抗体作疫苗的新用途的制作方法

专利名称：抗体作疫苗的新用途的制作方法
技术领域：
本发明描述了可与抗肿瘤相关抗原的抗体结合的并且可在特殊配体上经免疫亲和纯化法从含抗体的个体体液回收的抗体在生产用于个体、自身预防或治疗接种的抗癌组合物的用途。免疫亲和纯化法所用的配体是可抗一种或多种肿瘤相关抗原的抗体或其衍生物。而且，本发明涉及含有由免疫亲和纯化法获得的抗体或该抗体体外脉冲的树突状细胞的药物组合物。
人的获得性免疫系统由两大部分组成即体液免疫和细胞免疫。获得性免疫应答基于B和T淋巴细胞的克隆选择，并且原则上可识别任何抗原和形成免疫记忆。在接种时，可以充分利用获得性免疫系统的这些特点。
每个B细胞都能够产生具有一定结合特异性的抗体。这种抗体也作为特殊受体存在于可生产抗体的B细胞膜上。针对被识别为外来抗原的体液免疫应答是基于可产生能够结合各个抗原表位的抗体的B细胞的选择性激活。在B细胞的分化过程中，DNA重排对抗体的多样性起决定性作用。
在人血清中存在大量各种各样特异性、同种型和亚类的抗体。血清中所有免疫球蛋白的总浓度为15到20mg/ml；即大约100g具有各种各样特异性的免疫球蛋白一直循环在血液中。显示出所有不同特异性抗体的精确含量是不可能的。所有组成成分理论上可能是1011左右。一般地，某些抗体可以结合相类似的不同抗原，尽管这些抗原具有不同的亲和性和抗体亲抗原性。
在这些不同特异性的分布和重要性方面，免疫系统必须通过内源性调节机制保持内环境的稳定。主要的机理是25年前由Niels Jerne假设的“独特型网络”(Jerne，Ann.Immunol.(《免疫学年报》)125C(1974)，373-389)存在抗独特型抗体，它可针对各种决定抗体结合特异性的抗体的独特型，因此能够在抗原识别有意义的范围内与第一种抗体的独特型结合。Jerne提出淋巴细胞上独特型特异的受体间的相互作用决定了免疫系统的调节。因为在免疫应答过程中已经显示出也形成了针对主要由免疫应答所诱发的抗体的抗独特型抗体，所以确实明显发生了这些相互作用。由于存在抗每个抗体的抗独特型抗体，所以在抗体的独特型方面，淋巴细胞基本上不耐受。
在免疫学意义中，一些抗独特型抗体可以表示抗原的“内部图像”。所以这类抗体可作为标称抗原替代物用来免疫接种，因为免疫接种所诱发的抗体可以与标称抗原部分结合。在很长一段时间内，都在使用这种方法，尤其是在癌症免疫疗法中。10多年来，有许多有关接种单克隆抗独特型抗体来诱发针对肿瘤相关抗原的免疫应答的临床前和临床计划(摘要参见Bhattacharya-Chatterjee，Foon；癌症的抗独特型抗体疫苗的疗法；Cancer Treat.Res.(《癌症治疗研究》)94(1998)，51-68)。这些单克隆抗独特型抗体大多数是鼠源性的。但是也有人单克隆抗独特型抗体的试验(例如，Fagerberg等，PNAS 92(1995)，4773-4777)。
对患有B细胞淋巴瘤的患者尝试治疗性免疫接种是一种特殊情况。在这类疾病中，可产生具有独特型特征的特异性免疫球蛋白的并且在其细胞膜上也携带着该免疫球蛋白作为受体的某些B细胞克隆是退化的。这种抗体是单克隆并对个体B细胞淋巴瘤来说可以当作肿瘤特异性抗原。当这种患者特异性自身抗体在细胞培养基中产生并作为疫苗以适当免疫原形式接种时，它已经显示出可以诱发抗该抗体独特型的免疫应答，该免疫应答能够对B细胞淋巴瘤具有影响(Reichardt等，Blood.(《血液》)93(1999)，2411-2419)。
总之，可以说●可模仿肿瘤相关抗原的人单克隆抗独特型抗体，作为疫苗能够诱发癌症患者的免疫应答，该免疫应答可能针对该肿瘤的伴生抗原。借助杂交瘤技术或人B细胞的无限增殖，这种人单克隆抗体已经从在被动免疫疗法中给予(大多数鼠源性)抗肿瘤抗体的并已经建立了相应免疫应答的患者中获得。其他患者可以用该方式所产生的人单克隆抗独特型抗体免疫接种。●由B细胞淋巴瘤所产生的并因此有特定独特型的人抗体，作为个体疫苗，能够以患者特异性方式诱发免疫应答，该免疫应答可能针对B细胞淋巴瘤。这种患者特异性抗体必须借助杂交瘤技术或B细胞淋巴瘤细胞的无限增殖分别获得。该抗体的用途自然局限于B细胞淋巴瘤的治疗。
所以，尽管已经公知某些物种的单克隆抗独特型抗体也能够用于免疫接种产生抗体的相同物种的个体，但在任何情况都必需要操作和培养细胞。所以，这种方法耗费时间并只能局限于单克隆抗体。
