专利名称：用于治疗动脉血流衰竭所致组织损伤的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及人用药品，具体地说涉及包括表皮生长因子(EGF)和生长激素促分泌素六肽(GHRP)的药物组合物。该药物组合物可预防因血流供应不足所致地组织损伤，并可促进缺血性损伤后组织的修复。
当出现部分或完全动脉血流供应不足时，或者在静脉回流不畅时，动物体内的所有器官均容易发生致命的不可逆转性组织损伤。在这些情况中，细胞死亡是病理生理学变化进行性级联反应的结果，它最终会威胁多种器官的机能和个体的生命。
过量的ROS产生是与组织低灌注、局部缺血/再灌注、和炎症(腹膜炎、胰腺炎等)等种种过程有关的主要病理结果。组织低灌注和ROS过度生成也与大手术、血管再生成术、广泛性烧伤和多发性创伤有关。ROS导致的膜脂质过氧化可在许多病理状态下引起细胞死亡(T.D.Lucas和I.L.Szweda.心脏再灌注损伤老化、脂质过氧化作用和线粒体功能障碍。ProcNatl Acad Sci USA 1998，95(2)510-514)。
细胞中的ATP存储不足，是局部缺血的最急性和最具威胁的后果(Burns TA，Davies RD，McLaren JA，CerundoloL，Morris JP，FuggleVS.人肾同种移植局部缺血/再灌注损伤中的细胞凋亡。Transplantation.1988，66(7)872-876)。在局部缺血的过程中，储存的ATP降解为次黄嘌呤和黄嘌呤(它们均是黄嘌呤氧化酶(XO)的底物)。再灌注期间产生的大量可利用的氧分子会通过激活XO而引起嘌呤氧化，这将产生超氧阴离子和过氧化氢(Pller MS，Hoidall JR，Ferris JE.大鼠局部缺血性急性肾衰中的氧自由基。J Clin Invest 1994，741156-1164)。在局部缺血/再灌注过程中，ROS的产生和微血管衰竭合并造成恶性循环，而其中激活的内皮细胞和循环白细胞的募集/粘连会进一步增加该部位组织的灌注并由此引起细胞低氧(Redl H，Gasser H，Hallstorm S，Schlag G.与细胞损伤有关的自由基。中风、脓毒病和器官衰竭的病理生物学，G.Schlag，H.Redl编辑.Springer-Verlag出版社，Heidelberg.德国1993，92-110)；(Ledebur HC，Parks TP.人内皮细胞中炎性细胞因子对细胞间粘连分子1基因的转录调控NF-kB位点与p65同型二聚体变体的重要作用。J Biol Chem 1995，270933-943)。
ROS能激活被炎性细胞浸润的组织中的NF-kB(Conner EM，Brand SJ，Davis JM，Kang DY，Grisham MB.氧和氮反应性代谢物在炎性肠疾病中的作用毒素、介质和基因表达的调节剂。Inflamm Bowel Dis 1996，2133-147)，而在被多形核细胞浸润的低氧组织中，激活的髓过氧化物酶(MPO)系统会进一步扩大组织损伤的级联反应(Kurose I，ArgenbrightLW，Wolf R，Lianxi L，Granger DN.局部缺血/再灌注诱发的微血管功能障碍氧化剂和脂质介质的作用。Am J Physiol 1997，272H2976-H2982)。在这种不利的环境中，局部凝血酶原机制会被激活，它可导致毛细管栓塞和低氧区域扩大。这种级联反应的后果之一是，细胞死亡接着发生坏死和/或细胞凋亡，使器官的生存力遭致损害(Tredger MJ，肝局部缺血-再灌注损伤的治疗理论与实践。Biofactors 1998，8(1-2)161-164)。内皮/炎性细胞的反应性会产生大量的可溶性化学介质(例如氧化氮、致炎(pro-inflammatory)细胞因子、前凝血质和血管活性剂)，当身体不能解除其免疫失调状态时，上述介质会引发全身性炎症反应综合征(SIRS)(Kowal-Vern A，McGill V，Gamelli RL.热损伤中的局部缺血性坏死性肠疾病。Archives of Surgery 1997，132(4)440-443)。
大范围烧伤是需要加强的和多项医疗措施以挽救患者生命的急症。在烧伤患者中，肠低灌注/局部缺血似乎在促进SIRS的调节中起着关键的作用(Wang P，Ba ZF，Cioffi WG，Bland KI，Chaudry IH.肠是损伤和出血性中风后造成肝细胞功能障碍的“发动机”吗？Journa of SurgicalResearch 1998，74141-148)。肠屏障衰退是极为重要的临床关联因素，因为肠上皮是脓毒性/毒性腔与无菌内部环境之间的前哨(Scheridan RL，Ryan CM，Yin LM，Hurley J，Tompkins RG.烧伤单位中的死亡。无菌多器官衰竭。Burns 1998，24(4)307-311)。
