作为蛋白激酶抑制剂的3-(4-酰氨基吡咯-2-基亚甲基)-2-二氢吲哚酮衍生物的制作方法

专利名称：作为蛋白激酶抑制剂的3-(4-酰氨基吡咯-2-基亚甲基)-2-二氢吲哚酮衍生物的制作方法
优先权申请本申请要求2001年8月15日提交的临时申请60/312,361和2001年2月15日提交的60/268,683的优先权，这两份申请的全部内容引用在此作为参考。
背景技术：
发明领域本发明涉及某些3-(4-酰氨基吡咯-2-基亚甲基)-2-二氢吲哚酮衍生物，它们调制蛋白激酶(PKs)的活性。本发明的化合物因此可用于治疗涉及异常PK活性的功能障碍。还公开了包含这些化合物的药物组合物、利用包含这些化合物的药物组合物治疗疾病的方法和制备它们的方法。
技术现状PKs是催化蛋白质酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上羟基磷酸化作用的酶。这种看来似乎简单的活性的后果是惊人的；细胞生长、分化和增殖、也就是事实上细胞生命的所有方面都在一种或另一种方式上依赖于PK活性。此外，异常的PK活性已经涉及功能障碍的主体，从相对无生命威胁的疾病、例如牛皮癣一直到极为恶性的疾病、例如成胶质细胞瘤(脑癌)。
PKs适宜分为两类，蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)。
PTK活性的一个主要方面是它们牵涉生长因子受体。生长因子受体是细胞表面蛋白。当通过生长因子配体结合时，生长因子受体转化为活性形式，与细胞膜内表面上的蛋白质发生相互作用。这引起受体和其他蛋白质酪氨酸残基的磷酸化作用，和在细胞内部与各种胞质发信号分子生成复合体，继而影响大量细胞反应，例如细胞分裂(增殖)、细胞分化、细胞生长、代谢效应对细胞外微环境的表达等。关于更完全的讨论，参见Schlessinger和Ullrich，Neuron，9303-391(1992)，引用在此作为参考，包括所有的附图
，仿佛完整描述在这里一样。
具有PTK活性的生长因子受体已知称为受体酪氨酸激酶(RTKs)。它们包含一大家族具有多变的生物活性的跨膜受体。目前，已经鉴别了至少十九(19)种不同的RTKs亚家族。一个实例是被称为“HER”的RTK亚家族，它包括EGFR(表皮生长因子受体)、HER2、HER3和HER4。这些RTKs由一个细胞外葡糖基化配体结合结构域、一个跨膜结构域和一个细胞内胞质催化结构域构成，其能够磷酸化蛋白质上的酪氨酸残基。
另一种RTK亚家族由胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子I受体(IGF-1R)和胰岛素受体相关性受体(IRR)组成。IR和IGF-1R与胰岛素、IGF-I和IGF-II发生相互作用，生成由两个完全细胞外的葡糖基化α亚单位与两个跨越细胞膜并且含有酪氨酸激酶结构域的β亚单位构成的杂四聚物。
第三种RTK亚家族被认为血小板类生长因子受体(PDGFR)组，它包括PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、c-kit和c-fms。这些受体由葡糖基化细胞外结构域组成，后者由不定数量的免疫球蛋白样环和细胞内结构域构成，其中酪氨酸激酶结构域被不相关的氨基酸序列所中断。
由于与PDGFR亚家族的相似性，另有一组有时也被归入这一类，它是胚胎肝激酶(flk)受体亚家族。这一组据信由激酶插入片段结构域-受体胚胎肝激酶-1(KDR/FLK-1，VEGF-R2)、flk-1R、flk-4和fms样酪氨酸激酶-1(flt-1)组成。
酪氨酸激酶生长因子受体家族的另一个成员是成纤维细胞生长因子(FGF)受体亚组。这一组由四种受体FGFR 1-4和七种配体FGF 1-7组成。尽管尚无确切的定义，不过似乎这些受体由葡糖基化细胞外结构域和细胞内结构域构成，前者含有不定数量的免疫球蛋白样环，后者的酪氨酸激酶序列被不相关的氨基酸序列所中断。
酪氨酸激酶生长因子受体家族的另一个成员是血管内皮生长因子(VEGF)受体亚组。VEGF是二聚的糖蛋白，与PDGF相似，但是具有不同的体内生物功能和靶细胞特异性。确切而言，VEGF目前被认为在血管发生和血管生成中扮演不可缺少的角色。
更完全的已知RTK亚家族列表描述在Plowman等，DN & P，7(6)334-339(1994)中，引用在此作为参考，包括所有的附图，仿佛完整描述在这里一样。
除了RTKs以外，还存在一个完全细胞内的PTKs家族，被称为“非受体酪氨酸激酶”或“细胞酪氨酸激酶”。本文将使用后者命名，简称CTK。CTKs不含细胞外与跨膜结构域。目前，已经鉴别了11种亚家族(Src，Frk，Btk，Csk，Abl，Zap70，Fes，Fps，Fak，Jak和Ack)中的24种以上CTK。Src亚家族迄今为止似乎是最大一组的CTK，包括Src，Yes，Fyn，Lyn，Lck，Blk，Hck，Fgr和Yrk。关于更详细的CTK讨论，参见Bolen，Oncogene，82025-2031(1993)，引用在此作为参考，包括所有的附图，仿佛完整描述在这里一样。
丝氨酸/苏氨酸激酶STK象CTK一样，主要是细胞内的，不过也有一些STK类型的受体激酶。STK是最普遍的cytosol激酶；也就是在除胞质细胞器和细胞支架以外的那部分细胞质中发挥其功能的激酶。cytosol是细胞内这样一种区域，在那里发生很多细胞的中间代谢和生物合成活动；例如，正是在cytosol中蛋白质是在核糖体上被合成的。
RTK、CTK和STK都已牵涉病原性条件的主体，尤其包括癌症。其他与PTK有关的病原性条件非限制性地包括牛皮癣、肝硬化、糖尿病、血管生成、再狭窄、眼疾病、类风湿性关节炎与其他炎症、免疫功能障碍(例如自体免疫疾病)、心血管疾病(例如动脉粥样硬化)和各种肾功能障碍。
关于癌症，为了解释驱使肿瘤发育的过度细胞增殖而形成了两种主要的假说，涉及已知受PK调制的功能。也就是说，有人已经提出恶性细胞生长是由控制细胞分裂和/或分化的机理发生故障所导致的。有人已经指出大量原致癌基因的蛋白产物参与调制细胞生长与分化的信号转导途径。这些原致癌基因的蛋白产物包括细胞外生长因子、跨膜生长因子PTK受体(RTK)、胞质PTK(CTK)和cytosol STK，见上讨论。
