羟基红花黄色素a在制备治疗、预防心脑血管疾病方面的药物用途的制作方法

专利名称：羟基红花黄色素a在制备治疗、预防心脑血管疾病方面的药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及羟基红花黄色素A制备治疗、预防心脑血管疾病的药物用途。
背景技术：
红花黄色素是从红花中提取的总提取物，它对心脑血管具有一定的活性，由于总提取物中成分复杂使得药物制备的标准无法稳定地控制。本发明人经过对红花总黄色素进一步的分离和研究实验，发现在红花总黄色素中对心脑血管起作用的成分是结构明确的已知物质羟基红花黄色素A，它的结构式为 其中羟基红花黄色素A是作为染料中间产物出现的。
技术内容本发明提供一种羟基红花黄色素A(S-A)在制备治疗、预防心脑血管疾病方面的新用途。
羟基红花黄色素A(S-A)是红花黄色素中的一种成分，经研究发现其含量的不同直接影响着红花黄色素对心脑血管疾病的治疗作用，但有关羟基红花黄色素A在治疗和预防心脑血管疾病方面还未见报道，因此我们通过研究并进行有关实验证实，羟基红花黄色素A具有预防和治疗性心脑血管疾病的用途。
我们通过试验研究发现羟基红花黄色素A具有抗局部脑缺血损伤、增加脑血流量、抗血栓、抑制血小板聚集和延长凝血时间的作用，因此本发明有效剂量的羟基红花黄色素A能够用来治疗、预防血栓形成、自由基所致和血小板激活因子诱发的心脑血管疾病，特别是治疗、预防Ca2+和自由基含量升高的及致线粒体损伤的缺血性脑血管疾病。病人脑缺血后脑细胞的坏死、调亡与大脑中多种因素有关，其中细胞中Ca2+和自由基的增多、线粒体的破坏使细胞趋于调亡。因此减少细胞内Ca2+和自由基的含量、保护线粒体完整性也是治疗、预防缺血性脑血管疾病的途径之一。首先，线粒体(Mit)既是能量代谢的主要场所又是调节细胞内钙稳态的重要细胞器之一，同时也会产生自由基，Mit摄取Ca2+速度加快，使得脑细胞钙敏感性降低，将导致脑细胞Ca2+超载，Ca2+超载也促进了自由基的生成自出基对膜结构的损伤又加速了Ca2+内流，而Mit对氧自由基的毒性非常敏感，脑缺血时，低氧分压及其他原因使Mit产生大量自由基，作用于Mit膜上，使MDA含量升高、膜流动性降低、膜磷脂降解等，导致Mit膜结构与功能的损伤从而加剧了脑细胞的凋亡、加重了脑缺血的发展；其次、Mit膜结构的完整性是产生ATP的前提条件，这显然对于ATP的生产是不利的，将导致脑能量代谢受抑制，低氧分压产生乳酸，而ATP的缺乏使乳酸转化的途径受阻(如糖异生)，从而使乳酸堆积，毒害脑细胞，造成脑细胞灶状坏死。因此Mit膜损伤可能是脑细胞由可逆性损伤转化为不可逆损伤的早期特征和重要标志。另外，自由基其性质活泼，可损伤蛋白质、脂质、核酸等，其可直接作用于生物膜上的不饱和脂肪酸损伤生物膜，导致多种疾病的发生。
本发明羟基红花黄色素A对脑缺血损伤的保护作用不仅仅体现在对凝血系统的作用上而且具有抑制Ca2+过多摄入和氧自由基的增多，降低MDA含量、提高SOD与GSH-Px活性、减少Mit膜磷脂降解、增加膜流动性从而保护MIT膜的完整性，从抗细胞凋亡与细胞死亡两个方面保护脑细胞进一步达到了预防、治疗缺血性脑血管疾病的目的。
本发明进一步还可以治疗、预防与垂体后叶素诱发、异丙肾上腺素诱发心肌缺血性心血管疾病。
具体的来说，本发明有效剂量羟基红花黄色素A可以治疗、预防动脉硬化、冠心病、脑血栓、脑缺血、心绞痛、心肌梗塞、静脉炎、神经性皮炎等疾病。
本发明所述的羟基红花黄色素A可以合成，也可以从红花中提取分离获得，如果从红花中提取分离，优选采用水提醇沉的提取方法，与离心分离法、大孔吸附树脂柱层析法和聚酰胺吸附法组合，获得羟基红花黄色素A。其中，优选采用下列方法1、将红花用水冷浸24h煎煮回流提取50-90分钟，然后过滤，把滤液浓缩至相对密度为1.10-1.25；2、将浓缩液中加入乙醇至含醇量80％，在4C条件下沉淀24小时，过滤除去沉淀，取上清液，挥净乙醇并浓缩至相对密度为1.15-1.20；3、向浓缩液中加入5-10倍的水，在4℃条件下，沉淀12-24小时，离心除去沉淀；4、将上述离心液经大孔吸附树脂柱层析，先用去离子水洗脱至Molish反应及茚三酮反应呈阴性，然后继续用去离子水洗脱4-6个柱体积并收集洗脱液；5、将上述洗脱液经聚酰胺吸附，极性溶剂甲醇或乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃条件下减压浓缩除去甲醇或乙醇，剩余水溶液冷冻干燥，得到桔黄色无定形粉末，即为本发明羟基红花黄色素A。
本发明中羟基红花黄色素A的制备方法优选为取红花生药，加入其重量10-15倍水，煮沸50分钟，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.25，加乙醇至含醇量为80％，4℃沉淀24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.20，加10倍量的水，4℃沉淀24小时，离心，取上清液，用重量为其40％的大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗脱3个柱体积，然后继续用去离子水洗脱5个柱体积，收集洗脱液，用重量为其10％的聚酰胺吸附，先用去离子水洗至无色，然后用95％乙醇洗脱8个柱体积，收集洗脱液，旋转蒸发器上浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到羟基红花黄色素A。
本发明中有效剂量的羟基红花黄色素A作为有效成分可以与药学上可接受的不同辅料采用常规的制备工艺制成各种不同的药物剂型，如注射液、大输液、注射用无菌冻干粉针剂、片剂、胶囊或口服液等对患者给药，如将有效量的羟基红花黄色素A和支持剂如甘露醇、低分子右旋糖苷等药用辅料经用注射用水溶解，进行灭菌直接做成注射液或采用常规的冻干工艺制成冻干粉；和糊精、淀粉、乳糖、磷酸氢钙、硬脂酸镁等敷料，采用常规的压片法制成片剂或者将上述组分装入胶囊制成胶囊剂。
具体实施例方式