因此，显然需要能提供可有效和广泛适用任选肿瘤的个体疗法以及预防癌症的装置和方法。
所以，作为本发明基础的技术问题是提供有效的装置和方法，它们可以在不同种肿瘤的构架内分别用于治疗癌症和预防癌症。
该技术问题已经由在权利要求中所提供的特征的实施方案所解决。
所以，本发明涉及抗体在生产适合治疗性或预防性接种的抗癌疫苗的组合物的用途，其特征在于该抗体可以用免疫亲和纯化法从含有抗体的体液中回收，其中可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
与现有技术中所描述的方法相比，本发明的用途具有的优点是不用细胞培养基生产抗独特型抗体，这使得本发明的构思可能被广泛而有效地使用并不局限于单克隆抗体。
在每个人的血液中，例如以很大总量存在的抗体库包括各种可能的结合特异性抗体。这样，该抗体库基本上也包括抗例如(已知的或也是新的)针对任意肿瘤相关抗原(TAA)的鼠源性单克隆抗体(Ab1)独特型的抗体(Ab2)。按照免疫网络，每个人的相同抗体库也包括一定量的针对自身Ab2的独特型的抗体，称之为Ab3抗体。按照网络理论，Ab3能够结合外源Ab1所限定的肿瘤相关抗原。利于Ab3的Ab2/Ab3平衡移动一定会导致免疫系统能够更好地识别和攻击携带该抗原的肿瘤细胞。
现在本发明的基础为这种免疫平衡的移动是通过以免疫接种疫苗形式给予个体自身Ab2部分实现的。就这种自身免疫接种疫苗来说，能够选择性地刺激那些可产生Ab3的B细胞。对这种免疫接种疫苗来说，只需要按照公知方法使用适当的疫苗佐剂进行配制的少量的Ab2部分。
所以本发明所用的抗体是来自含有抗体的体液并且针对免疫亲和纯化法所用的抗-TAA抗体的Ab2抗体。含有抗体的体液是例如血液、血浆、血清、淋巴液、恶性渗出液等。体液优选血清。体液可以源于具有包含抗体的体液的任意动物。优选有脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选是人的体液。
因为接种自身抗体所诱发的免疫应答是由这些抗体的结合区即它们的独特型所决定的，只要这些抗体片段或衍生物仍包括各个起始抗体的独特型，这些抗体的片段或衍生物基本上也能够用来替代完整的抗体部分成功地接种。这样，术语“抗体”也含有具有相同结合特异性的这类抗体的片段或衍生物。例如，不作为限定，下列所提到的例如按照本身已知的生物化学方法(例如经酶裂解)所产生的F(ab)’2片段和F(ab)’片段。术语“衍生物”包含例如按照本身已知的化学或生物化学方法所产生的抗体衍生物，例如为了增加亲脂性以掺入到脂质体中而在游离氨基功能团上用脂肪酸酰胺化的抗体。特别是，术语“衍生物”还包括用化学方法将抗体或抗体片段与可提高免疫应答的分子偶合所生成的产物，其中的分子例如是破伤风类毒素、假单胞杆菌属外毒素、脂质A的衍生物、GM-CSF、IL-2，或者用化学方法将抗体或抗体片段与可提高免疫应答的多肽如GM-CSF、IL-2、IL-12、C3d等偶合所生成的产物。借助免疫亲和纯化法将抗体从例如来自人血清的含有抗体的体液中纯化可以使用本领域熟练技术人员公知的方法进行(Clin.Chem.(临床化学)4591999)，593；J.Chem.Technol.Biotechnol.(化学技术生物技术杂志)48(1990)，105)。将TAA-特异性抗体或该抗体的混合物固定于固相中。该固相是能够让抗体与其结合而在结合特性上几乎没有损失的膜、凝胶或类似物。Ab2可以分批或以流通方法结合到固定的抗体。免疫亲和纯化可以在色谱层析装置上自动进行或借助人工方法进行。但也可以想到借助含有固化抗体的简单装置人工、自动或半自动进行。在实施例1中所述的免疫亲和色谱层析中，一般每毫升所用血清能够获得3到10μg免疫球蛋白。一般，用这种方法所获得的抗体部分由IgM和IgG组成。所以，从采血可接受的量例如50ml生成的25ml左右的血清中可能获得大约0.08到0.25mg的Ab2。该量基本上满足接种。如果希望大量回收Ab2，可以将本身已知的技术如血浆除去法与免疫亲和纯化法结合使用。如果使用好几种具有不同特异性的抗体，可以同时使用这些固定的抗体或平行或连续进行各免疫亲和纯化。
在本发明的构架内，术语“肿瘤相关抗原”是优选用肿瘤细胞表现出的结构和可能从非恶性组织中将其分化出的结构。优选这种肿瘤相关抗原位于肿瘤细胞的细胞膜上或膜内。但是，没有规定这种抗原也存在于非退化细胞上。例如肿瘤相关抗原可以是多肽，尤其是糖基化的蛋白或多肽的糖基化部分。可以表示肿瘤相关抗原的其他结构例如是糖脂。这些包括例如神经节苷脂如GM2。而且，通过改变癌症细胞特征的细胞膜的脂质组份也能够表示肿瘤相关抗原。