在这方面，实验和临床结果均表明在系统应激中适当的肠灌注对保持屏障完整性的重要性(Tabata T，de Serres S.Meyer AA.烧伤和肠局部缺血后IgM在合成肠细菌肽聚糖多糖方面的差异。Journa of Burn Careand Rehabilitation 1996，17(3)231-236)。另外，最近的研究也表明，当肠相关的淋巴组织被局部缺血激活后，肠组织会成为致炎细胞因子的生成源。MOF是肠护理状态下收治病人中的首要致死原因，它也是烧伤受害者中最常见的并发症，在高度专业的烧伤治疗单位中有高达70％的患者会有此并发症。
为了减轻局部缺血/再灌注过程对某些器官所造成的后果，已对许多合成或天然化合物进行了临床前或临床实验。对于肠局部缺血而言，已对血管紧张素II抑制剂进行了实验评价(Tadros，T，Taber DL，Heggers JP，Herndon DN.血管紧张素II抑制剂DuP753减轻了烧伤和内毒素诱发的肠局部缺血、脂质过氧化、粘膜通透性和细菌易位。Ann Surg2000，231566-576)。并且已对血小板激活因子抑制剂(Sun Z，Wang X，Deng X，Lasson A，Soltesz V，Borjesson A，Andersson R.PAF拮抗剂-来昔帕泛对肠局部缺血和再灌注所致大鼠肠屏障功能障碍的有益作用。Dig Surg 2000，1757-65)，和氧化氮释放促进剂进行了研究(WardDT，Lawson SA，Gallagher CM，Conner WC，Shea-Donohue DT.通过施用L-精氨酸持续产生氧化氮对肠局部缺血-再灌注的改善作用。J SurgRes 2000，8913-19)。其他方法包括抗氧化剂疗法，例如单独施用别嘌醇或与维生素C和E联用(Kacmaz M，Otzurk HS，Karaayvaz M，GuvenC，Durak I.酶促抗氧化剂对肠局部缺血-再灌注后变化的大鼠肠组织的防御机制别嘌醇与抗氧化剂联用的作用。Can J Surg 1999，42427-431)。
尽管如此，对细胞天然防御机制的研究结果仍然不足(Pialli SB，Hinmn CE，Luquette MH，Nowicki PT，Besner GE.结合肝素的表皮生长因子样生长因子对大鼠肠局部缺血/再灌注损伤的预防作用。J Surg Res1999，87225-231).
局部缺血-再灌注后的肾死亡，促进了对肾保护剂的研究，这包括对所谓局部缺血性肾脏具有普遍保护作用的拉扎洛依的产生(De Veechi E，Lubatti L，BerettaC，Ferrero S，Rinaldi P，Galli KM，Trazzi R，Paroni R.2-甲氨基苯并二氢吡喃U83836对肾局部缺血-再灌注损伤的保护作用。Kidney Int 1998，54857-863)。其他研究报道了teofilin在肾保护中的有益作用，其中teofilin主要用作腺苷受体的拮抗剂(Jenil AG，Ceriani JM，Gorenstein A，ramirez JA，vain N，ArmadansM，Ferraris JR.茶硷对围产期窒息新生儿肾功能作用的随机、双盲、安慰剂对照试验。Pediatrics 2000，105E45)。
施用心房利钠尿肽(Auriculin)未能减少急性肾衰患者的死亡率，也未能减少远端器官并发症(Weisberg LS，Allgren RL，Genter FC，KurnikBR.急性肾小管坏死的诱因对其预后的影响。Auriculin Anaritide急性肾衰研究组。Arch Intern Med 1997，1571833-1839)。给肾移植患者注射高剂量超氧化物歧化酶(SOD)可产生肾保护作用(Schneeberger H，Schleibner S，Illner WD，Messmer L，land W.自由基介导的再灌注损伤对尸源肾移植后急性或慢性排斥反应的影响。Clin Transpl1993219-232)。
