专利名称：：禽用复合型淋巴因子及其生产方法
技术领域：
：本发明涉及一种由鸡体内淋巴细胞中提取的复合淋巴因子及其生产方法，该复合淋巴因子给禽使用后能激活体内淋巴细胞提高机体细胞免疫功能；本发明属于兽用生物制品的生产及使用领域。机体的免疫功能，由体液免疫和细胞免疫共同完成。当前体液免疫发展迅速，不论是理论和生产都取得了巨大成绩。例许多的疫苗、高免卵黄抗体、高免血清等都得到了广泛的应用，但是细胞介导免疫直接用于治疗还在研究中。本发明的目的就在于将细胞介导免疫用于疫病的防治方面。具体地说，就是从禽体多种淋巴细胞中提取的具有一定生物活性的物质，本发明人称其为复合型淋巴因子，该因子含有18种氨基酸，多种维生素和微量元素，核苷酸等。本发明人将此种复合型淋巴因子用于疾病的治疗。以细胞介导免疫应答直接用于病毒治疗，它克服了化学药物的残毒，抗药性的缺点，同时也克服了体液免疫抑制等方面的缺陷，尤其对抵抗力是以细胞介导免疫应答为主的一些传染病(如鸡传染性喉气管炎)更有其独特疗效。复合型淋巴因子的抗病毒机理多种淋巴因子进入机体后。增强机体的抗病抵抗力是以细胞介导的免疫应答为主，即多种淋巴因子进入机体由于相互协同作用，激活其他淋巴细胞放出更多的淋巴因子起连续作用，除杀灭更多的病毒粒子外，还能有效地调理和增强机体的细胞免疫和体液免疫，解除免疫抑制和免疫缺陷，大大地增强机体的免疫功能。在《禽病学》中(B.W.卡尔尼克主编，高福，等译，禽病学(第九版)，北京北京农业大学出版社，1991。)有以下论述，即鸡对喉气管炎病毒的抵抗力以细胞介导的免疫应答为主。因此切除法氏囊或用环磷酰胺处理的鸡，虽然不能产生体液免疫应答，但在喉气管炎免疫后能产生完全免疫力。Faheg等证实，把免疫的脾细胞转移到近交系的鸡体内，可使其产生对喉气管炎抵抗力。本发明的目的是由动物机体内的免疫组织器官中提取出具有活性的淋巴因子，在动物生长的一定阶段饮用这种复合淋巴因子，激发动物体自身的细胞介导免疫，提高机体的免疫力，就像用疫苗提高机体体液免疫方面功能达到防病的目的一样。到时可以做到少用药，以提高机体自身的抗病能力来防治病菌的入侵。本发明的技术特征由鸡体内的免疫组织器官，脾脏、胸腺、淋巴结、法氏囊中提取出具有活性的复合淋巴因子(本申请案所指的复合型淋巴因子或复合淋巴因子是多种淋巴组织混合物的提取物，是为区别一般概念上的经提纯的单淋巴因子)。在鸡生长的一定阶段饮用这种复合淋巴因子，以提高机体自身的抗病能力来防治病原微生物的入侵，在动物发生病毒感染时用来进行治疗。本发明的详细描述1复合淋巴因子生产的工艺流程为鸡体免疫组织器官→洗净→冲洗→无菌蒸馏水冲洗→高速捣碎机内捣碎破细胞→冻融→离心→透析→过滤除菌→检验合格→分装并于-20℃冻存。2复合淋巴因子的生产过程2.1原料健康鸡只(肉鸡、青年鸡、成鸡)的免疫组织器官脾脏、胸腺、淋巴结、法氏囊。器官新鲜、色正、无臭、无任何病变。剪去被膜、脂肪。洗净、然后用自来水慢慢流过，轻轻冲洗。再用无菌水浸泡5min，换水一次，反复三次，取出放在筛孔溶器内滴干水。2.2捣碎破组织取400g脏器(其中脾脏250g，胸腺50g，法氏囊、淋巴结100g)，放入捣碎机内，加少量无菌蒸馏水捣3min，捣破细胞、最后加至2000ml无菌蒸馏水倒入白瓷桶内，共5次1万ml组织匀浆，密封。