抗不同肿瘤相关抗原的各种各样的抗体早已为人所知或能够用公知方法生产(例如杂交瘤技术、噬菌体展示技术)。
在优选的实施方案中，将由免疫亲和纯化法所获得的抗体以自身个体疫苗的意义给予其体液被回收的个体接种。
所以，本发明另外一种完整组成是用免疫亲和纯化体液中存在的抗体来实现从个体体液如血液中的回收Ab2部分。一种或多种抗肿瘤相关抗原的抗体/抗体类可以用作配体。
在本文中，个体可以是任意动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，最优选人。
在另外优选的实施方案中，免疫亲和纯化可以同时使用好几种针对各种肿瘤相关抗原和/或抗一种或多种肿瘤相关抗原的各种表位的抗体。如果好几种特别是抗不同肿瘤相关抗原或抗不同表位的单克隆抗体同时用于免疫亲和纯化存在于体液的Ab2，可以获得由不同Ab2组成的部分，它基于所选的一套肿瘤相关抗原和它同时作为疫苗起动抗所有这些肿瘤相关抗原或表位的免疫应答的用途。因此，在向识别一套(经常共同表达)肿瘤相关抗原或表位的一步中移动免疫平衡。这类步骤自然增加了所诱发的免疫应答的作用并基本减少了肿瘤抗原阴性变体的形成(“肿瘤逃逸”)，因为肿瘤细胞极不可能同时中止好几种抗原的表达。
上述方法基本上是基于所有已知的或最新发现的肿瘤相关抗原。唯一的前提是可得到能用作免疫亲和纯化配体的针对这类抗原的一种或多种抗体，优选单克隆抗体。基本上所有可能类型的抗体特别是多克隆或单克隆抗体都是适合的，优选单克隆抗体。也能够使用多克隆和单克隆抗体的混合物。并且，例如鼠源性单克隆抗体和来自其他物种(例如大鼠)的抗体都是能够使用的。而且，抗肿瘤相关抗原的鼠-人嵌合、人源化的或人单克隆抗体也能够使用。用于免疫亲和纯化法的抗体性能是由它们的结合区即它们的独特型决定的。这样，只要这些抗体片段仍保持各起始抗体的独特型，这些抗体的片段基本上也能够替代完整的抗体用于成功的免疫亲和纯化。例如，但不限定为，包括按照本身已知的生物化学方法(酶裂解法)或按照本身已知的分子生物学方法生产的F(ab)’2片段、F(ab)’片段和Fv片段。实际上，也可以使用各种抗体或片段的混合物。
肿瘤相关抗原的选择和针对这些抗原的用于免疫亲和纯化法的抗体的选择取决于将进行接种抗这些肿瘤适应证的抗原特征。
下列已知的和经常在各种尤其是表皮肿瘤上表达的肿瘤相关抗原进行了举例性列举。本文所述的自身接种的方法的使用也决不局限于这些抗原上皮细胞粘合分子(Ep-CAM)癌胚抗原(CEA)路易斯Y碳水化合物唾液酸Tn碳水化合物球H碳水化合物神经节苷酯如GD2/GD3/GM2前列腺特异性抗原(PSA)CA 125CA 19-9CA 15-3TAG-72EGF受体神经细胞粘合分子(N-CAM)Her2/Neu受体D 97CD 20CD 21现已描述了抗上述所有抗原(大多数数个)尤其是单克隆抗体基本上适合用作前述免疫亲和纯化法回收Ab2的配体。而且在例如DeVita等也描述了肿瘤相关抗原(Eds.，“癌症的生物疗法”，第二版，第3章肿瘤抗原的生物学，Lippincott公司，ISBN 0-397-5144116-6(1995))。
在优选的实施方案中，肿瘤相关抗原是一种在上皮源性癌细胞上、神经内分泌源性癌细胞或血液形成系统的癌细胞上可经常被表达或共同表达的位于膜上的分子。
在另外优选的实施方案中，按照本发明所生产的组合物适合于该组合物所含抗体的多次给药。本文所述的从个体体液中回收自身疫苗的方法自然不是只局限于一次单一使用。
重复这些步骤，例如在用免疫亲和纯化法回收第一次自身疫苗后几周，再取体液如血液和制备新的自身疫苗并给药，能够促进用第一次接种所触发的免疫性所有组成部分向有效抗肿瘤的方向移动。在这种方法中，确保了经常考虑个体疫苗中免疫平衡的相应状况。这种方法可以在适当的间隔内(例如开始每隔4到8周，然后隔6个月)反复进行。
本文所述的用于接种自身抗体的新组合物和方法基本上适合于治疗和预防两种目的。对癌症患者反复的治疗性接种能够抑制新转移瘤的形成并且至少能够减缓该疾病的播散。治疗性自身接种尤其可用于下列疾病阶段疾病的早期阶段，例如原发肿瘤的成功手术后(辅助阶段)，本文所述的自身接种可破坏剩余的播散的肿瘤细胞并防止形成新的转移瘤。所以，这类患者不复发的时间和总生存时间被延长了。任选地，在适当间隔借助这种自身接种和所给予的加强免疫注射可能会终生保护避免转移瘤的形成。
