本发明涉及蜂胶的提取分离技术领域，特指采用某些烷烃与醚类物质按照一定比例混合而成的亚临界多元混合溶剂对蜂胶原料进行萃取，以获得高品质蜂胶的方法。
背景技术：
蜂胶是由蜜蜂采集的植物树干或幼芽上的树脂状分泌物，再经过蜜蜂自身的反复咀嚼和加工，混合其上颚腺分泌物和一定比例的花粉、蜂蜡转化而成的具有芳香气味的天然固体胶状物，其中含有大量对人体有益的黄酮类物质和萜烯类物质，是一种天然绿色保健品。然而蜂胶资源却十分稀缺，据统计，一个数量为5～6万只的蜂群一年大约生产蜂胶100～150g，而我国平均年产蜂胶仅300t左右，因此，蜂胶被誉为“紫色黄金”。近年来，随着我国居民生活水平提高和保健意识增强，高品质的蜂胶产品需求量也逐年增加，因而，高品质蜂胶的高效加工和利用就极为关键。蜂胶富含黄酮类、酚酸、酚酸酯、萜烯类化合物等活性成分，具有抗菌、消炎、止痛、降血脂、促进组织再生和增强机体免疫能力等功能作用。因此，上述活性成分的提取率和加工保留率，是选择加工技术的依据，而其中的黄酮类物质含量常被作为表征蜂胶品质优劣的特征指标。
目前蜂胶的生产方法主要有：乙醇浸提法(包括超声波或微波辅助乙醇提取)和超临界co2萃取法。
乙醇浸提法因其工艺简单、黄酮类物质萃取率高而被广泛应用，一般工业化蜂胶提纯均采用该方法。其工艺为将冷冻粉碎过的蜂胶原料投入浸拌料缸，加入一定浓度的乙醇，间歇式搅拌，浸泡一定时间后，静置抽提上清液，离心机分离滤渣，滤液和上清夜合并过滤，然后浓缩。对于成熟的蜂胶乙醇提取加工技术，尚存在以下三点不足之处：
第一，浸提时间长，生产效率低。cn200910169045.0公开了一种蜂胶提取工艺，即为不同浓度乙醇的阶段式浸提工艺，该工艺浸提时间长达288h(12天)，生产效率很低。cn201510896833.5也公开了一种蜂胶乙醇提取液的制备方法，该方法重点研究了提取工艺对黄酮的影响，虽提取时间有所优化，但仍是一般的乙醇提取工艺，无技术难点的突破。为了克服浸出时间长的缺点，虽有超声波(cn201210227678.4)或微波辅助提取等手段，然而超声波或微波仅限于实验室的实验研究，目前并不适于工业化应用。
第二，现有生产工艺过程中存在产品活性成分损失和萃取不彻底的风险。在酒精减压蒸发或常压蒸发时，芳香物质、挥发油等蜂胶的重要成分易散失，或高温处理容易破坏蜂胶中的热敏性活性成分，降低其生理功效和产品的营养价值。而较高的提取率依靠较长的浸提时间来保障这以技术壁垒，也使得有效成分萃取不完全，易造成资源的浪费。
第三，生产的蜂胶产品，色泽较黑(可能提取或回收乙醇期间某些成分发生氧化)，口味较差。cn201110162683.7公开了一种含高纯度黄酮类成分的蜂胶提取方法，其工艺为先乙醇提取，接着活性炭+活性白土脱色，然后酸化再提取，最后浓缩。虽产品品质有所改善，但整个工艺繁琐，且精制损失大，产品产率低，生产成本高。精制后的产品虽黄酮含量高但是总黄酮含量仅是一个标志性成分指标，除黄酮外蜂胶还含有萜烯类和酯类等多种功效成分，总黄酮含量高并不意味其它功效成分也同比例提高，蜂胶的保健作用是多种功效成分共同作用的结果，并非只是黄酮类物质在起作用，因此在常规蜂胶产品生产应用方面仍需要权衡。
虽然乙醇浸提生产工艺存在上述缺点，但蜂胶国家标准规定的“蜂胶乙醇提取物ethanolextractedpropolis(乙醇萃取蜂胶产品后得到的物质)含量须≥95％”，这也使得蜂胶生产厂家一直未放弃采用该方法。
随着蜂胶提取技术研究的发展，超临界co2萃取技术(如cn201010145448.4一种萃取提纯原态黄色蜂胶的方法，cn201110330992.0超临界萃取蜂胶的方法，)逐渐被应用到蜂胶生产领域。该方法被誉为一种“绿色、可持续发展技术”，研究表明在蜂胶有效成分的提取与分离的某些方面展现出独特的优势。然而，蜂胶的超临界co2流体萃取在工业化应用中仍存在诸多问题，具体如下：
