成分稳定性是影响绿原酸和大蒜素的关键应用因素。目前大多数关于绿原酸或大蒜素的中草药复方只涉及功效的评价，并未提及其药效的稳定性。亚硫酸氢钠具有强的还原性，在本发明中可以作为抗氧化剂，本专利在配方中加入亚硫酸氢钠，增加中草药复方的稳定性，有利于中草药复方的存储。

(7)提高复方的利用率。绿原酸具有酸苦味，大蒜素具有辛味，添加这些成分势必影响饲料适口性。二甲基-β-丙酸噻啶(dmpt)对甲壳动物具有很好的诱食作用，在中草药复方中补充低浓度的dmpt能大大促进对虾摄食，提高复方的利用率。

试验证明了本发明所提供的免疫增强剂能够明显增强对虾的免疫力，提高对虾抵抗疾病的能力；该增强剂选用黄芪多糖、绿原酸、大蒜素三种中草药有效进行科学配伍，并配合能够提高药效稳定性和促进摄食的两类物质，定性定量地添加到饲料中，有利于维持药效的稳定性及标准化生产；可以替代和减少抗生素和化学药物的使用，避免了抗生素滥用对环境等的不良效果，同时该配方具有更高促进摄食性；本发明制备简单，成本较低，能够提高对虾养殖业的经济效益。

附图说明

图1为实施例2中对虾血细胞数量的结果图。

图2为实施例2中对虾血细胞吞噬活性的结果图。

图3为实施例2中对虾血浆分氧化酶活性的结果图。

图4为实施例2中对虾血浆溶菌酶活性的结果图。

图5为实施例2中攻毒实验对虾累计死亡率的结果图。

具体实施方式

实施例1：

复方中草药免疫增强剂及基础饲料的制备方法，包括以下步骤：

首先制备中草药活性成分，将片状黄芪均匀粉碎后，过80目筛，与蒸馏水按照质量体积比为1:10混匀，煎煮2次，每次2小时，合并2次滤液，减压浓缩，加适量95％乙醇以使最终含醇量为80％，过夜，抽滤，得黄芪多糖；

将片状杜仲均匀粉碎后，过80目筛，与乙酸乙酯(含0.05mol/l盐酸)按照质量体积比为1:8混匀，在65℃水浴上搅拌回流浸取3小时，重复提取2次，合并滤液分离出乙酸乙酯，获得绿原酸；

大蒜素、亚硫酸氢钠和二甲基-β-丙酸噻啶采用化工合成品，分别购买自德高公司、凯龙化工科技发展有限公司和武汉丰竹林化学科技有限公司；

将上述中草药提取物、大蒜素、亚硫酸氢钠和二甲基-β-丙酸噻啶按照上述比例溶于水后均匀喷洒在基础饲料表面，再利用鱼油包裹饲料，晾干即得到含有复方中草药免疫增强剂的基础饲料。

按照上述的制备方法分别制备得到增强剂及相应的养殖饲料，按以上两种不同的具体配比得到两种：以质量分数计，一种免疫增强剂包括每千克饲料添加黄芪多糖1g、绿原酸1g、大蒜素0.5g、亚硫酸氢钠0.15g和二甲基-β-丙酸噻啶0.07g；另一种免疫增强剂包括每千克饲料添加黄芪多糖1g、绿原酸1g、大蒜素1g、亚硫酸氢钠0.15g和二甲基-β-丙酸噻啶0.07g。

上述中草药有效成分的含量可以按照现有文献所提供的方法进行测定。黄芪多糖含量的测定方法参照：黄芪中黄芪多糖含量的测定，中国现代中药，2011年第13卷第07期；绿原酸含量的测定方法参照：journalofpharmaceuticalanalysis,2011年第1卷第04期；大蒜素含量的测定方法参照：hplc法测定大蒜中蒜氨酸和大蒜素的含量，2009年第35卷第02期；亚硫酸氢钠含量的测定采用氧化还原滴定法；二甲基-β-丙酸噻啶含量采用硫重量法检测。

实施例2：

复方中草药免疫增强剂对凡纳滨对虾非特异性免疫力的影响

本试验中，发明人将实施例1制备的两种中草药免疫增强剂饲喂凡纳滨对虾，对其非特异性免疫指标进行测定,旨在筛选出提高凡纳滨对虾非特异性免疫功能和病菌抵抗能力的复方中草药免疫增强剂。

1材料与方法

1.1材料

试验用凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)购于青岛市崂山区沙子口对虾养殖厂，平均体重为7.45±0.41克，试验用基础饲料的成分为：以质量分数计，鱼粉34％、豆粕20％、花生粕16.4％、小麦粉22％、大豆磷脂5％、多种维生素0.6％、复合矿物质2％。经实验计算饲料中营养成分为：以质量分数计，粗蛋白42.4％、粗脂肪7.2％、灰分8.4％。