如果转移瘤已经形成，使用本文所述的组合物或自身接种可控制转移瘤的进一步扩散和形成。疾病状况就会得到稳定，从而生活质量得到维持且寿命得以延长。
本文所述的自身接种方法也能够用于为了诊断或治疗在之前已经给予抗肿瘤相关抗原的单克隆抗体的患者和抗这些抗原已经形成免疫应答的患者。所以，在将该抗体用作配体的免疫亲和纯化法中，以大于非治疗性个体时的量获得针对(Ab2)的抗体。用这些Ab2接种会促进内部可能已经产生的Ab3的形成。许多年前就已经有人假设并分析了用针对肿瘤相关抗原(Ab1)的鼠源性抗体的被动免疫疗法，经静脉对癌症患者给药，经Ab2的诱导来内部诱导具有潜在抗肿瘤特性的Ab3(例如，Koprowski等，PNAS 81(1984)，216-19)。
本文所述的组合物和自身接种基本上也作为预防剂，能够用于增加健康个体对癌症疾病的预防。这种方法对高风险组(这些包括例如有形成某些癌症遗传倾向的个体，这些遗传倾向可以用相应的试验不断地测定出来)尤其有益。
由于相应疫苗优选是从个体体液例如血清中产生的，在独特型网络方面会考虑每一个体的免疫状况，这一事实是本文所述个体自身接种方法的主要优点。
而且，结果，免疫过的个体不能与外来抗原接触，而只能以可影响免疫平衡调节的适当形式用内源性组份治疗。
在按照本发明的优选实施方案中，由免疫亲和纯化法所获得的抗体可与适当的疫苗佐剂一起配制成制剂。
按照疫苗的常例，自身抗体部分或其片段和衍生物与疫苗佐剂一起制备成制剂。这类佐剂可促进免疫应答。这类佐剂的例子包括，但不限定为含铝佐剂，尤其是氢氧化铝(例如Alu-gel)、脂多糖的衍生物、卡介苗(BCG)、QS-21、脂质体制剂、含有免疫系统已经形成强烈的免疫应答抗另外抗原的制剂，如任选在脂质体制剂中的破伤风类毒素或流感病毒组份。
为了提高免疫应答，疫苗制剂也可以与相应的优选可维持免疫应答形成的人的细胞因子一起给药。具体来说，但不仅仅是，要提到的粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)。这种细胞因子通过激活抗原处理的细胞(例如树突状细胞)刺激有效的免疫应答。
任选通过使用本身已知的和已经公开的方法，也能够用在体外培养的自身树突状细胞温育自身抗体部分。随后将用这种方法脉冲的树突状细胞给予各个个体。用这种方法可能会形成特别有效的免疫应答。
在按照本发明用途的优选实施方案中，将组合物中所含的抗体与佐剂混合，然后将其加热处理，优选在70到121℃的温度范围内。所用的佐剂优选是含铝佐剂。尽管这种加热处理使蛋白抗原变性，但是由于结合了佐剂蛋白的免疫原性部分也可能以正确形式存在于免疫系统中。为了达到加热处理的优点，不是绝对需要使蛋白变性。大家都知道蛋白的热变性不仅依赖于温度，而且还依赖于蛋白经受该温度的时间。而且，还有其他生化参数如离子强度、离子组成、pH值、混合物中活性表面的种类和含量，都会引起蛋白变性。可能有抗体不变性或不完全变性的条件和/或使用对佐剂表面上有其他影响例如较少脱附的条件。
用佐剂和随后热处理产生疫苗制剂的方法的另外优点是在整个制剂中感染性病原体可能会变弱或失活。这种优点对疫苗制剂的生产、储藏和发送是非常重要的。所以，就已知和未知的传染性疾病病原体而言，就有较好的安全性。而且，因为疫苗的微生物保藏已经通过加热进行了，所以如果使用相应的包装时，可以将其罐装而不加防腐剂。
这种制剂的其他优点是当加热到至少使部分抗体变性时，潜在地增加了抗体的免疫原性。抗原性的提高也就增加了免疫原性，尤其在该蛋白被识别为机体的自身蛋白时。
其他优点是通过加热失活又潜在地稳定了抗体佐剂络合物，即蛋白抗原的脱附不会象在没有加热处理的抗原佐剂制剂中的那样快。这一优点也能允许自身免疫接种之间有较大间隔。
按照本发明所生产的组合物可以按照公知方法例如作为疫苗经皮下或肌肉内注射给药。
而且，本发明涉及含有用免疫亲和纯化法从含有抗体体液中回收的抗体的药物组合物，其中将可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
正如上文所述的，这种组合物适合作为抗癌的治疗性或预防性接种的疫苗。
就药物组合物的制备、组份、制剂、给药类型等方面的优选实施方案而言，相同部分使用早已在本发明用途方面作了解释。
