一种高效温和降低卵白蛋白致敏性的方法与流程

本发明属于食品添加剂技术领域，涉及一种高效温和降低卵白蛋白致敏性的方法。

背景技术：

鸡蛋因营养丰富、成本低廉等优势广泛应用于日常膳食与食品加工中。然而，作为主要食物致敏原之一，其致敏性迫使全球2%的儿童及婴幼儿在身体发育关键阶段难以接触该优质蛋白源；尤其在中国、日本等亚洲国家儿童群体中，超过一半的食物过敏由鸡蛋引起。目前，针对鸡蛋过敏尚无特别有效的治疗手段，严格避免对蛋品的摄入是预防鸡蛋过敏最有效的方式。但是，随着现代食品工业的发展，过敏人群几乎无法彻底避免与含蛋食品的接触。因此，探究有效的脱敏方法对于提升鸡蛋及蛋制品的安全性，具有重要意义。

食物过敏主要分为ige介导和非ige介导两大类，鸡蛋过敏是ige介导的速发型变态反应，主要致敏原包括卵白蛋白、卵类粘蛋白、卵转铁蛋白与溶菌酶等四种蛋清蛋白。致敏蛋白分子中抗原表位（数个至数十个氨基酸残基）是致敏原与抗体结合进而触发过敏反应的物质基础，因而也是揭示致敏反应本质的关键。根据表位的结构差异可将其分为线性表位（连续氨基酸残基）与构象表位（非连续氨基酸残基）。

卵白蛋白是一种含有3%糖基组分的磷糖球蛋白，约占蛋清蛋白的54%，分子量为44.5kda；其分子含有4个巯基和1个二硫键。卵白蛋白包含5个ige结合表位，并证明其均为线性表位（l38t49,d95a102,e191v200,v243e248，g251n260），其中4个暴露于分子表面，且二级结构都含有β-sheet与β-turn。目前，酶法水解致敏蛋白是食物脱敏的有效手段之一。但是，卵白蛋白由于分子内含有疏水内核、二硫键、糖基化等特殊结构，因而对常见蛋白酶表现出较高抗性。近年来学者开始尝试在酶法基础上结合物理手段对致敏蛋白协同处理，取得较好的脱敏效果。例如，jimenez-saiz(2011)等人研究了热处理后卵白蛋白在模拟消化模型中的水解情况，证明热处理能够提升致敏蛋白对消化酶的敏感性，使其水解产物ige结合能力降低；毕井辉探究了不同处理方式对全蛋清致敏性的影响，结果表明高压煮沸与木瓜蛋白酶协同处理能够较大程度降低卵白蛋白的抗原性。这些研究为低敏性蛋制品的发展提供了参考。但是，这些方法由于高温高压等物理条件过于剧烈，容易导致蛋制品品质下降。因此，探寻高效温和的脱敏方法有助于从根本上提高鸡蛋脱敏的有效性。

前人研究表明，反复冻融能够促使蛋白质发生部分变性，使原本包藏与内核的疏水基团暴露至分子表面，同时引起蛋白质二硫键发生变化。而这些疏水基团、二硫键与卵白蛋白的抗原表位及抗原性具有直接联系。那么，反复冻融是否能够促使抗原表位暴露进而提高其对蛋白酶的敏感度，从而提升酶法脱敏的效率值得深入研究。同时，区别于高温高压等物理方法，反复冻融能够最大程度上保持或提高蛋白质的加工特性（起泡性、乳化性、凝胶性等）；前人研究结果表明，利用反复冻融处理大豆蛋白可以改善其加工特性，在工业上经济且简单可行。这些研究结果为将反复冻融作为预处理手段应用于低敏性蛋制品开发提供理论参考。

技术实现要素：

要解决的技术问题：针对上述的技术问题，本发明的目的是公开一种高效温和降低卵白蛋白致敏性的方法。

技术方案：本发明的目的是通过下述方案实现：

一种高效温和降低卵白蛋白致敏性的方法，所述的方法步骤如下：

（1）卵白蛋白提取

用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，在蛋清中加入1-8倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌1-6h，调ph至6.0；向其中加入10wt%-60wt%的peg-8000作为表面活性剂，磁力搅拌2h；在4℃、15000g下离心10min，收集上清液；将收集的液体在4℃下用去离子水透析4次，冷冻干燥即得卵清蛋白；

（2）反复冻融处理

将步骤（1）所得卵清蛋白按其在天然蛋清中的比例5.4%复溶于去离子水中，-20℃冻存12h，之后于20℃解冻12h，重复3-7次，最后冷冻干燥得到蛋白样品；

（3）酶处理

将步骤（2）处理后的卵白蛋白按照酶与蛋白1:100-300的质量比加入转糖基酶，在ph8.0，温度25℃条件下处理2h，之后按照酶与蛋白1:100-300的质量比加入胰蛋白酶，调ph至8.0，于25℃条件下处理2h，得到最终的卵白蛋白水解样品，冷冻干燥后得到最终产物；