制备例1取红花生药，加入其重量10-15倍水，煮沸50分钟，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.25，加乙醇至含醇量为80％，4℃沉淀24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.20，加10倍量的水，4℃沉淀24小时，离心，取上清液，用重量为其40％的大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗脱3个柱体积，然后继续用去离子水洗脱5个柱体积，收集洗脱液，用重量为其10％的聚酰胺吸附，先用去离子水洗至无色，然后用95％乙醇洗8个柱体积，收集洗脱液，旋转蒸发器上浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到羟基红花黄色素A。
实验例1、羟基红花黄色素A对大鼠局部缺血损伤的影响。
1.材料和方法受试样品；注射用羟基红花黄色素A，山东省天然药物工程技术研究中心提供，规格10mg/只，批号20000525，临用前生理盐水配制成所需浓度的溶液；尼莫地平注射液(商品名尼立苏)，山东新华制药股份有限公司，规格10mg/50mL批号；00060211，批准文号(95)卫药准字X-121(2)号；血塞通，云南植物药业有限公司，1000mg/2ml批号20000407滇卫药准字(1995)第000138号；赋形剂，甘露醇，青岛胶南明月海藻工业有限公司生产(符合药典标准)，批号9905026。红四氮唑，美国SIGMA公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。
动物普通级Wistar大鼠，雄性体重350-420g，山东医科大学实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200001003插线法制备局部脑缺血模型栓线选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm。大鼠用水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离左侧颈总动脉，于颈内、颈总动脉处用动脉夹夹闭，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将尼龙绳由颈外动脉插入颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉夹，消毒缝合伤口，造成左侧大脑中动脉缺血模型。以上实验均为在23℃-25℃进行，缺血24小时后观察大鼠的行为和脑的梗塞面积，以此作为缺血程度的指标。
缺血24小时后的动物评分行为指标1、提鼠尾观察前肢曲伸情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分；2、将动物至于平地面上分别推双肩相对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降，根据下降的程度不同，分为轻、中、重三度，分别计为1、2、3分；3、物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢张力对等且有力者计为0分；同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1、2、3分；4、动物有不停地向一侧转圈者，计为1分；根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
实验动物分组和用药动物随机分为9组，假手术组、生理盐水组(NS)、注射用羟基红花黄色素A1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg组，注射用羟基红花黄色素A6.0mg/kg口服组，赋形剂组、尼莫地平0.2mg/kg组，血塞通36.0mg/Kg组，每组10只。除假手术组和注射用羟基红花黄色素A6.0mg/kg口服组，各组动物分别于缺血后30min舌下静脉给予相应药物(给药体积1mi/Kg)。注射用红花黄色素6.0mg/Kg口服组动物于手术前禁食12小时，缺血后30min灌胃给药(给药体积1ml/Kg)脑缺血面积测定动物行为评分后处死取脑，去掉嗅球、小脑、低位脑干、冠状切成5片。脑片用红四氮唑(TTC)染色。正常组织染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图象分析软件求梗塞面积比。数据分析数据用X±S表示，以组间t检验进行统计学处理。
2结果2.1羟基红花黄色素A(S-A)对脑缺血大鼠行为的影响。
结果显示大脑中动脉栓塞大鼠，给予生理盐水，表现出明显的行为障碍。给予不同剂量的羟基红花黄色素A注射液，动物行为明显低于NS对照组，且成剂量依赖。统计学分析表明，羟基红花黄色素A中剂量(3.0mg/kg)组的动物行为评分与血塞通组相比无显著性差异，羟基红花黄色素A大剂量(6.0mg/kg)组的动物行为评分低于血塞通组，与尼莫地平组相比无显著性差异，羟基红花黄色素A大剂量组口服给药的动物行为评分低于羟基红花黄色素A小剂量组(1.5mg/kg)静脉给药组，高于羟基红花黄色素A大、中剂量静脉给药组。
表明羟基红花黄色素A静脉给药具有明显改善脑缺血动物行为障碍的作用，口服给药作用弱于静脉给药(表1)。
表1羟基红花黄色素A对局部脑缺血大鼠行为的影响剂量降低率组别 行为评分(mg/kg) ％假手术 - 0 0NS 等容量10.20±0.92 0S-A小剂量1.5 9.30±1.06*##++8.7S-A中剂量3.0 7.20±0.63**##29.4S-A大剂量6.0 5.80±1.4**++43.1S-A灌胃给药6.0 8.20±0.63**##+19.7赋形剂 2410.1±0.880.9尼莫地平 0.2 4.90±1.45**51.9血塞痛 367.50±0.85**26.5n＝10与生理盐水相比*P＜0.05，**P＜0.01；与尼莫地平组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与血塞通比较+P＜0.05，++P＜0.012.2羟基红花黄色素A对脑缺血面积的影响结果显示，大鼠脑缺血后24小时，脑组织出现明显的缺血区，其面积达全脑的30％以上，脑缺血30分钟后给予羟基红花黄色素A治疗，脑缺血区明显低于NS对照组，且呈剂量依赖性。统计学分析，羟基红花黄色素A注射液中剂量(3.0mg/kg)组的大鼠脑缺血面积与血塞通相比无显著性差异，羟基红花黄色素A注射液大剂量(6.0mg/kg)组的大鼠脑缺血面积与血塞通相比较小，与尼莫地平组相比无显著性差异，羟基红花黄色素A灌胃给药(6.0mg/kg)缺血面积明显小于羟基红花黄色素A小剂量(1.5mg/kg)静脉给药组，与血塞通组相似，表明羟基红花黄色素A具有显著的抗脑缺血作用，静脉注射给药作用强于口服给药。