US5360790描述了EGF和TGF-α在改善毒性和局部缺血性急性肾衰方面的益处。尽管非肠道施用某些生长因子在试验模型中具有肾保护作用，但是迄今为止的临床结果仍令人失望。与安慰剂对照实验相比，IGF-I在一项多中心对照临床试验中并未显示出对急性肾衰患者的预期效果(Hirschberg R，Kopple J，Lipsett P，Benjamin E，Minei J，AlbertsonT，Munger M，Mezlter M，Zaloga G，Murray M，Lowry S等.重组人胰岛素样生长因子I对急性肾衰患者的多中心临床试验。Kidney Int 1999，552423-2432)。在另一项治疗急性肾衰的临床试验中，证实IGF-I缺乏效果(Kopple JD，Hirschberg R，Guler HP，Pike M和Chiron研究小组重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对急性肾衰(ARF)患者缺乏效果。J Am Soc Nephrol 1996，71375)。
目前比较缺乏器官保藏技术，这就限制了移植用的新器官的供应。另外，体外保藏剂常出现相互矛盾的结果(Schlumpf-R，Candinas-D，Webre-M，Rothlin-M，Largiader-F.采用改性UW器官保养液保藏肾移植物的初步临床结果。Swiss-Surg，1995(4)175-80；讨论180-1)；移植到接受者体内的器官的生化和功能性衰退，仍是非免疫性排斥的首要原因(Barber E，Menéndez S，León OS，Barber MO，Merino N，CalungaJL，Cruz E，Bocci V.防止热致局部缺血大鼠在臭氧耐受诱导后出现肾损伤。Mediators of Inflammation 1999，837-41)。有报道某些保养剂具有不适的作用，它们可干扰血小板聚集机制，这样会导致过量出血(Salat A，Mueller MR，Boehm D，Stangl P，Pulaki S，Laengle F.UW器官保养液体外对血小板聚集能力的影响。Transpl-Int.1996，9(增刊1)S429-431)。其中有报道灌注后的器官中出现了血管痉挛并形成血栓(Jeng-LB，Lin-PJ，Yao-PC，Chen-MF，Tasi-KT，Chang-CH.人肝动脉经UW(University of Wisconsin solution)器官保养液保藏后出现的损伤性内皮依赖性松弛。Arch-Surg，1997，6月，132(1)7-12)。医学界仍期望开发出更有效且更廉价的器官保养溶液(Rentsch M，Post S，Palma P，Gonzalez AP，Menger MD，Messmer K.用热乳酸林格氏液冲洗在肝移植中有益作用的活体研究。Transpl Int.1996，9(5)461-7)。由于IGF-I不能在临床上提供足够的肾保护效力，因此形成了这样的观念即一种生长因子不足以在局部缺血/再灌注过程中刺激细胞存活，应采用更为有效的“鸡尾酒”生长因子疗法(Playford RJ.肽和胃肠道粘膜的完整性。Gut 1995，37595-597)。
EP0357240 B1要求保护表皮生长因子(EGF)在局部缺血/再灌注发作过程中对器官的有益保护作用。然而，需要施用非常高浓度的EGF(1mg/kg)才能达到大脑保护作用。0.1mg/kg的低剂量(对于生长因子而言，该浓度依然很高)仅显示出中度的保护作用。这些事实使该发明具有一定的缺陷，第一个缺陷是为了在动物体内达到效力而重复注射(4-5次)的高昂治疗费用。例如70kg的人受治疗者需要一次注射70mg EGF，而该剂量必需周期性重复施用以确保临床疗效。第二个缺陷是药理学。该专利中的实施例表明其治疗窗非常窄，这防碍了建立半数致死量(ED50)和量效曲线的可能性。第三个缺陷是EGF剂量过高。据报道，EGF会降低大鼠和猴的心排量和动脉压(Keiser JA，Ryan NJ. EGF对清醒大鼠和猴的血液动力学影响。PNAS USA 1996，93(10)4957-4961)。高浓度的EGF会干扰正常的细胞周期进程(Bennett，NT，Schultz GS.生长因子与伤口愈合生长因子及其受体的生化性质。Am J Surg 1993，165728-737)。EGF干预对于局部缺血/再灌注中肝和肠的潜在保护作用，似乎是可以预期的。日益增加的证据表明，非肠道施用EGF似乎可对急性血流抑制状态的多种内脏器官提供保护作用。在试验条件下，将动物暴露于能阻滞ATP合成或提高EROs生产率的化学药物下，EGF干预被证明可有效减轻器官损伤。另外，重复施用EGF有助于提高组织的再生、适应性和功能性。EGF疗法的所有益处均需采用重复给药方案和高剂量才能达到。这些益处通常较小，仍需与其他生长因子联用以加强效果。