2.3冻溶白瓷桶放入-20℃冰柜内结冻、结冻后放15℃室温下溶冻，反复冻溶5次。注意温度不宜过高，以免杂菌生长，此过程大约5天时间可以完成。2.4过滤冻溶结束后，用双层纱布反复过滤5次，弃去沉淀物，取上清液再过滤、过滤液呈红色透明的初提液，(也可用离心机离心弃去沉淀物)。2.5透析2.5.1透析袋处理透析袋购于华美生物工程公司。每条袋子60cm长、宽8cm，先用无菌水浸泡，白棉线扎一头，用自来水冲洗内径，最后用留水冲洗，放入留水中煮沸，取出备用。2.5.2白瓷桶内盛1万ml无菌留水，事先放入冰箱让其冷至4℃左右，备用。2.5.3将初提液灌入透析袋中，扎紧头后、仔细检查是否有漏孔，然后用留水冲洗袋外径，放入白瓷桶内，1万ml水中投放18根透析袋，密封，冰箱透析48小时取出。其透析液呈浅黄色，透明、无味、无臭。再放入细菌过滤器，加压过滤，分装于200ml塑料瓶里，置冰柜-20℃保存备用，即为复合淋巴因子。如发现透析液混浊，有异味即说明被污染，应废弃。复合淋巴因子在制备整个过程中，无毒气、无毒液、无毒渣排出。不存在污染环境的问题。注入机体后更不存残留毒。2.6复合淋巴因子各项技术指标2.6.1根据生物学特性检测结果按本发明上述方法制备的复合淋巴因子，无菌、无毒、无抗原性、无热源、安全，在体内不存残毒、不污染环境。具有活化淋巴细胞的作用，增强机体细胞免疫和体液免疫功能。①无菌检验取样品分别接种于普通肉汽，血液琼脂，肝片肉汤培养24、48、72小时后均无菌生长者为合格。②安全检验取体重为1.5公斤健康蛋鸡6只，每只鸡肌肉注射淋巴因子4ml观察4天。鸡只食欲、饮水、精神、体重、产蛋、均无异常反应者为合格。③抗原性检验取体重为2kg健康家兔4只，静注1ml复合淋巴因子，以后每隔1周皮下注射复合淋巴因子2ml，最后注射1周后分别采血、分离血清。作琼脂扩散试验，在其淋巴因子与血清之间未发现沉淀线者证明淋巴因子无抗原性。④热原试验按《生物制品规程》进行，试验免于注射淋巴因子前后体温变化均在规定范围内，表明无热原。⑤活力测定玫瑰花环试验检测免疫活性细胞即t细胞百分率。依检查玫瑰花环增加率不低于15％。具体方法如下取淋巴细胞0.1ml加Hank’s液0.1ml作对照管，另取淋巴细胞0.1ml加复合淋巴因子0.1ml，将以上两管同时置37℃温育1小时，取出后分别加1％绵羊红细胞液0.1ml，加小牛血清0.05ml。于37℃温育5min，低速离心5min，置4℃冰箱过液。次日取出，吸弃上清液，取沉淀物加姬姆萨染色液0.1ml混匀，置室温下20min，滴片检查，于高倍显微镜下计算200个淋巴细胞，每个淋巴细胞结合3个以上绵羊红细胞者为一个玫瑰花环。一般要求玫瑰花环率增加不低于15％。⑥机体残留试验本品为正常生物器官提取物，在体内无残毒。2.6.2物理性状检验①pH复合淋巴因子呈淡黄色透明液体pH:6.8～7。②蛋白定性检测采用25％磺基水阳酸沉淀法，不出现沉淀或混浊反应，表明其不含大分子蛋白质。③氨基酸含量采用氨基酸分析仪检测含18种氨基酸，结果见表1。④核苷酸类物质检测采用紫外光吸光谱分析，紫外分光光度计在波长233～236nm呈现低峰，在251～254nm处显现高峰至300nm开始随着波长的增加光密度接近于零。E260/E280比值为2.23。根据紫外吸光特点，表明含一定量核苷酸类物质。