最后但一样重要的是，本发明也涉及含有从体外已经培养的个体的分离出的树突状细胞的药物组合物，其中该树突状细胞已经用免疫亲和纯化法从含有抗体的相同个体的体液中回收的抗体体内温育。
另外，本发明也涉及抗癌的治疗性或预防性接种的方法，其中将用免疫亲和纯化法从含有抗体的体液，优选从相同个体的体液中获得的抗体对个体给药，其中将可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
而且，本发明还涉及抗癌的治疗性或预防性的接种的方法，其中将已经体外培养的在试管内之前用免疫亲和纯化法从含有抗体的体液中回收的抗体温育过的自身的、分离出的树突状细胞对个体给药，其中将可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
与本发明用途中早已解释过的相同之处用于该优选的实施方案。
本发明也涉及生产抗体制剂的方法，其特征在于用免疫亲和纯化法从含有抗体的体液中回收抗体，其中将可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
与本发明用途中早已解释过的相同之处用于体液、用作配体的抗体以及肿瘤相关抗原。
免疫亲和纯化法可以按照本领域普通技术人员已知的方法进行。在这种情况，也使用本发明用途中早已提过的相同之处。
在本发明方法的优选实施方案中，同时将针对不同肿瘤相关抗原和/或这些抗原表位的好几种抗体用于亲和纯化。在将好几种抗体用于亲和纯化的方法中，可以同时使用它们，或者可以分别平行或系列进行免疫亲和纯化，即按照要求结合不同表位和/或抗原的特异性。这些要求起因于不同个体肿瘤上不同抗原的表达。
在特别优选的实施方案中，单克隆抗体在免疫亲和纯化法中作配体而在更特别优选的实施方案中用血清作体液。
本发明的方法优选是用于生产适用于抗癌的治疗性或预防性接种的药物组合物的抗体制剂的制备方法。
进一步，本发明涉及药物组合物的制备方法，其中实施前述的本发明制备抗体制剂的方法并且随后将这种方法所得到的抗体制剂与可药用载体和/或适当的疫苗佐剂配制成制剂。
在优选实施方案中，将抗体制剂与佐剂优选与含铝的佐剂混合，然后将其加热处理，优选在70到121℃的温度范围内。
在本发明用途中早已提到的相同之处用于这种药用或疫苗制剂的优选实施方案中。
在本申请中所引用的所有专利、公开出版物或数据库公开的内容全部被引用到本申请说明书的内容中作参考。


图1显示了来自猕猴血清的抗体部分的免疫亲和纯化的层析谱(用固定化抗体17-1A)。
图2显示了用免疫亲和纯化法纯化的抗体部分的层析谱(尺寸排阻层析法)。
图3显示了用在抗体17-1A17-1A ELISA亲和纯化所获得的血清抗体的结合。
图4显示了猕猴自身接种的结果血清-Ig与KatoIII肿瘤细胞(细胞ELISA)的结合。
图5显示了用免疫亲和纯化法(混床抗-EpCAM/抗-LewisY)纯化的抗体部分的层析谱(尺寸排阻层析法)。
图6显示了尺寸标准的层析谱(用尺寸排阻层析法分离的)。
下列物质是下列用于更加详细地说明本发明而不是将其加以限定的
no.3598)细胞系KATO III人胃癌细胞系(ATCC HTB 103)偶联缓冲液0.1M NaHCO30.5M NaClpH8.0纯化缓冲液APBS def0.2M NaCl纯化缓冲液B0.1M甘氨酸/HCl0.2M NaClpH2.9培养基ARPMI 1640+2g/l NaHCO3100U/ml青霉素G100μg/ml硫酸链霉素4mM谷氨酸10％胎牛血清(加热失活)结合缓冲液15mM Na2CO335mM NaHCO33mM NaN3pH9.6不完全的PBS(def)138mM NaCl1.5mM KH2PO42.7mM KCl6.5mM Na2HPO4pH7.2固定溶液0.1％戊二醛的生理盐水溶液洗涤缓冲液A2％NaCl0.2％Triton X-100不完全的PBS洗涤缓冲液B0.05％Tween 20不完全的PBS封闭缓冲液A5％胎牛血清(加热失活)的不完全PBS封闭缓冲液B1％牛血清白蛋白0.1％NaN3的不完全PBS稀释缓冲液A2％胎牛血清(加热失活)的不完全PBS稀释缓冲液B不完全的PBS染色缓冲液24.3mM柠檬酸51.4mM Na2HPO4pH5.0底物40mg二盐酸邻苯二胺100ml染色缓冲液20μl H2O2(30％)中止溶液4N H2SO4制剂缓冲液10％PBS def，pH＝6.090％生理盐水溶液实施例1含有TAA特异性抗体的免疫亲和柱的制备将7.5g CH-琼脂糖4B(Pharmacia)悬浮于20ml的1mM HCl中15分钟。