对于局部缺血，如果局部缺血时间低于60分钟，EGF似乎可减轻组织损伤。而对于较大的局部缺血发作，EGF疗法没有价值。这对于手术中需要EGF来防止较大的局部缺血发作而言，是一个明显的局限。
尽管长期以来强调采用生长因子联合疗法，但是目前并没有适用于临床中的联合疗法。
本发明药物组合物具有新颖性，其中表皮生长因子(EGF)和生长激素促分泌素六肽(GHRP)的药物组合物产生了协同作用。该药物组合物可提高部分或全部动脉血流供应不足数分钟至数小时的器官或组织中细胞的存活率。该药物组合物可减少或防止产生EROs产生以及低氧或缺氧器官中的其他毒性代谢物，刺激了细胞在局部缺血期间的存活。上述两种肽的组合在提高器官适应性方面(即肠在广泛性创伤和修复过程后的适应性)，表现出明显的协同作用。
上述组合物通过预防性的预调节干预而激活了细胞的自我防御机制，这可提高细胞对细胞毒剂和应激状态的耐受性。因此，普通状态下将死亡的细胞经上述组合物的预调节干预后，会变成非致命性的。因此，可将该药物组合物施用到遭受局部缺血、低血流状态、中风、血液动力学衰竭等危象中的器官或生物体内。
本发明组合物除了具有保护作用之外，还可促进创伤后组织的修复、再生和功能适应性。广泛性烧伤、多发性创伤、中风的受害者应尽早施用本发明组合物，以减轻内部器官损伤的进行性级联反应，从而防止和延迟出现多器官衰竭。所述患者可选自大手术或长时间手术、需体外循环机支持等患者，可以给这些患者施用本发明组合物，以降低内脏和其他内部器官损伤的风险，从而减少全身性炎症反应综合征。在适宜的溶解血栓疗法中，该组合物还可用来减轻与血栓症和栓塞相关的器官/组织损伤。
由于它们在营养/再生方面的协同作用，本发明组合物可用来促进短肠患者的肠适应性。该药物组合物也能刺激肝实质和肾小管的再生。
在本发明的一个优选实施方案中，包括EGF和GHRP-6单一产品形式的药物组合物，对低氧和缺氧状态下的组织和器官显示出有力的细胞保护作用。所述组合物可以不同的机制提供细胞保护作用，它可在单一预调节剂量(dosification)后进行上调节。该药物组合物可与任何标准的抗氧化剂疗法联用。
另一方面，当用于刺激组织再生时，需采用重复给药方案施用本发明组合物。其中EGF包括天然、合成或重组来源的EGF。促分泌素肽是指具有下式氨基酸序列的六肽His-D-Trp-A1a-Trp-D-Phe-Lys-NH2。该生长激素释放肽缩写为GHRP-6。
所谓“组合”也可以指在一个治疗方案中分别将两种肽给予个体。
当预防性施用上述组合物以防止局部缺血性组织损伤时，药物组合物中的EGF浓度为0.5-50μg/ml(冻干盐或溶液均可)。GHRP-6的浓度为2-100μg/ml(载体同前)。推荐用于预防目的的EGF和GHRP-6的剂量为0.5和1μg/kg。
也可以推注(Bolus)形式施用上述组合物。给药途径包括周围或深部静脉、动脉内和/或腹膜内给药。用于给药的载体包括标准生理盐水溶液、乳酸林格氏溶液、人血浆、人白蛋白溶液、5％葡萄糖，或者它们的混合物。
为了使该疗法达到最高效力，应在诊断出、怀疑或出现手术造成的局部缺血时，尽早第一次施用该药物组合物。对于广泛性烧伤、多发性创伤、中风等的受害者而言，应立即给予治疗(预防性干预)，无需考虑是否存在内脏局部缺血的临床或其他辅助指征。对于非脓毒性胰腺炎患者，也应按上述方案给予治疗。
本领域技术人员根据临床症状的严重性和/或侵袭的程度，可对预防性给药方案加以调整。每隔6小时重复推注给药1次，每天给药4次。有必要在每次给药之间保持6小时的滞后期。可采用缓释给药装置施用上述组合物。如果上述组合物产品是冻干的，则需在用前再混悬。
前述的组合物是用于治疗目的(即旨在刺激再生和适应性)，优选采用缓释给药系统或其他类似手段，以达到两室平衡状态。推注输液不能有效地刺激组织再生。如果采用静脉埋管，则给药时间必须标准化，持续期应约为4小时。如治疗中的清除期至少为8小时，则24小时内可给药2次以上。用于再生的两种肽的推荐剂量为0.01-5μg/kg/小时。上述给药和剂量方案可修复局部缺血(出现坏死/细胞凋亡)所致的组织损伤。对于遭受短暂局部缺血的组织而言，给予上述组合物可防止出现其他并发症。推荐在移植术后施用上述组合物，它可促进移植器官的解剖愈合、组织再生和再适应性。
同时，推荐重复施用上述组合物，以治疗大的肠道手术后的短肠综合征和急性肠衰竭。
实施例
实施例1
GHRP-6在急性胃应激性损伤动物模型中的细胞保护作用