表2羟基红花黄色素A对脑缺血面积的影响组别剂量(mg/kg)缺血比(％)假手术-- 1.2±0.55NS等容量 3.19±9.2S-A小剂量 1.530.1±12.9##+S-A中剂量 3.013.4±6.3**+##S-A大剂量 6.04.8±2.9**++S-A灌胃给药 6.019.4±5.1**##赋形剂24 33.7±8.9##尼莫地平0.24.9±2.6**血塞痛36 19.1±7.7**##n＝10与生理盐水相比*P＜0.05，**P＜0.01；与尼莫地平组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与血塞通比较+P＜0.05，++P＜0.01结论表明羟基红花黄色素A可明显改善脑缺血大鼠的行为障碍，缩小缺血区范围，对缺血性脑损伤有明显的保护作用。
实验例2、羟基红花黄色素A对麻醉犬脑血管的影响。
1材料与方法受试样品注射用羟基红花黄色素A，山东省天然药物工程技术研究中心提供，规格10mg/支，批号2000525临用前用生理盐水配制成所需浓度的溶液；溶剂对照组2％甘露醇，石家庄制药有限集团公司，批号00033165；阳性对照组血栓通注射液，内蒙古旗卡制药厂。批号2000091112，批准文号内卫药准字(1996)第001945号。
动物健康犬36只，雌雄兼用，体重12-16Kg，由北京市海淀区通利实验动物养殖厂提供，动物合格证编号京动管犬子(96)第024号仪器TA-4000多道生理记录仪美国Gould Inc公司产品；MF-27电磁流量计日本光电公司产品。
实验分组及用药犬分为6组，空白对照组，溶剂对照组(甘露醇组)，注射用羟基红花黄色素A3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg组，及血栓通注射液25mg/kg组。给药时，各组药物均溶于100ml的生理盐水中，30分钟静脉滴注完毕。
脑血流量指标的测定动物称重后戊巴比妥钠30mg/Kg麻醉，用右颈总动脉插管法测定动脉血压。分离左颈总动脉，结扎颈外动脉，将电磁流量计探头(2mm)插入颈总动脉，垂直于颈总动脉固定，记录颈内动脉流量以代脑血流量。滴加生理盐水防止探头干燥。安放电极，记录标准肢体II导联心电图。手术后稳定30min记录各项指标，作为给药前对照。各组犬分别静脉滴注低、中、高浓度的注射用羟基红花黄色素A及血栓通注射液(30分钟滴完)，滴注5min时开始测定，每隔5min记录一次，观察记录时间为1小时，即记录给药后5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min时的颈内动脉血流量、动脉血和心率。按下列公式计算脑血管阻力脑血管阻力(Kpa/ml/min)＝血压/脑血流量。
数据分析数据用X±S表示，实验结果进行组内给药前后作用比较和给药组与对照组比较，以t检验进行统计学处理。
2结果
2.1羟基红花黄色素A对犬脑血流量的影响结果显示，甘露醇组各项指标与同时间段空白组比较无显著差异。注射用羟基红花黄色素A12mg/Kg、6mg/Kg组给药后，犬脑血流量明显增加，与给药前和甘露醇组比均有显著意义，(p＜0.05或p＜0.01)，血压、血管阻力和心率无明显变化；注射用羟基红花黄色素A3mg/Kg对脑血流量、血压、和血管阻力均无明显作用。血栓通25mg/Kg组10-30分钟时也可增加脑血流量(表3-6)结果表明注射用羟基红花黄色素A12mg/Kg、6mg/Kg组静脉给药均可明显增加麻醉犬的脑血流量，但对麻醉犬血压、血管阻力和心率无明显影响。
表3、注射用红花明苷A对犬脑血流量的影响(X±S)

与给药前相比*P＜0.05，**P＜0.01；与溶剂比较#P＜0.05，##P＜0.01表4红花明苷A对犬血压的影响(X±S)

溶剂比较*P＜0.05
表5注射用红花明苷对犬脑血管阻力的影响(X±S)

溶剂比较*P＜0.05表6、注射用红花明苷对犬心率的影响(X±S)

溶剂比较*P＜0.05
实验例3、羟基红花黄色素A对大鼠体内血栓形成的影响1、材料和方法受式样品注射用羟基红花黄色素A，山东省天然药物工程技术中心提供，规格10mg/支，批号20000525，临用前用生理盐水配制成所需浓度的溶液；阳性对照组肝素钠，规格1g/支，江苏省常州市光明生物化学研究所产品，批号991008，分子量6000-20000，效价每1mg不少于140单位。
动物普通级WISTAR大鼠，雄性，体重230-250克，山东绿叶制药股份有限公司动物实验中心，合格证号鲁动质字9803号。
仪器YBZ-Z真空恒温干燥箱天津药典标准仪器厂产品2、注射用羟基红花黄色素A对大鼠体内血栓形成的影响响实验方法2.1、对动-静脉旁路血栓形成的影响将大鼠用水合氯醛(350mg/Kg，I.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉及左颈外静脉，在聚乙烯管中放入一跟长5cm已称重的七号丝线。以含肝素钠(50U/Ml)的生理盐水溶液充满聚乙烯管，聚乙烯管的一端插入左颈外动脉，另一端插入右颈总动脉。打开夹闭的血管的动脉夹，使血液从右总静脉流入聚乙烯管后返回左颈外静脉。开放血流15min后迅速取出丝线称重，减去丝线重量即血栓湿重。
实验分组及用药动物随机分为5组，生理盐水，羟基红花黄色素A1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg、肝素钠0.2mg/kg，每组10只。各组动物分别于术前15min舌下静脉给予相应的药物(给药体积1ml/kg)2.2对大鼠静脉血栓形成的影响大鼠用水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉后开腔分离下腔静脉，与左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉，缝合腹部。24小时后重新开腹，在结扎处下方2cm处夹闭血管，剖开管腔，取出血栓，60度真空干燥24小时后，称重。