然后在AG3烧结玻璃滤器上将凝胶先用1升的1mM HCl再用200ml的偶联缓冲液洗涤。在5升的偶联缓冲液中透析100mg的鼠源抗体17-1A(Panorex，贮存液10mg/ml；针对肿瘤相关抗原Ep-CAM)并用偶联缓冲液调至5mg/ml。将该溶液与凝胶悬浮液混合于密封容器中，得到凝胶与缓冲液比为1∶2的适合于偶联的悬浮液。该悬浮液于4℃旋转24小时。然后，用3×30ml偶联缓冲液洗掉多余的配体。于4℃用1M乙醇胺温育1小时从而将所得到的反应基团封闭。然后，将凝胶与0.1M的Tris-HCl缓冲液于室温旋转1小时。最后，凝胶用不同pH值的缓冲液洗涤三轮。每轮由含有0.5M NaCl的pH4的0.1M的醋酸钠缓冲液接着是含有0.5MNaCl的pH8的0.1M Tris-HCl缓冲液组成。凝胶贮存于4℃。
实施例2用免疫亲和色谱层析法从血清中免疫亲和纯化抗体部分从猕猴取外周血液10ml并回收血清。整个步骤都是在无菌条件下进行。
在FPLC系统(Pharmacia)上进行免疫亲和纯化。将1ml按照实施例1所得到的凝胶装填到Pharmacia的HR5/5柱上。用纯化缓冲液A稀释5ml血清至1∶10。该溶液以1ml/分钟注入柱，然后用纯化缓冲液A洗涤直到检测器又达到UV基线(280nm)。用纯化缓冲液B洗脱结合的免疫球蛋白，脱附后马上用1M Na2HPO4中和该组分。图1显示了这种纯化的层析图(UV280nm)。
将50μl用这种方法所纯化的抗体部分在尺寸排阻层析柱(SEC，Zorbax 250 GF)上分析。用220mM pH为7的磷酸缓冲液和10％的乙腈作流动剂。正如从这种分析的层析图(图2)中所看到的，抗体的部分包括大约3∶2的IgM和IgG。抗体部分的总量大约是40μg(与标准物比较用尺寸排阻层析法测定的)。在ELISA中测试这种方法所获得的抗体部分与抗体17-1A(用作亲和纯化法的配体)的结合将100μl等份的针对肿瘤相关抗原的和用作亲和纯化的抗体(抗体17-1A；含10μg/ml的结合缓冲液的溶液)在微量滴定板孔于37℃温育1小时。将该平板用洗涤缓冲液A洗涤6次后，加入200μl的封闭缓冲液并于37℃温育30分钟。洗涤上述平板后，用稀释缓冲液A将被测试的100μl等份的亲和纯化的抗体部分以及作阴性对照的相同浓度的正常人的免疫球蛋白稀释为1∶4到1∶65,000将其于37℃温育1小时。洗涤上述平板后，加入100μl过氧化酶缀和的羊-抗-人-Ig抗体(Zymed)至稀释缓冲液A中的稀释度为1∶1000并于37℃温育30分钟。平板用洗涤缓冲液A洗涤四次并用染色缓冲液洗涤两次。加入100μl特殊底物测定抗体的结合并在3分钟后加入50μl中止溶液使颜色反应停止。在490nm的波长(参考测定的波长为620nm)处测定光密度(OD)，进行评估。
正如从图3中所看到的，亲和纯化的抗体部分已经与抗体17-1A显著结合而正常人免疫球蛋白实际上没有结合。
实施例3含有纯化抗体的疫苗制剂按照下列指示用氢氧化铝作佐剂将亲和纯化获得的抗体部分制备成制剂向3ml亲和层析后得到的抗体溶液(包括大约40μg抗体)中加入1mg氢氧化铝(水溶液；Alhydrogel，Superfos)并在“FILTRON”离心小管(MicrosepTM，截断10KD)将悬浮液以4000×g离心30分钟。接着，将该溶液用1ml制剂缓冲液悬浮两次并在4000×g离心30分钟。用制剂缓冲液补加悬浮液到0.5ml并且将该方法所得到的悬浮液以无菌方式灌封。
实施例4用自身免疫亲和纯化的抗体对猕猴的免疫接种按照实施例2和3所解释的从猕猴血清中获得的疫苗，将其在各猕猴背部皮下接种。在第一次接种前，采血5ml用于血清的回收(用于测定免疫应答特征的起始值)。2周后，再采血10ml用于回收血清。用4ml血清按照上述方法重复自身疫苗的回收。再在猕猴背上皮下注射最新获得的疫苗。接种后4周，再采血5ml用于血清回收(用于测定两次接种的作用)。