将成年雄性OF-1小鼠(20-23g)随机分成GHRP-6组(0.1μg/动物)和0.9％生理盐水溶液组(均经腹膜内注射给药)。10-30分钟后，强迫动物在冷水中游泳30分钟，再让其在4℃水中游泳20分钟。然后麻醉并处死动物，供胃粘膜检查。将样品固定在10％缓冲福尔马林溶液中固定，用H&E、PAS染色供显微镜研究。实验中以糜烂、出血和溃疡为肉眼病理学观察标准(Playford RJ.肽和胃肠道粘膜的完整性.GUT 1995，37595-597)。所述溃疡是指显微镜下观察到的深达腺粘膜三分之一的溃疡。采用氰高铁血红蛋白方法(Reactivos Spinreact，巴塞罗那)测定血红蛋白，研究腔出血状况。数据以g/dL表示。所有检测均采用假处理标记以盲法测定。
如表1所示，GHRP-6显著降低了粘膜损伤的强度(以泌酸粘膜上的溃疡数量表示)。
以下表格中插入所在空格的数据
表1全身给予GHRP-6的胃保护作用每组20只小鼠。*P＜0.01，两尾t-检验。显著性水平P＜0.05。
该实验证实，GHRP-6对遭受严重全身性应激的动物胃粘膜具有细胞保护作用。从这种急性损伤模型的病理生理学中可推断出胃粘膜的局部缺血/再灌注状况。
实施例2
预防性给予EGF和GHRP-6在肾局部缺血/再灌注
动物模型中的保护作用实验设计
采用肾双侧局部缺血/再灌注大鼠模型，研究了单独或联用两种肽的潜在肾保护作用。在第一个实验期间，局部缺血时间为1小时，然后进行3小时的再灌注。将雌性Wistar大鼠(200-220g)随机分成以下5个实验组(N＝10)
I组假局部缺血处理；
II组局部缺血和0.9％生理盐水；
III组局部缺血和20μg EGF/鼠；
IV组局部缺血和50μg GHRP-6/鼠；
V组EGF(5μg)和GHRP-6(10μg)联用。
在局部缺血前的30分钟，经腹膜内给药。局部缺血模型
用显微血管钳(Moria，Fine Science Tools公司，美国)夹住肾动脉60分钟。对3小时完全再灌注的动物再监测30分钟，以建立肾功能。肾功能
以菊粉和对-氨基马尿酸(hypuric acid)作为分子量标记，研究肾小球滤过率(GFR)和肾血流量(RPF)。按下式计算清除率系数
C＝Uv(m)×[PM]u/[PM]p
Uv(m)为最大尿容量/分钟；u和[PM]p代表每种标记的血浆和尿浓度，以ml/min/g表示。利尿容量
将导尿管固定于尿道膀胱中，并夹闭尿道。将导尿管的游离端插入刻度管中，收集10分钟的尿容量。生化测定
将肾组织样品置于KCl/组氨酸(pH7.3)缓冲液中均化，上清液用于测量MDA反应代谢物PLA2、过氧化氢酶的活性。组织学测定
10％缓冲福尔马林溶液固定的肾组织经石蜡包埋和H&E染色后，由独立的病理学者按以下标准进行研究萎陷的肾小球数量，皮质出血，髓质出血，严重性肾小管损伤和严重间质损伤。
如表2所示，局部缺血/再灌注发作可使肾的尿生成能力衰退。与生理盐水处理的对照组相比，EGF干预减轻了尿过少症状。与生理盐水处理的动物相比，经GHRP-6干预的动物尿生成量提高了4倍，这表明GHRP-6有利于保护肾功能。EGF/GHRP-6联合给药显示了对肾衰完全保护作用，其尿容量与未局部缺血处理的对照组一致。这些数据证实了本发明两种组合物的协同作用。
表2再灌注期间的排尿量数据为均值+标准偏差(SD)。Mann Whitney-U检验。**表示与给予0.9％生理盐水的再灌注动物之间的平均差异(P＜0.01)。*表示与给予0.9％生理盐水的再灌注动物之间的平均差异(P＜0.05)。
显微镜检查表明，局部缺血对肾脏的三种主要结构(即肾小球、肾小管和间质组织)均有影响。给予生理盐水的动物的损伤比较严重。单独施用EGF和GHRP-6对肾均有保护作用。总体上和从定性角度上比较，单用GHRP-6对肾实质的保护作用似乎高于EGF。两种肽的组合均比单用每种肽的要好。数据显示于表3。
表3 出现肾组织损伤的动物/组百分比采用单向ANOVA分析和Duncan多重检验。*表示与给予生理盐水的局部缺血组之间的平均差异(P＜0.01)。κ表示与给予生理盐水的局部缺血组之间的平均差异(P＜0.05)。η表示EGF组、GHRP-6组与两种肽的组合组之间的平均差异(P＜0.05)。
肾功能实验结果(两种血流标记的清除率)证实了组织学数据。单独施用EGF和GHRP-6均可部分地减轻肾衰。两种肽的组合证明具有完全的肾保护作用。结果见表4。
表4肾功能采用单向ANOVA分析和Duncan多重检验。(*)表示组合物治疗组与生理盐水组之间的差异(P＜0.01)。(η)表示组合物治疗组与单独一种肽治疗组之间的差异(P＜0.05)。( )表示GHRP-治疗组与生理盐水组之间差异(P＜0.05)。