优选的，所述的方法步骤（1）中在蛋清中加入3倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌2h；

优选的，所述的方法步骤（1）中加入15wt%的peg-8000作为表面活性剂；

优选的，所述的方法步骤（2）中反复冻融处理次数为5次；

优选的，所述的方法步骤（3）中转糖基酶与蛋白比例为1:200；

优选的，所述的方法步骤（3）中胰蛋白酶与蛋白比例为1:200；

以上任一所述的一种高效温和降低卵白蛋白致敏性的方法制备得到的卵白蛋白。

本发明的有益效果：相比传统强烈物理手段（高温、高压、超声波等）结合酶处理的方法，本发明通过反复冻融预处理方法促使卵白蛋白致敏部位暴露至分子表面，结合转糖基酶与胰蛋白酶协同处理降低卵白蛋白糖链及抗原表位，达到显著降低卵白蛋白及鸡蛋食物致敏性的目的。该方法相比其他高温高压等物理手段协同酶法处理降低鸡蛋致敏性的传统方法而言，显著提高了鸡蛋脱敏的针对性与有效性，并最大程度减小了对鸡蛋蛋白营养及品质的破坏，是一种高效温和的鸡蛋脱敏方法。该方法具有应用于低敏性蛋制品工业开发的前景。

附图说明

图1是反复冻融0,5,10次后卵白蛋白疏水性的变化趋势；

图2是反复冻融0,5,10次后卵白蛋白游离巯基含量的变化趋势；

图3是反复冻融0,5,10次后卵白蛋白双酶水解度的变化趋势；

图4是反复冻融0,5,10次及双酶水解前后卵白蛋白致敏性的变化趋势。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

1.疏水性测定

用磷酸盐缓冲液将蛋白样品分别稀释至不同浓度0.005%，0.01%,0.05%,0.1%,0.2%五个不同浓度。取20µl的荧光探针8-苯胺基-1-萘磺酸钠（ans）溶液添加至4ml的蛋白样品中。用荧光分光光度计测定样品的荧光强度，其中激发波长为390nm，发射波长为470nm。荧光强度与蛋白浓度之间的初始斜率即为蛋白的表面疏水特性（ho）。

2.游离巯基含量的测定

将40mg蛋白样品溶解在4ml的sds-tge缓冲液中，溶解30min,每隔10min漩涡振荡一次。之后向其中加入0.04ml的ellman’s试剂，反应30min。之后离心（10000×g，20min）后取上清液，并于412nm波长下用分光光度计测定吸光度值；以sds-tge溶液作为空白对照。结果计算：用还原型谷胱甘肽作为标品制作标准曲线，最终结果表示为mmol巯基/g蛋白。

3.水解度的测定

采用ph滴定法对不同冻融次数的蛋白样品水解度（degreeofhydrolysis,dh）进行测定。dh按照以下公式进行计算（胰蛋白酶/转糖基酶：蛋白=1:200）：

dh(%)=[(vnaoh×nnaoh)/(α×mp×htot)]×100

其中，α是α-氨基基团的解离度，mp是psv的质量（g），htot是底物中肽键的数量（毫当量/g蛋白）。naoh浓度是0.25m。在25°c，ph8.0的条件下α值为0.88，鸡蛋蛋白的htot值为8.38。

反应条件：25°c；去离子水体系；ph8.0.

4.致敏性的测定

将以上所有样品（冻融0次、冻融5次、冻融10次、冻融0次+双酶水解、冻融5次+双酶水解、冻融10次+双酶水解）按照蛋清蛋白检测试剂盒（德国拜发，r6402）使用说明，对其中蛋白的抗原性进行测定。

实施例1

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，在蛋清中加入1倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌2h，调ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力搅拌2h；在4℃、15000g下离心10min，收集上清液；将收集的液体在4℃下用去离子水透析4次，冷冻干燥即得卵清蛋白；

（2）反复冻融处理：将步骤（1）所得卵清蛋白按其在天然蛋清中的比例（5.4%）复溶于去离子水中，-20℃冻存12h，之后于20℃解冻12h，分别重复3次后，最后冷冻干燥得到蛋白样品；

（3）酶处理：将步骤（2）处理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入转糖基酶，在ph8.0，温度25℃条件下处理2h，之后按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，调ph至8.0，于25℃条件下处理2h，得到最终的卵白蛋白水解样品，冷冻干燥后得到最终产物。

实施例2

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，在蛋清中加入8倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌2h，调ph至6.0；向其中加入50%（w/w）的peg-8000，磁力搅拌2h；在4℃、15000g下离心10min，收集上清液；将收集的液体在4℃下用去离子水透析4次，冷冻干燥即得卵清蛋白；

