专利名称：有利于断裂神经再生的生物可吸收导线与导管的制作方法
技术领域：
本发明涉及有利于哺乳动物神经再生的生物可吸收移植物，具体涉及在断裂的哺乳动物神经近体端与远体端之间搭桥的具有神经元粘附分子的生物可吸收导线与导管移植物。
自13世纪起就有人试图用手术的方法来修复神经损伤，但迄今为止，神经损伤的功能恢复仍是一个未解决的难题。学术界曾经认为神经损伤将导致所有相关功能永久性不可恢复。但后来人们又逐渐发现周围神经系统与中枢神经系统均有相当强的再生能力，关键在于给予其适当的再生环境。科学家对于神经再生环境作了大量研究。八十年代神经生物学研究开始深入到了分子水平，但至今尚未找到明确答案，因为神经再生的分子生物学机制仍是一个未完全解开的谜。尽管如此，就目前的技术水平而言，相对于中枢神经再生，实现周围神经再生已更为现实。
目前临床上，一般对周围神经断裂的病人采用神经外膜或束膜缝合术。但是，对于周围神经长距离(1厘米以上)断性损伤的病人，直接将断裂神经的近体端与远体端之间进行手术缝合会出现张力，妨碍神经再生，所以对此类病人目前临床上的常用选择为自体神经移植。自体神经移植需要二次手术，在供体的伤口处可能会有麻木或感觉过敏的问题，经常会受到移植体尺寸的限制，而且总体的预后效果并不好。异体移植也曾经应用过，但需要免疫抑制剂，且成功率太低。
为了避免自体或异体神经移植的种种问题，现在研究较多的是神经导管，又称人工神经移植物。神经导管是用合成材料或生物材料制得，用于在断裂神经的近体端与远体端之间搭桥，起到引导及促进神经再生的作用。导管可以是中空的，可以在制备时或移植前往管腔中加入一些有生物活性的因子、细胞等，也可以将活性因子直接与导管内壁交联。一个理想的人工神经移植物应具有活性因子局部浓缩、减少细胞侵噬、减少神经瘢痕和引导神经再生方向的作用，从而防止神经瘤生成和神经过度分枝。
制备神经导管的材料，可分为生物不可吸收与生物可吸收两种。生物不可吸收的材料研究最多的是硅酮橡胶，但植入后往往有长期的副作用包括纤维化、神经压迫等，需要再次手术取出导管，故现在临床上很少使用硅酮橡胶制备的神经导管。生物可吸收材料制得的导管具有无须手术取出的优点，是目前研究的主导方向。采用的材料包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和胶原蛋白等等。从动物实验及人体临床的数据看，聚羟基乙酸是一种非常有前途的神经导管材料。用聚羟基乙酸做成的中空导管可成功地连接0.5～3.0厘米的人指神经空缺，并且临床预后与自体神经移植的效果相当[Mackinnon，S.E.and Dellon，A.L.(1990)Plast.Reconstr.Surg.85，419-424]。为了使神经再生得到更好的环境与条件，研究者们在开发管腔内充填活性因子或管壁交联活性因子的导管上做了大量工作，这些因子包括神经生长因子、神经营养因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、层粘连蛋白(laminin)等等。日本的一个研究小组曾经用管腔内充填有神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的PGA导管成功地连接猫坐骨神经2.5厘米的空缺[Kiyotani T.and Teramachi M.et al.Brain Research 740(1996)66-74]。可是在神经导管的应用中，目前存在的主要问题是再生过程中神经瘤的形成。再生神经的生长锥由于在导管中的生长仍缺乏方向性，导致反向生长，是神经瘤形成的主要原因。
本发明的目的在于解决上述存在问题，提供一种能促使神经再生具有良好方向性的生物可吸收导线与导管，这种导线、导管或导线-导管的联合应用，能有效消除或减少神经再生中神经瘤的形成，改善临床预后效果。
本发明包括有利于断裂神经再生的生物可吸收导线与导管移植物。
本发明生物可吸收导线的技术解决方案其特殊之处是该导线具有至少一种神经元粘附分子。
本发明生物可吸收导管的技术解决方案其特殊之处是该导管内具有至少一种神经元粘附分子。
所述的导管内具有至少一种神经元粘附分子可以是导管内壁包被有至少一种神经元粘附分子。