实验分组及用药动物随机分为5组，生理盐水，羟基红花黄色素A1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg、肝素钠0.2mg/kg，每组10只。各组动物分别于术前6小时舌下静脉给予相应的药物(给药体积1ml/kg)数据分析数据用X±S表示，以组间t检验进行统计学处理。
3.结果3.1羟基红花黄色素A对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响。
表7羟基红花黄色素A对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响组别 剂量 血栓抑制率(mg/Kg)(mg)(％)NS 等容量 31.80±1.97 0S-A小剂量1.525.63±5.86**## 20.3S-A中剂量3.017.94±2.39**## 43.6S-A大剂量6.014.59±1.31**#54.2肝素钠 0.212.08±1.99** 62.1n＝10与生理盐水相比*P＜0.05，**P＜0.01；与肝素钠组比较#P＜0.05，##P＜0.01结果显示羟基红花黄色素A可呈剂量依赖性抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成6.0mg/kg羟基红花黄色素的作用尤为明显，抑制率达到了54.2％，当于肝素钠作用强度的87.3％(表7)3.2羟基红花黄色素A对大鼠血栓形成的影响结果显示羟基红花黄色素A可成剂量依赖性减轻大鼠静脉血栓的重量，6.0mg/kg羟基红花黄色素的作用尤为明显，抑制率达到了64.5％，当于肝素钠作用强度的86.2％(表8)表8羟基红花黄色素A对大鼠血栓形成的影响组别 剂量 血栓 抑制率(mg/Kg)(mg) (％)NS 等容量 15.29±2.540S-A小剂量1.511.21±1.41**##26.7S-A中剂量3.08.17±0.77**## 48.3S-A大剂量6.05.43±1.30**#64.5肝素钠 0.23.84±1.30** 74.9n＝10与生理盐水相比*P＜0.05，**P＜0.01；与肝素钠组比较#P＜0.05，##P＜0.01实验例4羟基红花黄色素A对血小板功能和数目的影响1材料和方法受试样品注射用羟基红花黄色素A，山东省天然药物工程技术中心提供，规格10mg/支，批号20000525，临用前用生理盐水配制成所需浓度的溶液；阳性对照组乙酰水杨酸，烟台第二制药厂，鲁卫药准字(1995)第111011号批号2000502，规格25mg/片；二磷酸腺苷(ADP)美国SIGMA公司产品，生理盐水配置，100μl；枸橼酸钠天津天河化学试剂厂，分析纯，以蒸馏水配制3.8％溶液备用。
动物清洁级Wistar大鼠，雄性，体重230-250g，青岛实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200002004号。
仪器DL-4000B型低速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂；LBY-NJ2血小板计数仪北京普利生公司产品；JT-IR血细胞计数仪美国库尔特公司产品。
2羟基红花黄色素A对大鼠血小板聚集的影响大鼠随机分为5组，即生理盐水，羟基红花黄色素A 25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml；乙酰水杨酸30μg/ml、每组10只。每只大鼠心脏取血3ml，以3.8％枸橼酸钠抗凝。650r/min离心10分钟，移出上层血浆即富血小板血浆(PRP)0.5ml，余下部分再以3000r/min离心10分钟，上层泛请即为富血小板血浆(PPP)。调整PRP的血小板数＜20000万个/ml，移取0.3ml调整好浓度的血小板至比浊管内，将比浊管放入用PPP调零后的血小板聚集仪中，加入10μl相应的药物，37度温育3min后加入10μl的ADP，同时开启血小板聚集仪进行记录，记录时间为6min，打印记录结果。
3、羟基红花黄色素A对大鼠给药前、后血小板数目的影响大鼠随机分为4组，生理盐水、羟基红花黄色素A 1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg。水合氯醛麻醉(350mg/kg，i.p.)后，先从尾静脉取血0.45ml；再于舌下静脉给药30min后，尾静脉采血0.45ml。两次所取血样均加入0.05ml 3.8％的枸橼酸钠抗凝。全部血样用血细胞计数仪测定大鼠给药前、后血小板数目。
数据分析数据用X±S表示，以组间t检验进行统计学处理。
4结果4.1羟基红花黄色素A对大鼠给药前、后血小板聚集的影响。
结果显示，不同剂量的注射用羟基红花黄色素A(S-A)均可抑制由ADP诱导的大鼠血小板聚集，与生理盐水比较有高度显著性差异，小、中、大剂量的羟基红花黄色素A对血小板聚集的抑制率分别为19.5％、36.5％、41.8％，其中大剂量的羟基红花黄色素A的作用强度达到乙酰水杨酸作用强度的77.5％(表9)表9.注射用羟基红花黄色素对大鼠血小板聚集的影响(X±S)组别 终浓度 最大聚集率 抑制率(μg/ml) ％ (％)NS 等容量 39.03±6.000S-A小剂量25.0 31.43±2.27**##19.5S-A中剂量50.0 24.79±4.61**##36.5S-A大剂量100.022.72±4.22**# 41.8乙酰水杨酸 30.0 15.26±2.23**60.9n＝10与生理盐水相比*P＜0.05，**P＜0.01；与乙酰水杨酸组比较#P＜0.05，##P＜0.014.2对大鼠给药前后血小板数目的影响。
结果显示给药前与给药后大鼠自身血小板数目无显著性差异，表明S-A对大鼠血小板数目无明显影响。(表10)。