第一，由于蜂胶毛料特有的质地，超临界co2加工工艺提取效率低。蜂胶毛料具有低温硬脆、高温粘稠的质地特异性，在萃取过程中，温度的升高使得原料产生板结，造成有效成分与超临界co2流体接触面较小，因此提取率低。为了改善提取率超临界萃取过程中往往要加入携带剂(如cn03131752.9一种超临界流体混合式萃取蜂胶的方法)，比如乙醇溶液，但改善程度有限。
第二，该技术存在处理量小，设备投入大，产品成本高等问题，制约了其在蜂胶生产工艺中的大规模推广。
亚临界流体萃取是以亚临界状态的单一或混合溶液为溶媒，借助其分子扩散性能强、传质速率快、低温下易挥发的特性，溶剂在系统内相继经过浸提、蒸发脱溶、压缩、冷凝回收等过程，从天然产物中萃取获得功能活性成分，是一种前景广阔的萃取与分离技术。具有无毒、环保，非热加工、不破坏热敏性活性成分、产能大、效率高、可进行工业化放大，节能、运行成本低等优点。为蜂胶的提取提供了新的思路。为了克服乙醇提取浸提时间长，生产效率低，活性成分易损失，成色较差；超临界co2萃取提取率低、设备投入大、产量低、生产成本高等缺点；针对蜂胶毛料和蜂胶这一特殊原料和产品，本发明提供了一种亚临界多元混合溶剂萃取高品质蜂胶的方法。
技术实现要素：
为了克服乙醇提取浸提时间长，生产效率低，活性成分易损失，成色较差；超临界co2萃取提取率低、设备投入大、产量低、生产成本高等缺点，本发明提供了一种亚临界多元混合溶剂萃取高品质蜂胶的方法，通过控制不同萃取阶段溶剂的切换、配比及萃取时间、温度，显著提高了蜂胶的萃取效率和黄酮类、萜烯类化合物的溶出率和保留率，缩短了生产周期；同时改进出料和供热方式，提高了脱溶效率、减少了溶剂损失，可以显著增加经济效益。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明的方法具体按照下述步骤进行：
(1)预处理：首先筛选和挑选除去蜂胶原料中的无机杂质，然后将蜂胶原料(毛胶料)在-10℃冰柜中冷冻过夜，机械粉碎，以蜂胶原料：辅料＝20～10:1的重量比例添加辅料，混匀，其中所述辅料为脱脂天然粗纤维或微晶纤维素；
(2)脱蜡：将经步骤(1)预处理好的蜂胶原料装入萃取釜中，并密封；将萃取釜抽真空(0.01～0.1mpa)，利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂丙烷或丁烷注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为浸提次数1～3次，料液比1:1～1:10，萃取时间10～60min，搅拌速度35～100r/min，萃取温度10～80℃，其中优选20～45℃。萃取完成后将分离釜抽真空并注入少量丙烷或丁烷气体，缓缓打开萃取釜与分离釜之间的阀门，利用压力差和过滤布将萃取釜中混合料进行固液分离，打开加热循环系统和溶剂回收系统，采用蒸汽或热水对萃取釜和分离釜进行加热脱溶，并搅拌，其中物料脱溶温度15～80℃，其中优选25～45℃，混合液脱溶温度30～100℃其中优选45～65℃，待萃取釜和分离釜压力降到0.01mpa，启用真空泵进行负压蒸发，直至-0.09mpa以下；气化后的丙烷或丁烷经压缩、冷凝液化后，回收至溶剂储罐中循环使用；采用氮气吹扫的方式，打开分离釜阀门，排出蜂蜡。