所述的导管内具有至少一种神经元粘附分子也可以是导管管壁内含有至少一种神经元粘附分子。
所述的导管内具有至少一种神经元粘附分子还可以是导管管腔内埋置有具有至少一种神经元粘附分子的介质。
所述的介质可以是生物可吸收导线，也可以是生物可吸收胶状物。
本发明所述的神经元粘附分子是指脊椎动物源的神经元粘附分子，此类分子是指神经元粘附分子的全部或部分一级结构、具有神经元粘附分子生物活性的突变蛋白或具有神经元粘附分子生物活性的融合蛋白。
所述的脊椎动物源包括但不局限于人源。
本发明所述的导线具有至少一种神经元粘附分子可以是导线表面包被有至少一种神经元粘附分子，也可以是导线线体中具有至少一种神经元粘附分子。
神经元粘附分子[Neuronal Cell Adhesion Molecules(neuronalCAMs)]通过调节神经细胞的粘附和迁移、轴突生长及成束、突触形成和细胞内信息传导来控制细胞与细胞间的相互作用。神经元粘附分子具有促轴突生长和再鞘(remyelination)的活性。神经细胞粘附分子从结构上可分作三大类免疫球蛋白超家族类(immunoglobulin superfamily)、细胞粘附素(cadherin)类和整合素(integrin)类。其中免疫球蛋白超家族类是最大的一类。目前已经发现的神经元粘附分子有NCAM，F3/F11，L1，NgCAM，NrCAM，CHL1，TAG1/axonin-1，neurofascin，BIG1，BIG2等[R.Douglas Fields & Kouichi Itih，Trends in Neurosciences，Vol.19，No.11.(1996)；Yoshihiro Yoshihara and Miwa Kawasaki et al.，Vol.28No.1，pp51-69(1995)]。
Neural cell adhesion molecule(NCAM)是在神经细胞表面最丰富的粘附分子之一，70年代被发现。虽然NCAM来自一个基因，但是由于RNA(核糖核酸)剪切水平和翻译水平的不同，最终有多种的NCAM分子。除了免疫球蛋白结构域外，NCAM还有与纤粘连蛋白(fibronectin)同源的区域(Christo Goridis & Jean-FrancoisBrunet，Seminars in Cell Bioligy，1992，3192)。
L1家族蛋白与许多神经系统疾病有关，目前发现的L1蛋白均有6个免疫球蛋白结构域与5个fibronectin III型(FNIII)结构域及一个疏水性穿膜区域、长度在85-147个氨基酸之间的胞内序列。L1蛋白主要在发育中的周围及中枢神经系统中表达，参与神经细胞粘附(Michael Hortsch，Neuron，Vol.17，587-593，October，1996)。CHL1是1996年发现的L1家庭的新成员，与L1有很高的同源性[Holm J.and Hillenbrand R.，et al.Eur J.Neurosci，19961613-1629]，是一个神经识别分子，有促进轴突生长的作用。
本发明提供的一种生物可吸收导线与导管，由于其上具有至少一种神经元粘附分子，故这种导线和/或导管的植入，可使神经细胞的生长锥粘附到连接哺乳动物神经近体端与远体端的导线和/或导管上，使生长锥能沿导线和/或导管定向生长，从而避免神经再生过程中神经瘤的形成。这是由于神经元粘附分子具有自体相吸作用(homophilic interaction，即互为配体与受体)和/或异体相吸作用(heterophilic interaction)。神经元粘附分子在生长的轴突上也自然表达。断裂神经的生长锥因为表达有神经元粘附分子，故可以与导线和/或导管上包被的神经元粘附分子结合，从而沿导线和/或导管生长。由于沿导线、导管生长的轴突表面自然表达神经元粘附分子，后长的轴突可粘附于先长的轴突生长(称作接触介导吸引，contact attraction)，从而使得再生轴突从总体上沿导线、导管定向生长，避免了神经瘤的形成。