表10羟基红花黄色素A对大鼠给药前后血小极数目的影响(X±S)组别 剂量动物数血小板数目(×109/L)(mg/Kg) (n) 给药前给药后NS 等容量7 666±152649±118S-A小剂量1.5 10632±84 670±82S-A中剂量3.0 10641±113626±120S-A大剂量6.0 8 705±122705±95结论不同剂量的注射用羟基红花黄色素A均可抑制ADP诱导的血小板聚集，对血小板数目无明显影响。
实验例5、红花命苷A对小鼠凝血时间的影响。
1、材料和方法受式样品注射用羟基红花黄色素A，山东省天然药物工程技术中心提供，规格10mg/支，批号20000525，临用前生理盐水配制成所需浓度的溶液阳性对照组肝素钠，规格1g/支，江苏省常州市光明生物化学研究所产品，批号991008，分子量6000-20000，效价每1mg不少于140单位。
动物普通级昆明小鼠，雄性，体重18-22克，山东绿叶制药股份有限公司动物实验中心，合格证号鲁动质字9803号。
2、羟基红花黄色素A对小鼠凝血时间的影响昆明种80只，称重，标记，按体重随机分为5组生理盐水组(NS)羟基红花黄色素-A 4.5mg/kg、9.0mg/kg、18.0mg/kg，肝素钠0.6mg/kg。各组动物分别于尾静脉注射相应的药物，(给药体积10mg/kg)。15min后，眼眶取血，用玻片法测定凝血时间；数据分析数据用X±S表示，以组间t检验进行统计学处理。
结果显示，注射用羟基红花黄色素A可呈剂量依赖性明显延长小鼠凝血时间，18.0mg/kg注射用羟基红花黄色素的作用尤为明显，相当于肝素钠作用强度的76.0％(表11)。
表11羟基红花黄色素A对小鼠凝血时间的影响(X±S)组别剂量(mg/Kg) 凝血时间(秒)NS等容量54.87±9.52S-A小剂量 4.5 110.25±12.11**##
S-A中剂量 9.0139.38±26.59**##S-A大剂量 18.0 289.69±50.50**##肝素钠0.2405.56±38.15**n＝10与生理盐水相比*P＜0.05，**P＜0.01；与肝素钠组比较#P＜0.05，##P＜0.01结论羟基红花黄色素A明显延长小鼠凝血时间且呈剂量依赖性。
实验例6、羟基红花黄色素A对大鼠血液流变性的影响1、材料和方法受式样品注射用羟基红花黄色素A，山东省天然药物工程技术中心提供，规格10mg/支，批号20000525，临用前生理盐水配制成所需浓度的溶液；阳性对照药注射用降酰酶，中美合资烟台北方制药有限公司产品，规格5U/支，批号991128，临用前生理盐水配制成所需浓度的溶液。
动物普通级WISTAR大鼠，雄性，体重350-430克，山东绿叶制药股份有限公司动物实验中心，合格证号鲁动质字9803号。
仪器LBY-N6A血小板计数仪北京普利生公司产品。
2、大鼠血液流变性指标测定WISTAR大鼠50只，称重，标记，按体重随机分为五组生理盐水组(NS)羟基红花黄色素A(S-A)1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg，降纤酶0.45U/kg。各组动物水合氯醛(350mg/kg)麻醉，分别于舌下静脉注射相应药物(给药体积1ml/kg)。15min后，心脏采血5ml/只，以0.5％肝素抗凝，用血液流变学测试仪测定全血粘度、血浆粘度等指标。
数据分析数据分析数据X±S表示，以组间t检验进行统计学处理。
结果显示不同剂量的羟基红花黄色素A均可降低大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积，6.0mg/kg注射用羟基红花黄色素A作用尤为明显，其降低血粘度的作用强度与降纤酶相当(表12)。
表12羟基红花黄色素A对大鼠血液流变性的影响(X±S)组别 剂量全血粘度(mPa.S)血浆粘度红细胞压积低切变率 低切变率(mPa.S)NS 等容量21.71±4.779.23±2.132.73±0.5357.38±4.68S-A小剂1.5mg/kg13.57±2.50**##4.73±0.43**##1.30±0.08**51.43±3.46**##S-A中剂量3.0mg/kg13.34±2.19**##4.92±0.65**##1.28±0.07**49.13±4.29**#S-A大剂量6.0mg/kg11.61±0.90**# 4.51±0.40**# 1.22±0.07**47.01±2.32**#降纤酶 0.45U/kg9.85±1.78** 4.25±0.49**1.27±0.05**43.92±3.64**n＝10与生理盐水相比*P＜0.05，**P＜0.01；与肝素钠组比较#P＜0.05，##P＜0.01
结论不同剂量的注射用羟基红花黄色素A均可降低大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积。实验例7、羟基红花黄色素A的抗自由基的活性研究1、药物与试剂羟基红花黄色素A由山东天然药物工程技术研究中心提供；1，1，3，3-四乙氧基丙烷(JEP)，NADH，PMS，NBT，为SIGMA产品；硫代巴比妥酸(TBA)三氯乙酸(TCA)为国产分析纯。
动物SD雄性大鼠数只，200-250克昆明种小鼠20只，18-22克，雌雄各半，由陕西省中医药研究院提供。
2、方法O·2-生成及测定O·2-由NADH-PMS-NBT系统(16mmol/L，PH8.0的Tris-HCL缓冲液，内含NADH 73μmol/L，PMS 15μmol/L，NBT 50μmol/L)产生，空白管不加PMS，对照管不加羟基红花黄色素A(S-A)。S-A的终浓度为25、50、100、200、400μg/ml总体积为3ml于560nm处比色测定，并计算抑制率。
·OH生成及测定由于·OH可特异的是碱性桃红T腿色，据腿色的幅度可衡量·OH的生成量，实验按文献进行，反应总体积5ml其中碱性桃红T(70μg/ml)1ml，3％H2O21ml，2mmol/LEDTANa-Fe(II)2ml，再加一定量羟基红花黄色素A(S-A)和0.15mmol/L PH7.4的PBS，混匀，37℃保温30min，对照组以H2O代替药品，空白组以H2O代替药品和EDTANa2-Fe(II)，520nm处比色，并计算抑制率。