(3)蜂胶萃取：切换阀门利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂，亚临界溶剂中包含二甲醚，或二甲醚和丙烷的混合液，或二甲醚和丁烷的混合液，二甲醚和丙烷混合液的体积比为10:1～1:1，二甲醚和丁烷混合液的体积比为10:1～1:1，再次注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为萃取温度0～60℃，其中优选5～25℃，料液比1:1～1:10，萃取时间60～180min，萃取次数1～4次，整个萃取过程是在完全封闭的条件下进行。萃取完成后按照步骤(2)的操作进行固液分离、脱溶和溶剂回收，其中物料脱溶温度40～80℃，混合液脱溶温度15～80℃，其中优选25～45℃，脱溶时间5～30min；最后打开分离釜阀门，利用氮吹，排出黄色蜂胶。
其中步骤(1)所述将蜂胶原料添加辅料脱脂天然粗纤维或微晶纤维素是为了构造粉碎物料的萃取微结构，防止原料在萃取过程中结块而影响流体的通透性和提取效率，有利于萃取的持续进行和有效成分的溶出，保证完全提取。
其中步骤(2)(3)中溶剂的添加均通过计量罐计量；另外添加溶剂前均需进行抽真空操作，密闭无氧，有效防止萃取过程中活性物质的氧化，保证产品品质。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
第一，本发明采用了亚临界丙烷、丁烷及二甲醚等多元萃取溶剂对蜂胶原料进行萃取，利用亚临界态溶剂较强的扩散性和特殊的萃取性，有效保证了蜂胶的高效、高品质萃取，且适合大规模生产；
第二，本发明采用分段式和搅拌浸提式工艺进行蜂胶的逆流重复提取，缩短了萃取时间，提高了萃取效率和产率，降低了生产成本；
第三，本发明采用了密闭无氧、低温的萃取工艺，有效保护蜂胶产品中易氧化和热敏性的活性成分，而且耗能低；
第四，本发明通过不同阶段温度控制，脱蜡时减少萜烯类物质损失，萃取时增加黄酮类物质和萜烯类物质的萃取，提高了产品品质。
附图说明
图1为蜂胶亚临界多元混合溶剂萃取工艺流程。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1所示为蜂胶亚临界多元混合溶剂萃取工艺流程图，其中第1流体为丙烷或丁烷；第2流体为单一二甲醚或二甲醚与第1流体混合配比。首先将冷冻粉碎处理好的蜂胶原料并添加辅料放入萃取釜中，切换亚临界丙烷或丁烷进行脱腊，然后在一定压力和温度条件下用二甲醚配比丙烷或丁烷等组成多元混合溶剂进行搅拌恒温萃取、低温脱溶，生产高品质蜂胶，并采用氮气吹扫的方式进行出料；同时通过外部夹套及内部中空搅拌浆相结合的供热方式对萃余物进行脱溶。
实施例1
将已筛选和挑选除去无机杂质的蜂胶原料(毛胶料)，至于-10℃冰柜中冷冻过夜，然后机械粉碎。称取蜂胶原料100g，以蜂胶原料：辅料＝20:1的比例添加微晶纤维素，混匀，装入萃取罐釜中，并密封；将萃取釜抽真空-0.1mpa，利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂丙烷注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为浸提次数1次，料液比1:10，单次萃取时间60min，搅拌速度100r/min，萃取温度10℃。萃取完成后将分离釜抽真空并注入少量丁烷气体，缓缓打开萃取釜与分离釜之间的阀门，利用压力差和过滤布将萃取釜中混合料进行固液分离，打开加热循环系统和溶剂回收系统，采用热水对萃取釜和分离釜进行加热脱溶，并搅拌，其中物料脱溶温度15℃，混合液脱溶温度30℃，待萃取釜和分离釜压力降到0.01mpa，启用真空泵进行负压蒸发，直至-0.09mpa以下；气化后的丁烷经压缩、冷凝液化后，回收至溶剂储罐中循环使用；采用氮气吹扫的方式，打开分离釜阀门，排出蜂蜡。