本发明的导管可以做成其管壁具有滤膜性能的，以致于对管壁外部物质按分子量大小起选择性透过作用[Aebischer P.andGuenard V.et al.(1988)Brain Res.454，179-187]。所述的导管可以用同一种或多种材料做成多层的[den Dunnen.W F.A.et al.(1996)JBiomed.Mater.Res.31，105-115；Hoppen，H.J.and Leenslag，J.W.et al.(1990)Biomaterials 11，286-289]。
下面以实施例对本发明作具体说明。
实施例1包被有神经元粘附分子的生物可吸收导线(1)神经元粘附分子NCAM-Fc融合蛋白的制备NCAM基因(Genbank号X15049)的第42到第2233号核苷酸与人免疫球蛋白G1的Fc片段融合，融合基因插入表达载体pEE14。用该载体转化CHOK1细胞，挑选出能高表达NCAM-Fc融合蛋白的稳定表达型细胞株。融合蛋白用Protein-A柱纯化。
(2)导线制作采用符美国药典6/0号(直径0.07毫米)的PGA多丝手术缝合线，将此缝合线浸润于经无菌过滤的、含有1mg/ml NCAM-Fc蛋白的生理磷酸盐缓冲溶液中，4℃过夜，130℃热处理70分钟，随即应用于手术。
所选用的神经元粘附分子不限于NCAM-Fc，生物可吸收导线的材料也不限于PGA；导线直径包括但不局限于0.07毫米。
实施例2管壁包被有神经元粘附分子的生物可吸收导管(1)此导管所包被的神经元粘附分子同例1。
(2)导管制作采用符美国药典2/0号(直径0.3毫米)的PGA多丝手术缝合线经织带机编织成内径4-5毫米，长2.5厘米的中空管，用环氧乙烷消毒后，将此导管浸润于经无菌过滤的、含有1mg/ml NCAM-Fc蛋白的生理磷酸盐缓冲溶液中，4℃过夜，130℃热处理70分钟，充氮，-20℃储存。
此生物可吸收导管的材料不限于PGA，其制作方法和尺寸也不限于本例所述方法。
实施例3管壁内含有至少一种神经元粘附分子的导管这种导管可参照文献[P.Aebischer，A.N.Salessiotis et al.(1989)Journal of Neuroscience Research 23282-289]中所述的方法制作。简单地说，先制备干重比为40％的牛血清白蛋白(BSA)/乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)溶液，将一定量的NCAM-Fc冻干粉加入到此溶液中混匀，用含NCAM-Fc的BSA/EVA溶液经金属模具制成不同规格的导管，将此导管浸入10％的纯EVA溶液4次后，风干即成。
管壁内含有至少一种神经元粘附分子的导管的制备包括但不局限于本实施例中所述的方法；可选用的神经元粘附分子包括但不局限于NCAM-Fc。
实施例4埋置有具有至少一种神经元粘附分子的生物可吸收胶状物的导管胶状物的制作将一定量的NCAM-Fc冻干粉与含层粘连蛋白的胶(Matrigel)混合即得。Matrigel的制备方法参见[Kleinman，etal.(1986)Biochemistry，25312]。也可将一定量NCAM-Fc的冻干粉与医用明胶(gelatin)混合制得。医用明胶在神经再生中被证明是安全的[Brown R.E.and Erdmann D.et al.(1996)J Reconstr.Microsurg.12，149-152]。
将此胶状物埋置于生物可吸收导管即制成本例导管。生物可吸收导管可采用符美国药典2/0号(直径0.3毫米)的PGA多丝手术缝合线经织带机编织制成。
本例中，可选用的神经元粘附分子包括但不局限于NCAM-Fc；可选用的胶状物包括但不局限于Matrigel和gelatin。可选用的导管包括但不局限于本实施例中所述的导管。
以下试验是应用导管和导线，对实验动物进行神经再造手术，并对再生神经进行形态学和组织学研究。
其中——导管采用符美国药典2/0号(直径0.3毫米)的PGA多丝手术缝合线经织带机编织成内径4-5毫米，长2.5厘米的中空管，用环氧乙烷消毒后，充氮，-20℃储存，此为生物可吸收导管；导线为两种，一种是未经NCAM-Fc蛋白浸润、处理过的符美国药典6/0号PGA缝合线；另一种是经NCAM-Fc蛋白浸润、处理过的符美国药典6/0号PGA缝合线，即例1导线。