3、肝微粒体脂质过氧化物LPO的测定昆明种小鼠20只，处死，迅速分离肝组织，用冰冷的0.25mol/L的蔗糖溶液制成20％的匀浆，9800g离心20min分钟沉淀再洗一次，合并上清夜，并于96000g离心40min，沉淀用冰冷的0.15mol/L KCl洗两次，最后悬浮与0.15mol/L KCl中，LOWRRY法测定蛋白。在0.2mol/L磷酸钾缓冲液(PH7.4)含微粒体蛋白200-400μg/ml，硫酸亚铁10μmol/L，VITC 0.1mmol/L及不同浓度的羟基红花黄色素A(S-A)，37℃振荡温浴1h。测定LPO。
结果
SAF-A的体外清除O·2-作用SAF-A能明显清除NADH-PMS-NBT系统产生的O·2-，560nm处吸收值明显降低，呈量效关系(表13)表13 Scavenging activities of saf-A for superoxide O·2-，produced by NADH-PMS-NBTsystemConcn/ O·2-generation/ lnhibition rateμg/mlA560％control 0483±0.017250.330±0.013*31.68500.311±0.008*35.61100 0.206±0.010**57.35200 0.116±0.009**75.98400 0.055±0.006***88.61N＝4X±S，*P＜0.05**P＜0.001***P＜0.001VScontrolS-A的体外清除·OH作用S-A对能明显清除EDTANa2-Fe(II)-H2O2系统产生的·OH，且呈量效关系。
(表14)表14 Scavenging activities of saf-A for by·OH EDTANa2-Fe(II)-H2O2systemConcn/ O·2-generation/lnhibition rateμg/ml A520％basal0.881±0.016***control0.052±0.00725 0.088±0.013 4.3450 0.122±0.009*8.441000.196±0.012**17.372000.317±0.006**31.974000.603±0.012***69.72N＝4X±S，*P＜0.05**P＜0.001***P＜0.001VScontrol3.3 S-A对小鼠肝微粒体脂质过氧化的影响S-A能明显抑制Fe2++VitC系统产生·OH对小鼠肝微粒体刺激所引起的脂质过氧化反应，LPO含量降低，且呈量效关系(表15)表15 Effect of Saf-A on microsomal lipid peroxidationConch/ LPOformation/ lnhibition rateμg/ml Nmol/g％basal39.32±3.68***control188.54±12.265176.32±13.39 8.211.0168.47±11.66*13.472.0151.49±12.92**24.854.0113.64±9.24**50.218.055.72±7.86***89.01N＝4X±，*P＜0.05**P＜0.001***P＜0.001VScontrol实验例8、羟基红花黄色素A对脑缺血所致大鼠脑线粒体损伤的保护作用1、材料与方法药品、试剂与仪器羟基红花黄色素A由山东省天然药物工程技术研究中心提供；邻苯二甲醛(o-phthalaldekhyde，OPT)为Fluka产品；二苯基己三烯(diphenylhexa-triene，DPH)为Sigma产品。
低温高速离心机美国Backman公司751；分光光度计上海第三仪器厂；原子吸收分光光度计日本岛津公司Z28000型；SOD)、GSH-Px、MDA测定试剂盒南京建成生物科技公司；Ca2+测定试剂盒北京中生生物工程高技术公司。
1、实验动物分组、模型建立及大脑皮层线粒体(Mit)的制备取40只Wistar大鼠(♂)随机分为对照组(iv NS)、模型组(iv NS)、尼莫地平组(iv Nim，0.3mg·Kg-1)、羟基红花黄色素A(iv S-A，20mg·Kg-1)。每组10只，结扎双侧颈总动脉造成脑缺血，对照组只作颈总动脉分离手术，各组均于手术前15min iv相应药物，手术后24h再同剂量给药一次，60min后处死动物，迅速取大脑，以冰浴的PBS(10mmol·L-1pH7.4，含250mmol·L-1蔗糖，5mmol·L-1EDTA)，冲洗干净，小心剥取大脑皮层，精确称重，并以PBS为介质制备1％匀浆，800rpm低温离心15min，取上清14000rpm离心15min，沉淀即为Mit。再以PBS洗涤二次，Lowrry法进行蛋白定量(4℃操作，-20℃保存)。
脑Mit膜脂流动性的测定膜脂流动性采用荧光偏振度法测定，取脑Mit悬液1ml(蛋白含量0.5mg·mL-l)，加入2μmol·L-1DPH溶液3ml，25℃温浴30min，测定荧光偏振度P，激发波长362nm，发射波长432nm.按下式计算P＝(I-GI⊥)/(I+GI⊥)；η＝2P/0.46-P式中I和I⊥分别代表与激发偏振光振动方向平行垂直时的荧光偏振光强度，G为校正因子。膜流动性用荧光偏振度P，微粘度η表示[5]。微粘度越大，膜流动性越小。
脑Mit膜总磷脂(PL)和胆固醇的测定总PL按Chien法测定[6]，CH按文献[7]测定；脑Mit抗氧化酶及MDA含量的测定，采用试剂盒法测定。
脑Mit Ca2+测定取脑Mit悬液2mL，14000rpm离心15min得沉淀，在沉淀中加入HNO3lmol·L-1，室温振荡24h，1500rim离心10min，取上清适当稀释，原子分光光度计422.7nm测Ca2+(以CaCO3为标准)[8]。
结果1、脑Mit膜流动性的变化结果显示，脑缺血可导致Mit膜的流动性显著降低，而羟基红花黄色素A(S-A)可明显抑制Mit膜流动性的降低(表16)。
