群体感应淬灭酶和细菌素联合防腐保鲜方法与流程

本发明涉及食品保鲜
技术领域：
，具体地说，涉及一种群体感应淬灭酶和细菌素联合防腐保鲜方法。
背景技术：
：群体感应(quorumsensing,qs)是细菌通过产生、分泌和感知信号分子调节相关基因表达，从而控制一系列生理过程的一种信号交流机制。qs系统能调控细菌的多种行为例如致病性、生物被膜的形成、对抗菌物质的拮抗，对真核宿主细胞的防御响应等。近年来研究发现食品中微生物的某些行为(产生腐败酶，产生抗菌物质，生物被膜形成，通过竞争获得新特性或抗生素抗性)及微生物之间的相互影响及交流受qs调控，qs可能参与食品腐败。由于腐败菌的腐败行为可能受qs调控，因此通过阻断qs系统可以控制细菌中食品腐败相关基因的表达，最终控制腐败。群体感应淬灭酶能够破坏细菌的qs信号分子结构从而对其qs系统进行阻断，是一种有效的qs阻断方法。革兰氏阴性菌的qs信号分子通常为n-酰基高丝氨酸内酯(ahl),而ahl内酯酶是一种高度特定性的酶，它能够破坏ahls的高丝氨酸内酯环，具有广泛的底物活性，因此能够被用于阻断革兰氏阴性菌的qs系统。据报道，来源于芽孢杆菌ai96(bacillussp.ai96)的ahl内酯酶aiiaai96对多种ahls底物都具有水解活，且它与其它来源于bacillus的ahl内酯酶相比具有更稳定的理化性质，aiiaai96在ph8.0、10～40℃的条件下能维持接近100％的活性，在ph8.0，70℃条件下1h处理后能维持60％活性，并且能抵抗蛋白酶的水解作用，将aiiaai96口服斑马鱼，能显著减少嗜水气单胞菌对斑马鱼的致病力。目前，将ahl内酯酶应用于食品防腐的研究还未见报道。乳酸菌细菌素由于其高效、安全、无毒、可被人体消化等的优点，使其成为天然生物防腐剂的研究热点。目前乳酸菌细菌素中只有乳酸链球菌素(nisin)被批准添加到食品中。食品腐败特别是水产品的腐败主要由革兰氏阴性菌引起，而nisin对革兰氏阳性菌有非常强的抑制作用，对革兰氏阴性菌的抑制作用非常弱，因此它在食品腐败中的应用存在一定的局限性。将作用于革兰氏阴性菌的ahl内酯酶和作用于革兰氏阳性菌的nisin联合使用理论上可以达到更强的食品防腐效果，然而群体感应淬灭酶单独使用以及它与nisin复合使用应用于食品防腐方面的研究还未见报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种群体感应淬灭酶和细菌素联合防腐保鲜方法。为了实现本发明目的，本发明首先提供一种防腐保鲜剂，其含有群体感应淬灭酶和乳酸链球菌素。优选地，本发明的防腐保鲜剂是将群体感应淬灭酶和乳酸链球菌素制成ph值为6.0-8.0的混合溶液；混合溶液中，群体感应淬灭酶的终浓度为6.6×10-2u/ml-66u/ml，乳酸链球菌素的终浓度为1800-2300iu/ml。优选地，本发明防腐保鲜剂中的群体感应淬灭酶的终浓度为6.6×10-1u/ml-6.6u/ml，乳酸链球菌素的终浓度为1900-2200iu/ml。更优选地，本发明防腐保鲜剂中的群体感应淬灭酶的终浓度为6.6×10-2u/ml，6.6×10-1u/ml或6.6u/ml，乳酸链球菌素的终浓度为2000iu/ml。最优选地，本发明防腐保鲜剂中的群体感应淬灭酶的终浓度为6.6u/ml，乳酸链球菌素的终浓度为2000iu/ml。进一步地，将群体感应淬灭酶和乳酸链球菌素制成ph为7.0的混合溶液；混合溶液的溶剂为0.1m和ph7.0的磷酸盐缓冲溶液。本发明提供了上述防腐保鲜剂在食品防腐保鲜中的应用。本发明提供了群体感应淬灭酶和细菌素联合防腐保鲜方法，是将待保鲜的食品在本发明上述的防腐保鲜剂液中浸泡处理。所述的食品为水产品或非水产品的肉类。浸泡处理时间为3-5min。本发明的群体感应淬灭酶和细菌素联合防腐保鲜方法还包括将浸泡后的食品取出沥干，0-4℃储藏或真空包装。本发明在不使用任何化学防腐剂的情况下，结合了群体感应淬灭酶对革兰氏阴性菌起主要作用和nisin对革兰氏阳性菌起主要作用的特点，对低温食品特别是水产品的防腐保鲜提供了一种新的方法。该技术不仅可以明显延长真空包装鲟鱼片4℃冷藏的货架期延长5天，有效减少贮藏过程中挥发性盐基氮和生物胺的积累，还可以延缓鱼肉色泽、气味、质构等感官品质的下降。