切换阀门利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂二甲醚，再次注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为萃取温度5℃，料液比1:10，萃取时间180min，萃取次数1次，整个萃取过程是在完全封闭的条件下进行。萃取完成后按照丙烷脱蜡的操作进行固液分离、脱溶和溶剂回收，其中物料脱溶温度40℃，混合液脱溶温度45℃，脱溶时间5min；最后打开分离釜阀门，利用氮吹，排出黄色蜂胶。最终得到蜂蜡+蜂胶总提取率为80.75％，总黄酮溶出量为75.76mg/g毛料，其中蜂胶中总黄酮含量高达32.02％，鉴定萜烯类物质20种，含量为0.45μg/g。
实施例2
将已筛选和挑选除去无机杂质的蜂胶原料(毛胶)，至于-10℃冰柜中冷冻过夜，然后机械粉碎。称取蜂胶原料100g，以蜂胶原料：辅料＝10:1的比例添加脱脂天然粗纤维，混匀，装入萃取罐釜中，并密封；将萃取釜抽真空-0.1mpa，利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂丁烷注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为浸提次数3次，料液比1:1，单次萃取时间10min，搅拌速度35r/min，萃取温度45℃。萃取完成后将分离釜抽真空并注入少量丁烷气体，缓缓打开萃取釜与分离釜之间的阀门，利用压力差和过滤布将萃取釜中混合料进行固液分离，打开加热循环系统和溶剂回收系统，采用热水对萃取釜和分离釜进行加热脱溶，并搅拌，其中物料脱溶温度45℃，混合液脱溶温度65℃，待萃取釜和分离釜压力降到0.01mpa，启用真空泵进行负压蒸发，直至-0.09mpa以下；气化后的丁经压缩、冷凝液化后，回收至溶剂储罐中循环使用；采用氮气吹扫的方式，打开分离釜阀门，排出蜂蜡。切换阀门利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂二甲醚和丁烷体积比10:1进行配比)，再次注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为萃取温度60℃，料液比1:1，单次萃取时间60min，萃取次数4次，整个萃取过程是在完全封闭的条件下进行。萃取完成后按照丁烷脱蜡的操作进行固液分离、脱溶和溶剂回收，其中物料脱溶温度80℃，混合液脱溶温度25℃，脱溶时间30min；最后打开分离釜阀门，利用氮吹，排出黄色蜂胶。最终得到蜂蜡+蜂胶提取率为81.75％，总黄酮溶出量为74.86mg/g毛料，其中蜂胶中总黄酮含量高达34.11％，鉴定萜烯类物质21种，含量为0.52μg/g。
实施例3
将已筛选和挑选除去无机杂质的蜂胶原料(毛胶)，至于-10℃冰柜中冷冻过夜，然后机械粉碎。称取蜂胶原料100g，以蜂胶原料：辅料＝5:1的比例添加脱脂天然粗纤维，混匀，装入萃取罐釜中，并密封；将萃取釜抽真空-0.1mpa，利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂丁烷注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为浸提次数2次，料液比1:5，单次萃取时间30min，搅拌速度60r/min，萃取温度80℃。萃取完成后将分离釜抽真空并注入少量丁烷气体，缓缓打开萃取釜与分离釜之间的阀门，利用压力差和过滤布将萃取釜中混合料进行固液分离，打开加热循环系统和溶剂回收系统，采用热水对萃取釜和分离釜进行加热脱溶，并搅拌，其中物料脱溶温度80℃，混合液脱溶温度100℃，待萃取釜和分离釜压力降到0.01mpa，启用真空泵进行负压蒸发，直至-0.09mpa以下；气化后的丁经压缩、冷凝液化后，回收至溶剂储罐中循环使用；采用氮气吹扫的方式，打开分离釜阀门，排出蜂蜡。