1.2方法

1.2.1试验设计

试验用凡纳滨对虾暂养7天后随机分成3组，分别为对照组、试验组1和试验组2，每组70尾，每组3平行，饲养于100lpvc桶中,24小时通气饲养。对照组投喂基础饲料，试验1和2组分别投喂实施例1所制备的两种免疫增强剂基础饲料，每天投喂2次,均为饱食投喂量。养殖实验共持续21天，试验期间，水温，盐度，ph，分别为25-27℃,34‰,7.8-8.0。

1.2.2测定指标和方法

在试验开始的第0、1、3、6、10、15、21天取血。使用消毒的5号针头和1ml注射器直接插入对虾头胸甲后缘围心腔内3mm左右进行采血，抽血前注射器内预先吸入了0.3ml改进的预冷凡纳滨对虾抗凝剂(0.34mnacl,0.01mkcl,0.01medta-na2,0.01mhepes,ph7.45,渗透压为780mosm.kg^-1)，最终使得抗凝剂和血淋巴的比例为1:1。一部分血淋巴样品进行血细胞数量及吞噬率的测定，剩余血淋巴样品于4℃下800×g离心10min后，取蓝色上清，即为血浆样品，于-80℃条件下保存。

血细胞数量的测定使用血球计数板在光学显微镜下进行计数；吞噬活性的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：oxidativestress,dnadamageandantioxidantenzymegeneexpressioninthepacificwhiteshrimp,litopenaeusvannameiwhenexposedtoacutephstress.comparativebiochemistryandphysiologyparta；酚氧化酶活性测定方法可以参照：whiteshrimplitopenaeusvannameithatreceivedthehot-waterextractofgracilariatenuistipitatashowedearlierrecoveryinimmunityafteravibrioalginolyticusinjection.fish&shellfishimmunology；溶菌酶活性使用南京建成生物有限公司生产试剂盒测定。

2结果

2.1血细胞数量

由图1可知：投喂含复方中草药免疫增强剂的饲料21天后,凡纳滨对虾血细胞数量有明显增加，试验结束后，与对照组相比，试验组1和2血细胞数量分别增加14.2％和16.5％，试验组和对照组差异显著(p<0.05)。但试验组2和试验组1相比，大蒜素含量的升高未能进一步增加血细胞的数量。

2.2血细胞吞噬活性

由图2可知：投喂含复方中草药免疫增强剂的饲料6天后，凡纳滨对虾血细胞吞噬率开始显著高于对照组，但试验组1和试验组2差异不显著(p>0.05)。在养殖中后期，试验组2的对虾血细胞吞噬能力增加更加明显，显著高于对照组和试验组1，表明随着养殖时间的延长，高浓度的大蒜素有利于进一步提升凡纳滨对虾血细胞的吞噬能力。

2.3酚氧化酶活性

由图3可知：投喂含复方中草药免疫增强剂的饲料3天后，凡纳滨对虾血清酚氧化酶活力有明显增加，并且在第6天试验组1和试验组2血清酚氧化酶活力达到最高值，与对照组差异显著(p<0.05)。从第6天到试验结束，两试验组血清酚氧化酶活力略有下降，但仍显著高于对照组。整个试验周期，试验组1和试验组2血清酚氧化酶活力差异不显著。综合以上结果可得，饲料中添加黄芪多糖、绿原酸和大蒜素能提高凡纳滨对虾血清酚氧化酶活力，但大蒜素含量的进一步提升不能继续增强对虾血清酚氧化酶活力。

2.4溶菌酶活性

由图4可知：投喂含复方中草药免疫增强剂的饲料3天后，凡纳滨对虾血清溶菌酶活力有明显增加，且在第10天达到最大值，与对照组相比，试验组1血清溶菌酶活力增加2.05倍，试验组12血清溶菌酶活力增加2.23倍，但在试验后期各试验组溶菌酶活力均有小幅度下降且与对照组之间差异显著(p<0.05)。

2.5弧菌抵抗能力

由图5可知：攻毒0.5天后各组对虾开始出现死亡，每组死亡1-3尾，到1天时，对照组对虾累计死亡数明显高于各实验组，到3天时，各组死亡数降低，5天后，各组对虾死亡数减小并趋于稳定。攻毒实验结束时，对照组累计死亡率最高达68.35％,试验组1累计死亡率为33.35％，试验组2累计死亡率30％，表明投喂添加黄芪多糖、绿原酸和大蒜素的饲料能提高凡纳滨对虾抗弧菌能力，并且抗弧菌能力随大蒜素含量的增加而提高。