附图说明图1真空包装鲟鱼片4℃贮藏过程中总菌数的变化.a,0.1mph7.0磷酸盐缓冲液处理组；b,c,d分别为6.6,6.6×10-1,6.6×10-2u/ml淬灭酶处理组；e,f,g分别为6.6,6.6×10-1,6.6×10-2u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复合处理组；h为2000iu/mlnisin处理组。a～h图例适用于图2至图7。图2真空包装鲟鱼片4℃贮藏过程中气单胞菌数的变化。图3真空包装鲟鱼片4℃贮藏过程中耐冷菌数的变化。图4真空包装鲟鱼片4℃贮藏过程中肠科菌菌数的变化。图5真空包装鲟鱼片4℃贮藏过程中感官分值的变化。图6真空包装鲟鱼片4℃贮藏过程中tvb-n的变化。图7真空包装鲟鱼片4℃贮藏过程中生物胺的变化。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本发明实施例采用的乳酸链球菌素(nisin)，购于浙江新银象生物工程有限公司，效价为1×106iu/g。群体感应淬灭酶购于北京挑战生物技术有限公司，n-酰基高丝氨酸内酯酶酶活为1000u/g。下文将其简称为淬灭酶。实施例1利用群体感应淬灭酶和细菌素对鲟鱼片的防腐保鲜1、含有群体感应淬灭酶和乳酸链球菌素的防腐保鲜剂的制备淬灭酶酶活的测定方法采用琼脂平板扩散法。将3-oxo-c8-hsl溶于1×pbsph8.0缓冲液中，使其终浓度为1mg/l。酶活反应体系：将20μl酶液，179ul的1×pbsph8.0缓冲液和1μl的3-oxo-c8-hsl的溶液混合，摇匀。30℃温育30min后，反应体系中加入50μl10％的sds溶液终止反应。在用平板扩散法检测中，atmm琼脂用手术刀切割成4×60mm的胶条，用牙签将检测菌kyc55间隔4mm点接于胶条上，将10μl的反应终止的酶反应液滴定至胶条一端，30℃培养24h后计数变蓝点数，计算距离，按标准曲线公式计算3-oxo-c8-hsl消耗。对照组加酶液和缓冲液后，先加sds溶液再加信号分子。标准曲线制备，将3-oxo-c8-hsl溶于1×pbsph8.0缓冲液中，终浓度为1mg/l。分别向1×pbsph8.0的缓冲液中添加10、5、1、0.5、0.1和0.05μl的3-oxo-c8-hsl的溶液，用1×pbsph8.0的缓冲液将体系补充至200μl，摇匀。30℃温育30min后，反应体系中加入50μl10％的sds溶液终止反应。用牙签将检测菌kyc55间隔4mm点接于胶条上，将10μl反应终止的反应液滴至胶条一端，30℃培养24h后计数变蓝点数，计算距离(mm)，以加入3-oxo-c8-hsl物质量为纵轴(y)，以扩散距离为横轴(x)，建立回归方程，计算3-oxo-c8-hsl消耗量。并以回归方程为基础建立酶活计算公式。酶活(u/ml)单位定义：在30℃条件下1min分解1nmol3-oxo-c8-hsl定义为一个酶活单位。以0.1mph7.0磷酸盐缓冲液为母液，添加一定量的nisin配制成2000iu/ml的nisin储备液。将淬灭酶用0.1mph7.0磷酸盐缓冲液配制成6.6、6.6×10-1、6.6×10-2u/ml3个不同浓度的淬灭酶溶液。同时，在0.1mph7.0磷酸盐缓冲液中添加一定量的nisin和淬灭酶溶液配制成3种不同的nisin-淬灭酶复配液，即防腐保鲜剂，其中nisin的效价均为2000iu/ml，群体感应淬灭酶的效价分别为6.6、6.6×10-1、6.6×10-2u/ml。2、群体感应淬灭酶和细菌素联合防腐保鲜方法的建立将鲜活鲟鱼用无菌水清洗、去头、去内脏、切片并再次清洗。将鲟鱼样品随机分成8个处理组：(a)0.1mph7.0磷酸盐缓冲液(空白对照组)，(b)6.6u/ml淬灭酶，(c)6.6×10-1u/ml淬灭酶，(d)6.6×10-2u/ml淬灭酶，(e)6.6u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复合液，(f)6.6×10-1u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复合液，(g)6.6×10-2u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复合液，(h)2000iu/mlnisin。将鱼片在各处理溶液中浸泡3min，捞出沥干15s，然后将鱼片置于真空包装袋中进行真空包装。