在研究的第二阶段，延长局部缺血时间，便于以更接近临床实践的实际模式研究上述肽的作用。将肾脏经历3小时的局部缺血期和3小时的再灌注期。如表5所示，经过3小时的局部缺血期后可观察到明显的肾衰竭。从生理盐水组和EGF组中收集的尿容量非常少，并且其中含有血红蛋白。经GHRP-6治疗的动物组可观察到部分肾保护作用，其排尿量明显高于生理盐水组和EGF组。但其排尿量要低于非局部缺血处理参考组。EGF/GHRP-6组合治疗组的排尿量与非局部缺血参考组类似，这可以证明EGF/GHRP-6组合具有肾保护作用。
表5再灌注期间的排尿量数据为均值+SD。采用单向ANOVA分析和Duncan多重检验。(*)表示GHRP-6治疗组与生理盐水组之间的差异(P＜0.05)。(η)表示组合物治疗组与EGF治疗组和接受生理盐水处理的对照组之间的差异(P＜0.01)。( )表示组合物治疗组与GHRP-6治疗组之间的差异(P＜0.05)。
从组织病理学的角度来看，大多数动物的肾损伤是巨大且严重的。保护作用的强弱关系是组合物/GHRP-6/EGF。除了组合物之外，单独施用GHRP-6和EGF对动物的保护作用非常小。表6数据证明了组合物的保护作用。
表6出现肾组织损伤的动物/组百分比采用单向ANOVA分析和Duncan多重检验。显著性水平(P＜0.05)。(ι)表示GHRP-6治疗组与给予生理盐水的局部缺血对照组之间的差异(P＜0.05)。(η)表示组合物治疗组与其他局部缺血处理组之间的差异(P＜0.05/P＜0.01)。
肾功能分析表明，上述组合物可确保适宜的肾小球血流速度和肾小管滤过率。甚至在本发明局部缺血状态下，这些功能性标记的浓度也在正常范围内(与假局部缺血处理的动物一致)。结果如表7所示。
表7肾功能采用单向ANOVA分析和Duncan多重检验。显著性水平(P＜0.05)。(*)表示组合物治疗组与其余局部缺血组之间的差异(P＜0.01)。(η)表示GHRP-6治疗组与0.9％生理盐水组之间的差异(P＜0.05)。
该研究证实了组合物在防止因局部缺血/再灌注期延长所致的肾结构损伤和功能性死亡方面的优越性。
实施例3
EGF/GHRP-6组合在肠局部缺血/再灌注模型中的保护作用
将雄性Sprague Dawley大鼠(220-250g)随机分成以下4个治疗组
I组局部缺血/生理盐水；
II组局部缺血/EGF500μg/大鼠；
III组局部缺血/GHRP-6100μg/大鼠；
IV组局部缺血/组合-EGF(5μg)/GHRP-6(2μg)/大鼠.
在局部缺血前的30分钟，经腹膜内给药。实验模型
在甲氧氟烷麻醉和温毯条件下，小心地实施剖腹术，将肠系膜上动脉的第一分支暴露出来。将动脉夹闭2小时，在小肠的空肠和回肠部分形成严重的局部缺血。再灌注3小时。处死大鼠并完全尸体解剖。切除小肠并记录出血粘膜和/或腔损伤的长度。用标准体积的生理盐水将小肠内容物洗出，测定其中的血红蛋白含量。肠粘膜用温生理盐水洗涤后，称重并取片段测定总蛋白质含量(Lowry法)。其他片段用于测定总DNA含量和显微镜分析。采用Chiu描述的方法，对绒毛/粘膜损伤进行显微镜分析。损伤程度分为粘膜完整(记为0级)至完全剥露(记为5级)。
为了全面地阐述联合治疗在这种肠局部缺血/再灌注模型中的保护作用，应监测再灌注后的96小时内存活状况。
施用生理盐水的动物受局部缺血/再灌注侵袭严重，出现透壁性溃疡(完全剥脱)且出血过多。如表8所示，该组中的大多数肠片段出现5级损伤模型。EGF治疗的保护作用最低，即在临床实践中似乎不相干。EGF干预的效力最低。在接受GHRP-6的动物中出现了部分保护作用，粘膜损伤较浅且具有一定的局域性。组合物显著降低了粘膜损伤(表8)。研究中所有标准的测量结果均证实，本发明组合物对局部缺血/再灌注损伤发作有显著的细胞保护作用。
表8 肠损伤参数数据为均值+SD。采用单向ANOVA分析和Duncan多重检验。(*)表示组合物治疗组与给予生理盐水的局部缺血组之间的平均差异(P＜0.01)。(η)表示GHRP-6治疗组与生理盐水治疗组之间的平均差异(P＜0.05)。
对主要内部器官的显微镜检查证实，肠损伤的程度与远端器官中发现的肠外变化之间存在着密切的相关性。用组合物治疗的动物可在以下几方面减轻主要的损伤(1)肺实质中的中性白细胞浸润，(2)防止肝细胞肿瘤，和(3)防止肾小球萎陷和肾小管变化。