将体重4～5公斤的猫分为3组，每组4只，共12只。
第一组(4只)导管。
第二组(4只)导管和未经NCAM-Fc蛋白浸润、处理过的导线。
第三组(4只)导管和经NCAM-Fc蛋白浸润、处理过的导线。
猫经3～5mg/kg的盐酸氯胺酮麻醉后，露出坐骨神经，切除2厘米的左大腿中部坐骨神经。在第一组中，将神经的近体端与远体端插入导管中，将神经与导管缝合。在第二组中，先将神经的近体端与导管一端缝合，再三次将未经NCAM-FC蛋白浸润、处理过的导线从神经近体端穿入，经导管空腔从神经远体端穿出，最后将神经远端与导管另一端缝合。在第三组中，手术操作同第二组，但使用经NCAM-Fc蛋白浸润、处理过的导线。手术中用直径0.15毫米的尼龙手术缝合线将导管与神经缝合，作为标记。猫右大腿的坐骨神经作为对照。
12只猫均存活，5个月后将猫处死。取下实验猫的左右坐骨神经进行形态学和组织学观察。
在所有实验动物中，均未发现导管或导线，表明5个月后实验中使用的导管和导线全部降解吸收。在所有实验动物中均观察到再生神经。在第一和第二组中，所有实验动物的再生神经两端(有尼龙手术缝合线为标记)均观察到肿起节段，标志着神经再生过程中出现神经瘤。在第三组中，4只实验动物的再生神经两端均未观察到肿起节段，表明未出现神经瘤。
坐骨神经经2.5％戊甲醛固定，2％四氧化锇(OsO4)再固定后，用乙醇脱水，包埋。从再生神经的中部切下1微米厚的切片，甲苯胺蓝染色。用电脑系统对有髓神经纤维的密度及直径定量记录，结果见表1、表2。
表1有髓神经纤维的密度(条/100×100微米2)
表2有髓神经纤维直径(微米)的平均值
表1、表2的数据显示PGA导管是用于神经移植的较好替代物，导线与导管联合使用对于有髓神经纤维的数量及直径无显著影响。
权利要求
1.一种用于在断裂的哺乳动物神经近体端与远体端之间起导向作用的生物可吸收导线，其特征是该导线具有至少一种神经元粘附分子。
2.一种用于在断裂的哺乳动物神经近体端与远体端之间搭桥的生物可吸收导管，其特征是该导管内具有至少一种神经元粘附分子。
3.如权利要求2所述的导管，其特征是所述的导管内具有至少一种神经元粘附分子是指导管内壁包被有至少一种神经元粘附分子。
4.如权利要求2所述的导管，其特征是所述的导管内具有至少一种神经元粘附分子是指导管管壁内含有至少一种神经元粘附分子。
5.如权利要求2所述的导管，其特征是所述的导管内具有至少一种神经元粘附分子是指导管管腔内埋置有具有至少一种神经元粘附分子的介质。
6.如权利要求5所述的导管，其特征是所述的介质是生物可吸收导线。
7.如权利要求5所述的导管，其特征是所述的介质是生物可吸收胶状物。
8.如权利要求1所述的导线，其特征是所述的神经元粘附分子是指脊椎动物源的神经元粘附分子。
9.如权利要求2—7任何一权利要求所述的导管，其特征是所述的神经元粘附分子是指脊椎动物源的神经元粘附分子。
10.如权利要求1或8所述的导线，其特征是所述的神经元粘附分子是指神经元粘附分子的全部或部分一级结构、具有神经元粘附分子生物活性的突变蛋白或具有神经元粘附分子生物活性的融合蛋白。
11.如权利要求2—7任何一权利要求所述的导管，其特征是所述神经元粘附分子是指神经元粘附分子的全部或部分一级结构、具有神经元粘附分子生物活性的突变蛋白或具有神经元粘附分子生物活性的融合蛋白。
12.如权利要求8所述的导线，其特征是所述的脊椎动物源指人源。
13.如权利要求9所述的导线，其特征是所述的脊椎动物源指人源。
全文摘要
一种用于在断裂的哺乳动物神经近体端与远体端之间起导向作用的生物可吸收导线,它具有至少一种神经元粘附分子。一种用于在断裂的哺乳动物神经近体端与远体端之间搭桥的生物可吸收导管,它具有至少一种神经元粘附分子。所述的神经元粘附分子是指神经元粘附分子的全部或部分一级结构、具有神经元粘附分子生物活性的突变蛋白或具有神经元粘附分子生物活性的融合蛋白。本导线、导管植入能防止神经瘤形成。
文档编号A61L29/04GK1340363SQ0012691
公开日2002年3月20日 申请日期2000年9月1日 优先权日2000年9月1日
发明者肖志成, 周黎 申请人:肖志成, 周黎