在细胞ELISA中分析该猕猴的前血清和第二次接种后4周的免疫血清，观察是否抗体结合在KATO III细胞系上。为了这一目的，进行下列步骤将微量滴定板孔用100μl浓度为2×106细胞/ml于培养基A的KATOIII细胞系的细胞悬浮液于+37℃温育过夜。吸取上清液后，将平板用每孔50μl固定溶液于室温温育5分钟。吸取上清液后，向各孔中加入200μl封闭缓冲液B并将平板于室温温育1小时。用200μl洗涤缓冲液洗涤两次后，将稀释缓冲液B中稀释度为1∶4到1∶56,000的被测试100μl等份猴子血清于37℃温育1小时。用100μl的冰冷洗涤缓冲液B洗涤平板后，加入在稀释缓冲液A中稀释度为1∶1000的100μl过氧化酶缀和的羊-抗-人-Ig抗体(Zymed)并于37℃温育45分钟。将平板用100μl冰冷洗涤缓冲液B洗涤三次。加入100μl特异底物测定抗体的结合并在大约5分钟后通过加入50μl中止溶液使颜色反应停止。在490nm波长(参照测定的波长为620nm)测定光密度(OD)，进行评价。
正如从图4中所看到的，在以自体方式接种过的猕猴免疫血清中含有免疫球蛋白，这些免疫球蛋白能够结合在Kato III肿瘤细胞上，而在相同动物前血清中几乎检测不到这类抗体。
由于上述试验结果，举例显示了在针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体上用免疫亲和纯化法获得的个体自身抗体部分接种能够触发体液免疫应答，它可结合于表达该肿瘤相关抗原的人肿瘤细胞上。
实施例5用两种不同TAA特异性抗体的免疫亲和柱的制备按照标准技术将可与EP-CAM反应的单克隆鼠抗体和可与路易斯Y反应的单克隆鼠抗体都偶合到活化的CH琼脂糖4B(Pharmacia Biotech，瑞典)7.5g CH琼脂糖4B悬浮于20ml的1mM HCl 15分钟并浸泡。在AG3烧结玻璃滤器上将凝胶用1升1mM HCl洗涤，然后用200ml偶联缓冲液洗涤。在5升偶联缓冲液中透析100mg鼠源性抗体(贮存液10mg/ml)并用偶联缓冲液调至5mg/ml。将该溶液与凝胶悬浮液混合于密封容器中，得到凝胶与缓冲液比为1∶2的适合于偶联的悬浮液。该悬浮液于4℃旋转24小时。然后，用3×30ml偶联缓冲液洗掉多余配体。用1M乙醇胺于4℃温育1小时来封闭剩余的反应基团。然后，凝胶与0.1M Tris-HCl缓冲液于室温旋转1小时。最后，用具有不同pH值的缓冲液洗涤三轮。每轮由0.1M含有0.5M NaCl的pH4的醋酸钠缓冲液接着用含有0.5M NaCl的0.1M的Tris-HCl缓冲液组成。凝胶存放于4℃。
将两种相同体积的亲和基质混合并将其填装为免疫亲和层析柱(System Akta，Pharmacia，瑞典)。
实施例6用两种不同TAA特异性抗体同时免疫亲和纯化法从猴子血清中纯化抗体从免疫学上幼稚的猕猴中每次采血20ml左右。9ml的各个血清用实施例5中所述的免疫亲和层析柱(System Akta，Pharmacia，瑞典)纯化。
使用的缓冲液纯化缓冲液A
洗脱缓冲液纯化缓冲液B用0.5M磷酸氢钠溶液中和洗脱液。
用这种方法分级分馏含有高浓度的纯化蛋白的洗脱液将50μl纯化抗体部分在尺寸排阻层析柱(SEC，Zorbax 250GF)上分析。用220mM的pH7的磷酸缓冲液和10％的乙腈作流动剂(流速1.000ml/分钟；波长214nm)。正如从该分析的层析图(图5)中所看到的，抗体部分包括比率为3∶2的IgM(保留时间6.963分钟)和IgG(保留时间8.745分钟)。抗体部分总量大约为50μg(与标准物作对照用SEC所测定的，图6)。
实施例7纯化抗体疫苗的不同制剂于离心分离(Centricon 10；Amicon，美国)用的超滤设备中制备疫苗。为了这一目的，用1mM磷酸钠缓冲液0.86％NaCl pH6.0(NBK)离心分离来洗涤超率设备。然后将1ml缓冲液(NBK)装入该设备并加入37μlAlhydro凝胶2％(Superfos Biosector，丹麦)。
加入实施例6的中和过的洗脱液后，按照Centricon指示进行离心分离和洗涤(用5ml缓冲液)。
然后，将疫苗重悬浮并用缓冲液补至550μl并以无菌方式灌封。
另外，重悬浮后，将疫苗用缓冲液补至545μl并加入5.μl乙基汞硫代水杨酸钠贮存液(10mg/ml，Sigma，美国)。
疫苗制剂的第三种变形是在以无菌方式装入玻璃小瓶后在高压灭菌器中(121℃；20分钟)加热变性。
权利要求