为了研究上述组合是否会促进动物的存活，又进行了另一个独立的实验。实验方法学同上。所有动物经腹膜内注射乳酸林格氏溶液，然后闭合伤口。开始再灌注后，对动物监测96小时。施用上述组合物的动物均可存活96小时或更长时间。
表9每细的存活率
对这些动物的病理学研究证实，上述组合物不仅仅能通过降低坏死性变化的发作而提供稳定的肠保护作用。而且，还可减轻因中性白细胞募集而对远端靶器官肺和肾脏的损伤。这些发现证实了EGF/GHRP-6组合所产生的全身和多器官保护作用。
实施例4
治疗性施用EGF/GHRP-6在广泛性烫伤所致的多器官
损伤实验模型中的作用
将Balbl/c小鼠(22-25g)的背部脱毛，并对其25％体表面积进行皮下烫伤处理(浸入95-97℃平衡的水中5秒)。然后立即给予所有小鼠1.5ml生理盐水作为复苏补液。我们实验室已建立了该动物模型并使之标准化，该模型适于本发明目的，在多方面内部变化条件下均可稳定地重现。在下一个24小时中，将存活的小鼠随机分成以下6组
给予0.9％生理盐水的假烧伤鼠参考组(N＝5)；
仅给予0.9％生理盐水的烫伤鼠(N＝7)；
烫伤并给予EGF治疗的鼠(N＝10，0.1μg EGF/动物)；
烫伤并给予GHRP-6治疗的鼠(N＝9，0.1μg GHRP-6/动物)；
烫伤并给予组合物治疗的鼠(N＝10，0.01μg EGF+0.01μgGHRP-6)；
每天给药2次，直至烫伤后的第10天。完成处理后，对动物再称重并处死供尸检和显微镜检查。在处死前的6小时，给每只动物注射长春新碱(1mg/kg)使细胞停滞于分裂中期。切除小肠，洗涤并称重。收集片段测定总DNA和蛋白质含量。其他片段用福尔马林溶液固定，并用于常规处置或用于绒毛/腺管的肠显微解剖。采用DIGIPT图象处理系统在显微镜玻片上进行形态测定。
研究中考察了以下参数动物重量；肠重量、蛋白质和DNA含量；每一腺管中分裂中期细胞的数量；分支腺管的数量；绒毛高度；腺管深度。
在实验结束时，所有接受EGF、GHRP-6或组合物的小鼠的体重明显增加。其中接受组合物的小鼠的体重增加更为明显。结果见表10。这一结果表明上述组合物对肠粘膜的营养作用。
表10实验中的体重变化最终体重是在烫伤后第10天记录的，此时已给药20次。数据为均值+SD。采用单向ANOVA分析和Duncan检验。(*)表示最初体重与最终体重之间的平均差异(P＜0.05)。( )表示组合物治疗组与其余组之间的差异。
如表11所示，与生理盐水治疗组相比，每种单独施用的肽均对肠粘膜具有营养/再生作用。而施用上述组合物的治疗组显示出最显著的作用。
表11肠再生反应数据为均值+SD。采用单向ANOVA分析和Duncan检验。(*)表示组合物治疗组与生理盐水组之间的平均差异(P＜0.01)。(η)表示单独施用每种肽的治疗组与生理盐水治疗组之间的平均差异(P＜0.05)。
该实验中最相关的证据是，上述组合物通过刺激小肠和结肠中腺管的分裂进程，从而促进了肠的生长和适应性。腺管是肠粘膜的生长和增殖单位，它也是肠实质适应性的形态学证明。表12为肠形态学重构数据。绒毛和腺管的增大与组织再生和营养吸收相一致。
表12肠-粘膜重建数据为均值+SD。采用单向ANOVA分析和Duncan检验。(*)表示组合物治疗组与其余组之间的平均差异(P＜0.05)。(φ)表示EGF治疗组与0.9％生理盐水组之间的平均差异(P＜0.05)。
本发明具有以下优点
1.上述组合物可能具有预防和/或治疗效力，这取决于待治疗病理状况的需要。本领域专业技术人员通过调整给药方案可很容易地实现上述作用。
2.上述诱发细胞保护的方法是基于刺激体内每一细胞的自我防御机制。这些可被激活的机制可以不同，但是其功能很多。而许多已有的解决方法需引入外源性化学结构(异生化合)。
3.小剂量即可诱发预期的治疗反应，而不必冒毒性的风险。业已证明非常高剂量的肽在不同哺乳动物中均是安全的，而已有干预则需较高的剂量才能达到较小的效果。
4.EGF与GHRP-6的相互作用，可迅速激活特定细胞受体的生物反应。这样可避免过长时间地暴露于肽中，从而降低了毒性风险。
5.上述组合物没有禁忌症，并可安全地用于任何受治疗者。不会出现不想要的药物相互作用。
6.上述方法广泛适用于目前尚无适宜治疗选择的普通临床状况和依从性(comorbidity)。
7.上述方法适用于多种病理状况，例如包括经历移植手术的患者。
8.从对局部缺血/再灌注的保护时间上来说，本发明方法具有较宽的治疗窗。所述保护时间符合移植术、血管再通术、诊断操作、治疗操作等当前临床需求。
9.从机械论的观点来说，上述组合物可在不同的危象时刻抵抗局部缺血/再灌注损伤的级联反应，可提供多价药理学机制并由此而有效。