3、效果检测将已经浸泡处理并真空包装的鱼肉样品立即取出部分鱼肉进行分析，数据记为第0天，剩余鱼肉冷藏于4℃冰鲜中，分别在贮藏的第3，6，8，10，12，14天进行取样分析。每个处理组取3袋进行测定，测定结果取平均值。(1)不同处理组鱼片的微生物变化分析取经过上述防腐剂浸泡处理过25g鲟鱼肉于225ml生理盐水(0.85％,w/v)中，均质60s，用生理盐水做10倍梯度稀释，在选择性培养基平板中做倾注法计数，表1中每种微生物选择三个梯度进行计数，每个梯度做两个平行。微生物分析方法参照国家标准进行，不同菌群分别采用不同的选择性培养基和培养条件进行分离和计数，详见表1。本试验中各微生物的检测方法的检测极限均为10cfu/g。表1鱼片中不同微生物的培养条件微生物种类培养基培养条件所参考标准平板计数(pca)琼脂36±1℃48h①气单胞菌氨苄青霉素麦康凯琼脂(ama)28±1℃48h②耐冷菌平板计数(pca)琼脂6.5±0.5℃10d③大肠菌群结晶紫中性红胆盐琼脂(vrba)36±1℃18-24h④表1中①为gb4789.2-2010《食品微生物学检验菌落总数测定》，②为guim,etal.biogenicaminesformation,nucleotidedegradationandtvb‐naccumulationofvacuum‐packedmincedsturgeon(acipenserschrencki)storedat4℃andtheirrelationtomicrobiologicalattributes[j].journalofthescienceoffoodandagriculture,2014,94(10):2057-2063.，③为ny/t1331-2007《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》，④为gb4789.3-2008《食品微生物学检验大肠菌群计数》。图1-4描述了淬灭酶和细菌素处理对鲟鱼片4℃冷藏过程中细菌总数、气单胞菌、耐冷菌和大肠菌群的变化。各组样品在储藏期间总菌数显著增加(p<0.05)(图1)，各组样品总菌数增加到7logcfu/g的天数分别：a组为3-6天，d组、c组为6-8天，b组、h组约为8天，g组、f组为8-10天，e组为10-12天。这说明群体感应淬灭酶对鲟鱼片微生物生长具有抑制作用，且群体感应淬灭酶量越大，抑制能力越强；6.6u/ml淬灭酶(b组)与2000iu/mlnisin(h组)抑菌效果相当。从本试验中还可以发现，与单独淬灭酶处理相比，淬灭酶与nisin复配后对鲟鱼片的抑菌效果增强，与对照组相比，6.6u/ml淬灭酶处理组鱼片货架期延长了约3天，而6.6u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复配后货架期延长了约5天。淬灭酶对气单胞菌、耐冷菌和肠科菌均呈现不同程度的抑制效果(图2-4)，且6.6u/ml淬灭酶抑菌效果均显著好于6.6×10-2u/ml和6.6×10-1u/ml淬灭酶处理效果。将淬灭酶与nisin复配后使用抑菌效果增强，6.6u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复配处理组在所有处理组中抑菌效果均最好。(2)不同处理鱼片的理化及感官特性变化分析1)感官特性变化分析采用定量描述分析(quantitativedescriptiveanalysis,qda)对各处理样品进行感官评定。评定小组由6个经过培训过的感官评价人员组成的评定小组依据表2中质量指标评定方法进行打分。4个得分水平(0-3)和4个参数(质地、气味、颜色和不紧密性)用于评价鲟鱼片的感官情况。表2鲟鱼鱼片感官评价标准鲟鱼片在不同处理条件下感官分值变化如图5所示。0分代表鱼处于完全新鲜的状态，6分代表鱼片到达了感官可接受限值。所有处理组鱼片在储藏期间感官分值均显著性上升(p<0.05)，说明鱼片在逐渐腐败，随着储藏时间增加，鱼片主要表现在质地变软、出水量增加、逐渐变的不紧密，酸败味加重且鱼片颜色由白色变成偏黄色。感官评价的货架期a组为3～6天，c、d组为6～8天，b组、h组、f组、g组组均为8～10天，e组为10～12天，与微生物评价的货架期基本一致。与对照组感官评价货架期相比，b组延长了约3天，而e组延长了约5天，说明6.6u/ml淬灭酶处理能有效延缓鱼片感官品质的变坏程度，且6.6u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复配处理能使鱼片感官品质得到更好的控制。