1.抗体生产适合作疫苗治疗性或预防性接种抗癌的药物组合物的用途，其特征在于用免疫亲和纯化法从含有抗体的体液中回收抗体，其中可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
2.按照权利要求1的用途，其中药物组合物是用来给从其体液中获得抗体的个体以自身个体疫苗的意义给药。
3.按照权利要求1或2的用途，其中体液是血清。
4.按照权利要求1到3中任意一项的用途，其中个体是人。
5.按照权利要求1到4中任何一个的用途，其中免疫亲和纯化法中同时使用数个针对不同肿瘤相关抗原和/或抗这些抗原的不同表位的抗体。
6.按照权利要求1到5中任意一项的用途，其中用作免疫亲和纯化法配体的抗体是单克隆抗体。
7.按照权利要求1到6中任意一项的用途，其中重复制备药物组合物并用作为个体疫苗在适当间隔重复连续给药。
8.按照权利要求1到7中任意一项的用途，其中肿瘤相关抗原是在上皮源性癌细胞上或神经内分泌源性癌细胞上或血液形成系统的癌细胞上被经常表达和/或共同表达的位于膜上的分子。
9.按照权利要求1到8任意一项的用途，其中将免疫亲和纯化法纯化的抗体或其衍生物与适当的疫苗佐剂一起配制成制剂。
10.权利要求1到9任意一项的用途，其中该组合物还包括可促进免疫应答并可与抗体同时给药的蛋白。
11.按照权利要求10的用途，其中该蛋白是人蛋白。
12.按照权利要求11的用途，其中人蛋白是粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)。
13.按照权利要求1到12中任何一个的用途，其中该组合物适合于用免疫亲和纯化法纯化的抗体作为疫苗以皮下或肌肉内注射方式给药。
14.按照权利要求1到13中任何一个的用途，其中组合物中所含抗体与佐剂混合并将其加热处理。
15.分离的体外培养的个体树突状细胞生产适合于作为疫苗治疗性或预防性接种抗癌的药物组合物的用途，其中树突状细胞在试管内之前已经与用免疫亲和纯化法从相同个体的含抗体体液中获得的抗体温育，其中可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型的片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
16.一种含有从含抗体体液中用免疫亲和纯化法获得的抗体的药物组合物，其中可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型的片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
17.一种含有分离的体外培养的个体细胞的药物组合物，其中树突状细胞在试管内之前已经与用免疫亲和纯化法从相同个体含抗体体液中获得的抗体温育，其中可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型的片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
18.一种生产抗体制剂的方法，其特征在于抗体是从含有抗体的体液中用免疫亲和纯化法获得的，其中可识别一种或多种肿瘤相关抗原或其具有相同独特型的片段的抗体用作免疫亲和纯化法的配体。
19.按照权利要求18的方法，其中亲和纯化中同时使用数个针对不同肿瘤相关抗原和/或抗这些抗原的表位的抗体。
20.按照权利要求18或19的方法，其中用于亲和纯化的抗体是单克隆抗体。
21.按照权利要求18到20的任何一种方法，其中体液是血清。
22.一种生产药物组合物的方法，其特征在于按照权利要求18到21中任何一种的方法制备抗体制剂，将按照这种方法获得的抗体制剂与可药用载体和/或适当的疫苗佐剂制备成制剂。
23.按照权利要求22的方法，其中将抗体制剂与佐剂混合并将其加热处理。
全文摘要
本发明涉及可与肿瘤相关抗原抗体结合并且可以用特殊配体的免疫亲和纯化法从个体体液中获得的抗体在生产个体、自身、预防或治疗接种的抗癌疫苗的用途。用于免疫亲和纯化的配体是肿瘤相关抗原的抗体或其衍生物。本发明进一步涉及含有免疫亲和纯化法生产的抗体或该抗体体外脉冲的树突状细胞的药物组合物。
文档编号A61P35/00GK1390138SQ00815789
公开日2003年1月8日 申请日期2000年11月15日 优先权日1999年11月16日
发明者H·洛伊博纳, H·艾克特, G·希姆勒 申请人:伊格尼昂癌症治疗研发股份公司