切换阀门利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂二甲醚和丁烷体积比5:1进行配比)，再次注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为萃取温度0℃，料液比1:5，单次萃取时间120min，萃取次数1次，整个萃取过程是在完全封闭的条件下进行。萃取完成后按照丁烷脱蜡的操作进行固液分离、脱溶和溶剂回收，其中物料脱溶温度60℃，混合液脱溶温度80℃，脱溶时间15min；最后打开分离釜阀门，利用氮吹，排出黄色蜂胶。最终得到蜂蜡+蜂胶提取率为71.75％，总黄酮溶出量为68.76mg/g毛料，其中蜂胶中总黄酮含量高达40.21％，鉴定萜烯类物质18种，含量为0.42μg/g。
实施例4
将已筛选和挑选除去无机杂质的蜂胶原料(毛胶)，至于-20℃冰柜中冷冻过夜，然后机械粉碎，备用。
(1)蜂胶的乙醇提取
称取蜂胶原料50g，以蜂胶原料：辅料＝10:1的比例添加微晶纤维素，混匀，并至于玻璃容器中，加入75％的乙醇500ml，密封搅拌，浸泡过夜处理后，减压过滤，收集滤液；再次加入75％的乙醇500ml搅拌过夜，减压过滤并收集滤液，合并两次滤液进行减压旋转蒸发，得到乙醇萃取物。
(2)蜂胶的超临界co2萃取
称取蜂胶原料100g，参考cn201110330992.0超临界萃取蜂胶的方法实例3的萃取条件即为超临界co2萃取，其萃取压力为30mpa，萃取温度为35℃；萃取时间为3.5小时；萃取流程为一级萃取，二级分离：一级分离罐压力为6mpa，温度为35℃；二级分离罐为4mpa，温度为20℃，收集分离产物，完成对蜂胶的萃取。
(3)蜂胶的亚临界流体萃取
称取蜂胶原料100g，以蜂胶原料：辅料＝10:1的比例添加微晶纤维素，混匀，装入萃取罐釜中，并密封；将萃取釜抽真空-0.1mpa，利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂丙烷注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为浸提次数3次，料液比1:10，单次萃取时间60min，搅拌速度100r/min，萃取温度45℃。萃取完成后将分离釜抽真空并注入少量丙烷气体，缓缓打开萃取釜与分离釜之间的阀门，利用压力差和过滤布将萃取釜中混合料进行固液分离，打开加热循环系统和溶剂回收系统，采用热水对萃取釜和分离釜进行加热脱溶，并搅拌，其中物料脱溶温度25℃，混合液脱溶温度45℃，待萃取釜和分离釜压力降到0.01mpa，启用真空泵进行负压蒸发，直至-0.09mpa以下；气化后的丙烷经压缩、冷凝液化后，回收至溶剂储罐中循环使用；采用氮气吹扫的方式，打开分离釜阀门，排出蜂蜡。切换阀门利用压力差将溶剂罐中的亚临界溶剂二甲醚和丙烷体积比1:1进行配比)，再次注入萃取釜内进行搅拌逆流浸提，其中萃取条件为萃取温度25℃，料液比1:3，单次萃取时间60min，萃取次数2次，整个萃取过程是在完全封闭的条件下进行。萃取完成后按照丙烷脱蜡的步骤操作进行固液分离、脱溶和溶剂回收，其中物料脱溶温度80℃，混合液脱溶温度15℃，脱溶时间30min；最后打开分离釜阀门，利用氮吹，排出黄色蜂胶。
称量并计算以上三种方法的蜂蜡+蜂胶提取率，并以芦丁为标准物采用分光光度法测定总黄酮含量，并根据提取率折算总黄酮溶出量，三种方法比对结果见表1。
表1三种萃取方式对有效成分提取率及其总黄酮溶出量的差异性影响
从表1中可以看出亚临界流体萃取相比乙醇提取和超临界co2萃取，能够更好的溶出蜂胶毛料中的有效成分，产量高，从而降低了生产成本。