2)总挥发性盐基氮(tvb-n)的变化采用gb/t5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法测定。简述如下：称取10g碎肉(前述8种不同处理方式下的鱼肉，分别采集碎肉)于100ml水中，震荡均匀，浸渍30min过滤。采用fosskjeltec2300型凯氏定氮仪。将盛有10ml吸收液及5至6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，准确量取5ml样液于消化管中，进行蒸馏，5min后停止，吸收液用盐酸标准液(0.01mol/l)进行滴定，终点至蓝紫色。以蒸馏水为空白。结果计算：试样中挥发性盐基氮的含量按式(1)计算x＝((v1-v2)×c×14)/(m×5/100)×100式(1)中：x—试样中挥发性盐基氮的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)vi—测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，单位为毫升(ml)；v2—试剂空自消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，单位为毫升(ml)；c一盐酸标准溶液的实际浓度，单位为摩尔每升(mo1/l)；14一与1.00ml盐酸标准滴定溶液(c(hci)＝1.000mol/l)相当的氮的质量，单位为毫克(mg)；m—试样质量，单位为克(g)。鱼肉中tvb-n的增加主要来源于细菌降解蛋白质、氨基酸和鱼肉中其它碱性氮类化合物产生的氨,它一定程度上反应鱼皮的微生物腐败程度。鲟鱼鱼片在不同处理条件下tvb-n变化如图6所示。在各处理组鲟鱼片到达感官拒绝点时，各处理组的tvb-n值处于20～30mg/100g，低于欧洲委员会规定的鱼腐败可接受上限35mg/100g。在0～14天(第0天除外)储藏期间，鲟鱼片各处理组tvb-n均显著低于对照组(p<0.05)。在8～10天储藏期间b组tvb-n值显著低于c组及d组(p<0.05)，而e组显著低于其它处理组(p<0.05)，说明淬灭酶能有效抑制鲟鱼鱼片tvb-n的积累，且淬灭酶量增加至6.6u/ml时抑制效果最明显，淬灭酶与nisin复配时对tvb-n积累的抑制效果优于单独淬灭酶处理时效果。3)生物胺的变化生物胺是微生物将氨基酸脱羧后产生的非挥发性物质，它们的存在与腐败相关。鲟鱼片在不同处理条件下生物胺总数的变化如图7所示。a组、c组、d组在储藏第6天，b组、h组、f组、g组在储藏第8天，e组在储藏第10天，即各处理组总菌数达到接近7logcfu/g时生物胺总数开始陡然上升，这与tvb-n的变化趋势一致。储藏第6天开始，b组生物胺总数显著低于a组、c组、d组，而c组和d组在第6～10天无显著性差异(p>0.05)，且c组、d组在第10天和第8天与a组也无显著性差异(p>0.05)，这说明淬灭酶对鲟鱼鱼片生物胺积累具有抑制作用，但这种抑制作用并不与淬灭酶的剂量呈简单的依赖关系，只有当淬灭酶量达到6.6u/ml时，才对生物胺的积累产生明显的抑制作用，在微生物和tvb-n试验中也发现了同样规律。在整个储藏期间(除第12天外)，h组与b组生物胺总数无显著性差异(p>0.05)，这说明6.6u/ml淬灭酶抑制鲟鱼鱼片生物胺积累的效果与2000iu/mlnisin效果一致。e组在鲟鱼鱼片储藏后期(第10～14天)均显著低于其它处理组(p<0.05)，说明6.6u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复配后对生物胺积累的抑制效果最好，这与微生物、感官及tvb-n的结果一致，这说明6.6u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复配后对鲟鱼鱼片防腐效果具有叠加效应，优于单独淬灭酶处理或者nisin处理时防腐效果。综合微生物、理化及感官特性分析，确定6.6u/ml淬灭酶与2000iu/mlnisin复配处理的效果最好，可将产品货架期延长5天左右。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12