（2）反复冻融处理：将步骤（1）所得卵清蛋白按其在天然蛋清中的比例（5.4%）复溶于去离子水中，-20℃冻存12h，之后于20℃解冻12h，分别重复7次后，最后冷冻干燥得到蛋白样品；

（3）酶处理：将步骤（2）处理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入转糖基酶，在ph8.0，温度25℃条件下处理2h，之后按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，调ph至8.0，于25℃条件下处理2h，得到最终的卵白蛋白水解样品，冷冻干燥后得到最终产物。

实施例3

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，在蛋清中加入3倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌2h，调ph至6.0；向其中加入15%（w/w）的peg-8000，磁力搅拌2h；在4℃、15000g下离心10min，收集上清液；将收集的液体在4℃下用去离子水透析4次，冷冻干燥即得卵清蛋白；

（2）反复冻融处理：将步骤（1）所得卵清蛋白按其在天然蛋清中的比例（5.4%）复溶于去离子水中，-20℃冻存12h，之后于20℃解冻12h，分别重复5次后，最后冷冻干燥得到蛋白样品；

（3）酶处理：将步骤（2）处理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入转糖基酶，在ph8.0，温度25℃条件下处理2h，之后按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，调ph至8.0，于25℃条件下处理2h，得到最终的卵白蛋白水解样品，冷冻干燥后得到最终产物。

对比例1

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，在蛋清中加入1倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌2h，调ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力搅拌2h；在4℃、15000g下离心10min，收集上清液；将收集的液体在4℃下用去离子水透析4次，冷冻干燥即得卵清蛋白；

（2）加热预处理：将步骤（1）所得卵清蛋白按10mg/ml的比例复溶于去离子水中，于80℃水浴20min，待自然冷却至室温后，冷冻干燥得到蛋白样品；

（3）酶处理：将步骤（2）处理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，调ph至8.0，于50℃条件下处理2h，得到最终的卵白蛋白水解样品，冷冻干燥后得到最终产物。

对比例2

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，在蛋清中加入1倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌2h，调ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力搅拌2h；在4℃、15000g下离心10min，收集上清液；将收集的液体在4℃下用去离子水透析4次，冷冻干燥即得卵清蛋白；

（2）超声预处理：将步骤（1）所得卵清蛋白按10mg/ml的比例复溶于去离子水中，超声方式为工作5s,停止5s，功率1000w，反复进行20min后，冷冻干燥得到蛋白样品；

（3）酶处理：将步骤（2）处理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，调ph至8.0，于50℃条件下处理2h，得到最终的卵白蛋白水解样品，冷冻干燥后得到最终产物。

对比例3

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，在蛋清中加入1倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌2h，调ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力搅拌2h；在4℃、15000g下离心10min，收集上清液；将收集的液体在4℃下用去离子水透析4次，冷冻干燥即得卵清蛋白；

（2）高温高压预处理：将步骤（1）所得卵清蛋白按10mg/ml的比例复溶于去离子水中，放置于高压灭菌锅中（121℃）处理20min后，冷冻干燥得到蛋白样品；

（3）酶处理：将步骤（2）处理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，调ph至8.0，于50℃条件下处理2h，得到最终的卵白蛋白水解样品，冷冻干燥后得到最终产物。

对比例4

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器将蛋清与蛋黄分离，在蛋清中加入1倍体积的50mmol/l的nacl溶液混合搅拌2h，调ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力搅拌2h；在4℃、15000g下离心10min，收集上清液；将收集的液体在4℃下用去离子水透析4次，冷冻干燥即得卵清蛋白；

（2）高温高压预处理：将步骤（1）所得卵清蛋白按10mg/ml的比例复溶于去离子水中，放置于高压灭菌锅中（121℃）处理20min后，冷冻干燥得到蛋白样品；

（3）酶处理：将步骤（2）处理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入转木瓜蛋白酶，在ph7.0，温度25℃条件下处理2h，之后按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，调ph至8.0，于50℃条件下处理2h，得到最终的卵白蛋白水解样品，冷冻干燥后得到最终产物。

以上选用常用物理预处理手段（加热、超声、高温高压）与常用蛋白酶（胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）进行实施例对比。结果表明，对比例1、2、3、4中ova的水解度分别为17.4%，20.2%，27.5%，31.1%；抗原性分别为0.64，0.72，0.56，0.47。由此看出，与本发明涉及的处理方法相比，加热、超声等物理预处理加单一酶（胰蛋白酶）水解处理效果较弱。而高温高压加复合酶法（胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）协同处理脱敏效果较好，与本发明涉及方法效果相当。但是，高温高压等处理方法条件过于剧烈，容易导致最终蛋制品品质降低。这也是本发明涉及温和高效鸡蛋脱敏方法的创新之处。