表16羟基红花黄色素A对脑缺血.大鼠脑Mit膜流动性的影响(X±S，n＝10)组别 荧光偏振度P微粘度ηPa·s对照组 0.225±0.022.09±0.18模型组 0.344±0.02**4.31±0.58**Nim组0.246±0.03Δ2.74±0.32ΔS-A组0.253±0.02Δ2.46±0.37Δ**P＜0.01VS对照组；ΔP＜0.05 VS模型组2、脑Mit膜总磷脂(PL)和胆固醇(CH)的变化结果显示，脑缺血损伤导致Mit膜磷脂层破坏，表现为PL含量降低，CH含量升高，PL/CH数值降低，而S-A对此有明显的拮抗作用。提示S-A能降低膜磷脂的降解(表17)。表17羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑Mit膜总磷脂(PL)和胆固醇(CH)的影响(X±s，n＝10)组别膜总磷脂胆固醇膜总磷脂/胆固醇mol·g-1Promol·g-1Pro对照组408.73±45.66 62.45±11.3526.44±1.06模型组287.78±20.81**92.15±10.54**2.633±0.08**Nim组 364.24±25.12Δ73.78±9.64Δ4.86±1.21ΔS-A组 382.36±43.29ΔΔ70.47±11.47Δ5.01±1.33Δ**P＜0.01VS对照组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01VS模型组3、脑Mit SOD、GSH-Px活性、MDA含量的变化结果显示，脑缺血损伤可降低脑Mit SOD、GSH-Px活性，升高MDA含量；而S-A可明显抑制SOD、GSH-Px活性的降低、MDA含量的升高，说明S-A有抗氧化活性(表18)。表18羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑Mit SOD、GSH-Px、MDA的影响(X±s，n＝10)组别SODGSH-Px MDAnu·mg1ProU·mg Pro.min-1nmol·L1mg-1Pro对照组32.36±5.58 19.64±3.72 11.73±1.82模型组15.24±4.46**10.08±1.13**28.56±2.66**
Nim组26.47±6.38ΔΔ13.26±3.01Δ17.32±2.01ΔS-A组28.16±8.12ΔΔ15.64±1.86Δ18.29±1.36Δ**P＜0.01VS对照组ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01VS模型组4、脑Mit Ca2+含量的变化结果显示，脑缺血可导致Mit Ca2+摄入量增加，而S-A可拮抗Ca2+的摄入，提示S-A可能具Ca2+拮抗剂样作用(表19)。
表19羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑Mit Ca2+的影响(X±s，n＝10)组别 Ca2+(nmol·g-1Pro)对照组 13.38±1.64模型组 34.16±5.68**Nim组20.39±6.21ΔSaf-A组24.57±3.34ΔΔ**P＜0.01VS对照组；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01VS模型组实验例9、羟基红花黄色素A对大鼠缺血后脑细胞凋亡的影响1材料与方法羟基红花黄色素A由山东省天然药物工程技术研究中心提供(含量为95％)；蛋白酶K由Sigma公司出品；Tunel法试剂盒南京聚力医学研究所，进口分装；Wistar雄性大鼠40只，200～250g，由陕西省中医药研究院提供。
实验方法取40只Wistar大鼠(♂)随机分为对照组(iv NS)、模型组(ivNS)、尼莫地平组(iv Nim，0.3mg·Kg-1)、羟基红花黄色素A(iv S-A，20mg·Kg-1)。每组10只，结扎双侧颈总动脉造成脑缺血，对照组只作颈总动脉分离手术，各组均于手术前15min iv相应药物，手术后24h再同剂量给药一次，60min后处死动物，在固定部位取双侧大脑皮质组织，一侧脑皮质组织10％甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，每例切片二张，分别进行HE染色镜检和Tunel法测凋亡细胞数。另一侧皮质匀浆后测DNA片端含量百分率。[3]石蜡切片HE染色脑皮质组织10％甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm切片，脱蜡至水后，苏木素染色5min，双蒸水洗片1min，盐酸乙醇分化30s，温水浸泡5min后置伊红液2min，干燥封片，光镜下观察。Tunel法测定细胞凋亡[4]按试剂盒提供方法操作。干燥封片后置显微镜下观察分析被染成蓝紫色的凋亡细胞(灶状分布的阳性细胞是坏死细胞，散在分布的为凋亡细胞)，每张切片计数10个不同高倍视野中凋亡细胞数。
DNA片端百分率测定100g脑皮质组织加入1ml冰冷的的细胞裂解液(含5.0g.L-1Tritox x-100，1.0g.L-1EDTA，40mg.L-1蛋白酶K，5mmol.L-1Tris，pH7.8)制成匀浆液，室温下20min后离心(20000r.min-1，30min)，将上清液取出后，在沉淀物中加入细胞裂解液重新使沉淀物悬浮(体积与上清液相等)。用二苯胺试剂在959nm处分别测定上清液片端DNA和沉淀物中高相对分子质量DNA的吸光度，计算片端DNA占高相对分子质量DNA的百分率。
2结果2.1羟基红花黄色素A(S-A)对脑缺血致脑皮质细胞凋亡的影响HE染色光镜观察大鼠双侧CCA结扎24h，其脑组织常规石蜡切片，HE染色后，胞浆呈淡红色，核呈蓝色，其间有单个散在凋亡细胞，表现为细胞萎缩，核固缩，染色质凝集呈致密浓染块状或颗粒状。NS组凋亡细胞数明显多于S-A组。
Tunel法大鼠双侧CCA结扎24h后，脑组织中有凋亡细胞出现，光镜下表现为阳性细胞为淡红色胞浆中有被染成兰紫色的细胞核，而阴性细胞仅见淡红色的胞浆。阳性细胞为散在分布的凋亡细胞。与NS组比较，S-A组缺血后脑细胞凋亡数有显著减少(表20)。