表1复合淋巴因子中氨基酸含量测定结果⑤金属元素检测根据GB12369-90法检测含有定量的锌、镁、钾、钠、钙、磷等金属，结果见表2。⑥维生素含量测定根据GB6159-86法检测含有维生素，结果见表2。2.6.3复合淋巴因子保存复合淋巴因子注射液在-20℃～10℃低温下保存6个月，性质稳定，氨基酸等物含量不变。2.7本产品整个生产过程中无臭、无废液、无废气、无三废的有害物质，不污染空气及环境。表2复合淋巴因子中金属元素及维生素含量测定结果复合淋巴因子的在动物疫病治疗中的应用复合淋巴因子在实验条件下对人工感染鸡传染性喉气管炎有一定的预防治疗作用，各组攻毒后的死亡率不同，攻毒对照组死亡率最高，为60％(12/20)。预防治疗组、同时治疗组和发病治疗组分别为23.3(7/30)、23.3(7/30)和33.3％(10/30)。表明用药可减少病鸡的死亡率；能明显降低病鸡的死亡率和发病率。临床治疗鸡喉气管炎94000多羽，治愈率85％～100％。用复合淋巴因子治疗禽流感病鸡68800羽，其治愈率达90％～95％。复合淋巴因子还可与相应疾病病原的高免血清共同使用，如复合淋巴因子与鸡新城疫高免血清同时使用治疗鸡新城疫，就取得很好的疗效。实验1复合淋巴因子对传染性喉气管炎的临床治疗试验复合淋巴因子治疗鸡传染性喉气管炎的理论依据如下在《禽病学》中(B.W.卡尔尼克主编，高福，等译，禽病学(第九版)，北京北京农业大学出版社，1991。)有以下论述鸡对喉管炎病毒(LTV)的抵抗力以细胞介导免疫应答为主。因此切除法氏囊或用环磷酰胺处理的鸡，虽然不能产生体液免疫应签，但在喉气管炎免疫后能产生完全免疫力。Feheg等证实，把免疫的脾细胞转移到近交系的鸡体内，可使其产生对喉气管炎抵抗力。复合淋巴因子，治疗LTV引起的传染性喉气管炎，疗效快，剂量小，无毒，无副作用；又由于是多种淋巴因子进入体内达到相互协同，互相促进，提高机体的免疫力，促使T淋巴细胞释放更多的淋巴因子，捕杀LTV粒子，达到其理想的治疗效果。1受试复合淋巴因子本发明人按照以上方法，并经过检测合格的复合淋巴因子。2治疗对象2.1自然感染喉气管炎鸡群。2.2人工感染将确证为传染性喉气管炎病鸡的喉头与气管分泌物接种于成鸡的气管内每只0.5ml，共计6只。2～5天后发病。其症状表现为典型的传染性喉气管炎。3症状和剖检患病鸡症状依鸡的龄期，感染病毒的毒力强弱的不同呈现显著的差异。急性感染的特征性症状，病鸡精神萎顿，鸡冠发紫，呼吸困难，向前向上伸颈张口呼吸，流涕，气管罗音，咳嗽，喘气有时咳出带血的粘液。温和型的症状，为眼流泪，结膜炎，眶下窦肿胀。剖检病变多集中在喉部和气管，早期病变为粘液性炎症，后期为粘膜变性，坏死，出血，气管腔内有血凝块和黄色纤维蛋白性干酷样物。炎症有的可蔓延到支气管、气囊、肺等部分。4病原分离将病鸡的喉头与气管分泌物经青链霉素处理后捣碎，冻溶多次，离心取上清液，接种于10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，经37℃孵育，3天后，可引起绒毛膜水肿、增厚，可见上皮痘斑。细胞内出现嗜酸性核内包涵体。确诊为患传染性喉气管炎(ILT)。5治疗方法每只鸡肌肉或皮下注射2ml/kg，复合淋巴因子连用2次，同时注射细菌消炎药恩诺沙星1ml/kg和0.2ml/kg氯化铵饮水。