10.本发明组合物尤其适于用作多种上皮器官例如肠、肝、胰腺和肾脏的营养/再生剂。
11.本发明组合物已被证实可用于矫正短肠综合征和改善肠适应。在目前临床中并没有可替代上述方法的方法。
权利要求
1.一种用于预防和治疗动物和人生物体因动脉血流供应不足所致组织损伤及其后果的药物组合物，其特征在于包括联合给予的具有表皮生长因子活性的肽和生长激素促分泌素六肽(GHRP-6)。
2.如权利要求1的药物组合物，其中具有表皮生长因子活性的肽是表皮生长因子(EGF)、α型转化生长因子(TGF-Δ)、或肝素结合的EGF样生长因子(HB-EGF)。
3.如权利要求1的药物组合物，其中具有表皮生长因子活性的肽和生长激素促分泌素六肽(GHRP-6)是包含适宜赋形剂的单一药物组合物中的构成成分。
4.如权利要求1的药物组合物，可单独施用生长激素促分泌素六肽GHRP-6，或者将其与具有表皮生长因子活性的肽联合给予患者，用作预防或治疗性干预的一部分。
5.如权利要求1-4任一的药物组合物，其中溶液或冻干形式的具有表皮生长因子活性的肽的浓度为0.5-50μg/ml。
6.如权利要求1-4任一的药物组合物，其中溶液或冻干形式的生长激素促分泌素六肽GHRP-6的浓度为2-100μg/ml。
7.如权利要求1-6任一的药物组合物，其中用于预防目的的药物组合物需经非肠道推注给药，其中每种活性肽的剂量为0.5-1μg/kg体重。
8.如权利要求1-6任一的药物组合物，其中用于包括营养/再生目的的药物组合物需经连续输液给药，其中每种活性肽的剂量为0.01-5μg/kg体重。
9.一种通过预防因动脉血流不足所致局部缺血性损伤而防止人和动物组织损伤的药物组合物，其特征在于包括生长激素促分泌素六肽GHRP-6和适宜的赋形剂。
10.如权利要求1-8任一的药物组合物在组织和/或器官遭受没有回流的局部缺血、低血流状态、或局部缺血/再灌注时防止出现组织损伤中的用途。
11.如权利要求1-8任一的药物组合物作为辅助疗法在减轻和矫正成人呼吸窘迫综合症(ARDS)中的用途。
12.如权利要求1-8任一的药物组合物在防止和矫正需要重症监护措施的多器官功能障碍综合征及其相关过程中的用途。
13.如权利要求12的用途，用于治疗烧伤受害者、多发性创伤患者、广泛性手术患者、移植术接受者、经历血运重建术的患者、需配备心肺机的患者、接受血栓溶解剂和/或纤维蛋白溶解(fybrinolitic)疗法和形成再灌注的患者、挤压综合征、低血容量患者、中风、低心排量疾病。
14.如权利要求1-8任一的药物组合物作为辅助疗法在治疗出血、体液分布不均、中风、和内脏局部缺血/再灌注中的用途。
15.如权利要求1-8任一的药物组合物作为移植术，手术造成的长时间局部缺血，和任何可引发内脏局部缺血、全身性炎症反应综合征和多器官功能障碍的状态的预防和预调节剂的用途。
16.如权利要求15的用途，用于血运重建术过程中保持内部器官和组织的体内平衡，并促进肾、肝、胰、肠、肺、心脏和皮瓣等器官移植后的移植物的存活。
17.如权利要求1-8任一的药物组合物在任何可妨碍富氧血流灌注组织的状态下用于防止任何细胞损伤中的用途。
18.如权利要求1-8任一的药物组合物在任何可导致坏死和/或细胞凋亡的局部缺血发作之后用于防止组织/器官损伤中的用途。
19.如权利要求1-8任一的药物组合物在肠切除术、短肠综合征、肠衰竭等之后加速肠的适应进程中的用途。
全文摘要
本发明涉及人用药品，具体地说涉及包括表皮生长因子(EGF)和生长激素促分泌素六肽(GHRP)的药物组合物。该药物组合物可预防缺血性损伤后因血流供应不足所造成的组织损伤中促进组织修复。上述组合可以单一药物组合物形式施用，或者在同一治疗方案中将EGF和GHRP分别给予个体，在富氧血流供应损失的危象时期用于促进细胞的存活。这种组合可减轻活性氧产物(ROS)的形成及其相关细胞毒性。当组织遭受长时间的局部缺血时，这种药物组合物可促进细胞的存活。该药物组合物可用作那些易于发生多器官衰竭(MOF)的受治疗者的预防剂，所述受治疗者例如包括烧伤受害者、多发性创伤患者、低氧血症新生儿、急性呼吸窘迫综合征和坏死性小肠结肠炎患者。
文档编号A61P7/00GK1407899SQ01805978
公开日2003年4月2日 申请日期2001年12月17日 优先权日2001年1月3日
发明者J·博兰格阿库斯塔, G·E·奎林内托, D·加西亚戴尔巴科海瑞拉, J－R·弗南德茨玛索, M－P·埃斯托达加西亚, I·奎林柏瑞兹, J·苏尔利兹阿尔巴, R·玛丁内兹罗德里库兹 申请人:遗传工程与生物技术中心