表20羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑细胞凋亡数的影响(X±s，n＝10)组别细胞凋亡数(10个视野)对照组 2.1±0.5模型组 48.7±16.8*Nim组20.3±12.6ΔΔS-A组23.7±13.4ΔΔ**P＜0.01VS对照组；ΔΔP＜0.01VS模型组S-A对脑缺血DNA碎片的影响结果如表16所示，与正常不缺血大鼠组比较，缺血组脑细胞DNA碎片含量百分率有显著增高，而S-A则能显著降低DNA碎片的百分率。(表21)表21羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑细胞凋亡数的影响(X±s，n＝10)组别 DNA碎片％对照组 3.9±2.5模型组 20.6±6.3**Nim组10.4±3.6ΔΔS-A组12.7±5.2ΔΔ**P＜0.01VS对照组；ΔΔP＜0.01VS模型组实验例10、羟基红花黄色素-A对犬急性心肌缺血的影响将实验犬用戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，气官插管，连接人工呼吸机，开胸，结扎冠脉15分钟后记录各项指标，舌静脉给药，给药180分钟后取出心脏，切片染色，数码相机照相后以计算机计算梗死面积及梗死百分率。结果显示羟基红花黄色素S-A可明显减少结扎冠状动脉引起的心脏梗死面积，尤以6mg/kg给药更为明显。见表22表22羟基红花黄色素-A对犬心肌缺血面积的影响(n＝10.X±SD)组别剂量梗死区/心脏(％)梗死区/心室(％)生理盐水5ml/kg8.53±3.31 13.81±3.97心得安1mg/kg3.04±1.63※※4.60±2.04※羟基红花黄色素-A3mg/kg3.89±0.59※7.69±0.53※羟基红花黄色素-A6mg/kg2.27±0.62※※4.50±1.11※※与生理盐水组比较※P＜0.05，※※P＜0.01实验例11、羟基红花黄色素(S-A)对垂体后叶素所致离体大鼠心脏心肌缺血的影响取体重200±20g的大鼠80只(雌雄各半)，随机分为4组。乌拉坦麻醉后，记录II导联与胸前导联心电图。舌静脉注射受试药物后30分钟，再舌静脉注射0.5U垂体后叶素，连续记录给垂体后叶素前及后5分钟内的心电图，出现下列指征之一者为心肌缺血阳性(1)T波升高1.5mv以上；(2)T波低平(降低原T波高度50％以上)；(3)T波双向倒置；(4)S-T水平下移0.5mv；(5)心率不齐。结果显示，与硝酸甘油作用相似，羟基红花黄色素(S-A)可明显降低垂体后叶素所致大鼠心肌缺血的阳性率。(见表23)表23羟基红花黄色素-A对大鼠心肌缺血的影响(n＝20，X±SD)组别剂量心肌缺血阳性率(％)生理盐水5ml/kg80硝酸甘油5mg/kg35※※羟基红花黄色素-A3mg/kg40※羟基红花黄色素-A6mg/kg35※※与生理盐水组比较即※P＜005，※※P＜0.0权利要求
1.一种羟基红花黄色素A在制备治疗、预防心脑血管疾病方面的药物用途。
2.按照权利要求1所述用途，其特征为制备治疗、预防与凝血、血栓、血流量有关的心脑血管疾病的药物用途。
3.按照权利要求2所述用途，其特征为制备治疗、预防血栓形成、自由基所致和血小板激活因子诱发的心脑血管疾病的药物用途。
4.按照权利要求1-3所述用途，其特征为制备治疗、预防缺血性心血管疾病的药物用途。
5.按照权利要求4所述用途，其特征为制备治疗、预防与垂体后叶素诱发、异丙肾上腺素诱发的心肌缺血的有关心血管疾病的药物用途。
6.按照权利要求1-3所述用途，其特征为制备治疗、预防缺血性脑血管疾病的药物用途。
7.按照权利要求6所述用途，其特征为制备治疗、预防Ca2+和自由基含量升高的及致线粒体损伤的缺血性脑血管疾病的药物用途。
8.按照权利要求6所述用途，其特征为制备治疗、预防缺血性神经原变性的脑血管疾病的药物用途。
9.按照上述任一权利要求所述用途，其特征为制备治疗、预防动脉硬化、冠心病、脑血栓、脑缺血、心绞痛、心肌梗塞、静脉炎、神经性皮炎疾病药物用途。
10.一种按照权利要求1所述用途的羟基红花黄色素A的制备方法，其是用下列方法从红花中制得的1)将红花用水冷浸24h煎煮回流提取50-90分钟，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.10-1.252)将浓缩液中加入乙醇至含醇量80％，在4℃条件下沉淀24小时，过滤除去沉淀，取上清液，挥净乙醇并浓缩至相对密度为1.15-1.203)向浓缩液中加入5-10倍的水，在4℃条件下，沉淀12-24小时，离心除去沉淀4)上述离心液经大孔吸附树脂柱层析，先用去离子水洗脱至Moliah反应及茚三酮反应呈阴性，然后继续用去离子水洗脱4-6个柱体积并收集洗脱液；5)将上述洗脱液经聚酰胺吸附，极性溶剂甲醇或乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃条件下减压浓缩除去甲醇或乙醇，剩余水溶液冷冻干燥，得到桔黄色无定形粉末，即为本发明羟基红花黄色素A。
11.按照权利要求10所述的方法，其中羟基红花黄色素A是采用下列方法制得的取红花生药，加入其重量10-15倍水，煮沸50分钟，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.25，加乙醇至含醇量为80％，4℃沉淀24小时，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.20，加10倍量的水，4℃沉淀24小时，离心，取上清液，用重量为其40％的大孔吸附树脂吸附，用去离子水洗脱3个柱体积，然后继续用去离子水洗脱5个柱体积，收集洗脱液，用重量为其10％的聚酰胺吸附，先用去离子水洗至无色，然后用95％乙醇洗8个柱体积，收集洗脱液，旋转蒸发器上浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到羟基红花黄色素A。
12.一种治疗、预防心脑血管疾病的方法，其特征为将权利要求1所述有效剂量的羟基红花黄色素A和药学上可接受的不同载体作成注射液、大输液、冻干粉、口服剂型对患者给药。
全文摘要
本发明公开了红花提取物中羟基红花黄色素A在制备治疗、预防心脑血管疾病方面的药物新用途。
文档编号A61P9/10GK1422616SQ0212560
公开日2003年6月11日 申请日期2002年7月24日 优先权日2001年12月6日
发明者傅风华, 李桂生, 马成俊, 朱海波, 田京伟, 王振华, 张达磊 申请人:长春三真实业有限公司