6疗效判定标准痊愈治疗3～4天后体温、呼吸、精神正常，食欲3～4天恢复正常，产蛋慢慢开始上升趋势；无效治疗3～4天后，呼吸仍然困难，咳嗽，咳出带血的粘液脸水肿，结膜炎、精神、食欲无明显好转或因窒息死亡。7治疗效果治疗鸡喉气管炎94000多羽，治愈率85％～100％。详见表3。表3复合淋巴因子对鸡传染性喉气管炎的临床治疗效果<tablesid="table3"num="003"><table>鸡品种治疗鸡数(羽)治愈率(％)京白1090085％～98.3％罗斯92095％～100％艾维茵60099％罗曼蛋鸡7360085％～95％罗曼青年鸡800090％总计9402085％～100％</table></tables>实验2复合淋巴因子对鸡传染性喉气管炎的治疗试验1试验材料和方法1.1供试品复合淋巴因子为本发明人1999.10.15生产，结冻保存，共20瓶，每瓶200ml。使用前一天放2～8℃自然化冻，每只鸡肌肉注射2ml，连续7天。按每只鸡2ml加入饮水中使用，连续7天。1.2试验动物及分组6周龄SPF鸡(公、母混合)130只，随机分成5组。表4鸡传染性喉气管炎的治疗试验<tablesid="table4"num="004"><table>组别鸡数(只)试验处理健康对照20单独隔离饲养，不攻毒，不用药治疗。攻毒对照20攻毒，不用药治疗。预防治疗组30用药3天后攻毒，连续用药7天。同时治疗组30攻毒同时用药，连续用药7天。发病治疗组30攻毒2天后(发病)用药，连续用药7天。</table></tables>1.3攻毒病毒株为新制备的鸡传染性喉气管炎强毒北京株(中国兽药监察所保存)，使用时用灭菌生理盐水制成乳剂(1∶5)，离心后最终稀释100倍，每只鸡气管注射0.5ml，观察2周。1.4结果处理攻毒前对每只鸡进行称体重、编号。攻毒后每天观察记录鸡的状况，分死亡，发病和未发病(或恢复)，死亡鸡每只解剖观察喉头气管及其它方面变化，判定是否为特异性感染。将三个治疗组与攻毒组结果进行比较，并用卡方(X2)检验治疗组和攻毒对照组之间的差异是否显著。试验结束时对所有存活鸡进行称重，计算出每只鸡的增重情况。经方差分析和多重比较，将试验组与健康对照组(单独隔离饲养)和攻毒对照组进行比较，分析其差异否显著。2试验结果试验结果见表5。表5各组鸡攻毒、用药后发病、死亡情况结果表明1．各组攻毒后的死亡率不同，攻毒对照组死亡率最高，为60％(12/20)。预防治疗组、同时治疗组和发病治疗组分别为23.3(7/30)、23.3(7/30)和33.3％(10/30)。表明用药可减少病鸡的死亡率。经检验，预防治疗组和同时治疗组与攻毒对照比差异极显著，而发病治疗组与攻毒对照组之间差异不显著。2．各组攻毒后的死亡时间不同，攻毒对照组死亡时间在攻毒后的5～13天，高峰在9～13天，发病治疗组死亡时间在攻毒后的6～10天，集中在8～10天。其余两组死亡高峰不明显，死亡率也明显低于攻毒对照组。3．攻毒后各组的发病情况不同，发病高峰在5～10天，但预防治疗组较其余组发病高峰推迟1～2天。攻毒对照组发病率最高，维持时间最长。4．各组存活平均体重增重的顺序是健康对照组(258g)＞同时治疗组(112g)＞预防治疗组(74g)＞发病治疗组(67g)＞攻毒对照组(43g)，表明用药治疗可减少因疾病造成的体重损失。经方差分析，健康对照组(隔离饲养)与其余四组比，差异板显著，说明与饲养的环境，攻毒、用药、观察等造成的应激有关。同时治疗组与攻毒对照组比，差异显著，其余各组之间差异不显著。另外攻毒对照组2只发病鸡和发病治疗组3只发病鸡体重不但没有增加，反而因发病消耗而降低。3小结复合淋巴因子在实验条件下对人工感染鸡传染性喉气管炎有一定的预防治疗作用，能明显降低病鸡的死亡率和发病率。建议在临床上应用时，应早诊断、早用药、直至治愈。同时，发病后要加强环境卫生管理，严格消毒，防止再感染和继发感染。实验3复合淋巴因子对禽流感的治疗试验1受试复合淋巴因子本发明人制备。2治疗对象自然发病鸡群，经流行病学，临床症状，剖检变化综合诊断为禽流感。2.1流行特点发病率高，传染快，产蛋急剧下降，死亡率在5％左右，本病潜伏期1～5天，病程7～20天，开始产蛋鸡发病率几乎90％以上，青年鸡80～140日龄鸡大批发病，死亡率较产蛋鸡高。2.2临床症状发病初期，脸肿、流泪、呼吸道症状明显，呼吸时有湿性罗音、甩头，整个鸡群采食量下降，饮水量增加，鸡拉黄绿色稀粪，鸡冠发紫，“倒冠”(即鸡冠倒向一侧)病鸡精神沉郁。开始产软蛋、褪色蛋、破蛋，然后产蛋急剧下降，1周之内可以从90％降至20％有的鸡群几乎绝产。有的鸡群发病较轻，产蛋下降幅度小，死亡率也较低。2.3剖检变化病死鸡体况良好，鸡冠发紫，口腔内有粘液，腺胃乳头出血(全部乳头出血，颜色鲜红)卵泡变形、出血、破裂、腹腔内被碎卵泡污染。输卵管出血，内有黄色、乳白色胶冻分泌物或干酪样物质，子宫出血、肛门出血；心冠脂肪点状出血、胰脏出血、肝肿出血、肾脏出血。根据以上临床症状，流行病学，剖检变化确诊为禽流感，为本试验的治疗对象。3治疗方法每只病鸡体重1kg肌肉注射2ml复合淋巴因子，连用2次，重症者3次。为防止细菌感染同时分别肌肉注射2.5％恩诺沙星1ml。4疗效判定标准痊愈重症鸡注射淋巴因子后48小时控制死亡。鸡冠由紫色变红，开始采食和饮水，96小时精神、采食、饮水正常。无效注射淋巴因子48小时后，仍然不能控制死亡，不吃不喝。5治疗效果用复合淋巴因子治疗禽流感病鸡68800羽，其治愈率达90％～95％。权利要求1一种用于禽类疫病预防治疗类生物制品，其特征在于是此生物制品是取由健康鸡体免疫组织器官提取的复合型淋巴因子的生物活性物质，该制品给禽使用后能激活体内淋巴细胞提高机体细胞免疫功能；该制品含有氨基酸、维生素和微量元素，核苷酸等。此种复合型淋巴因子制品用于鸡传染性疫病预防治疗有效。2权利要求1所述禽类疫病预防治疗类生物制品的生产方法，其特征是取健康鸡体免疫组织器官，脾脏、胸腺、淋巴结、法氏囊，经过洗净、抽提、捣碎破细胞、冻融、高速离心、透析、过滤除菌、再经检验合格后、分装成制品，-20℃冻存。全文摘要本发明涉及一种由鸡体免疫组织器官中提取的本发明人称其为复合型淋巴因子的生物活性物质及其生产方法,该复合淋巴因子给禽使用后能激活体内淋巴细胞提高机体细胞免疫功能;该因子含有氨基酸、维生素和微量元素,核苷酸等。此种复合型淋巴因子用于鸡传染性疫病预防治疗有效。文档编号A61P43/00GK1299681SQ00136729公开日2001年6月20日申请日期2000年12月27日优先权日2000年12月27日发明者李决申请人:李决