鉴于PK相关性细胞活动与多种人类功能障碍之间的明显联系，人们为了鉴别调制PK活性的方式而付出巨大努力也就不足为奇了。有些努力牵涉仿生化学方法，使用大分子模仿参与实际细胞过程的那些(例如突变配体(U.S.App.No.4,966,849)；可溶性受体和抗体(App.No.WO 94/10202，Kendall和Thomas，Proc.Nat′1 Acad.Sci.，9010705-09(1994)，Kim等，Nature，362841-844(1993))；RNA配体(Jelinek等，Biochemistry，3310450-56)；Takano等，Mol.Bio.Cell4358A(1993)；Kinsella等，Exp.Cell Res.19956-62(1992)；Wright等，J.Cellular Phys，15244857)和酪氨酸激酶抑制剂(WO 94/03427；WO92/21660；WO 91/15495；WO 94/14808；U.S.Pat.No.5,330,992；Mariani等，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，352268(1994))。
除此以外，人们为了鉴别充当PK抑制剂的小分子也已进行了尝试。例如，双-单环、二环与杂环的芳基化合物(PCT WO 92/20642)、亚乙烯基氮杂吲哚衍生物(PCT WO 94/14808)和1-环丙基-4-吡啶基喹诺酮(U.S.Pat.No.5,330,992)已被描述为酪氨酸激酶抑制剂。苯乙烯基化合物(U.S.Pat.No.5,217,999)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(U.S.Pat.No.5,302,606)、喹唑啉衍生物(EP App.No.0 566 266 A1)、硒杂吲哚与硒化物(PCT WO 94/03427)、三环多羟基化合物(PCT WO92/21660)和苄基次膦酸化合物(PCT WO 91/15495)都已被描述为PTK抑制剂，可用于癌症的治疗。
发明概述本发明涉及某些3-(4-酰氨基吡咯-2-基亚甲基)-2-二氢吲哚酮衍生物，它们表现出PK调制能力，因此可用于治疗涉及异常PK活性的功能障碍。
本发明的一种实施方式是式(I)化合物
其中R1选自由氢、卤素、烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13组成的组；R2选自由氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基)组成的组；R3、R4和R5独立地是氢或烷基；Z是芳基、杂芳基、杂环或-NR15R16，其中R15和R16独立地是氢或烷基，或者R15和R16与它们所连接的氮原子一起构成杂环氨基；R6选自由氢或烷基组成的组；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组；R8选自由羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；R9和R10独立地选自由氢、烷基、氰基烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，或者R9和R10联合形成杂环氨基；R12和R13独立地选自由氢、烷基、羟基烷基和芳基组成的组，或者R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R17选自由羟基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或其药学上可接受的盐。
另一种实施方式是式I化合物，其中R1选自由氢、卤素、烷基、环烷基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13组成的组；R2选自由氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基)组成的组；R3、R4和R5独立地是氢或烷基；Z是芳基、杂芳基、杂环或-NR15R16，其中R15和R16独立地是氢或烷基，或者R15和R16与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R6选自由氢或烷基组成的组；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组；R8选自由羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；R9和R10独立地选自由氢、烷基、氰基烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，或者R9和R10联合形成杂环基；R12和R13独立地选自由氢、烷基和芳基组成的组，或者R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成杂环；R17选自由羟基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或其药学上可接受的盐。
另一种实施方式是式(Ia)化合物 其中R1、R3、R4和R5是氢；R2是氟，并且位于二氢吲哚环的5位；
Z是吗啉-4-基；R6和R7是甲基。
优选地，*C的立体化学是(S)。
另一种实施方式是式(II)化合物 其中R是氢或烷基；R1选自由氢、卤素、烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13组成的组；R2选自由氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基)组成的组；R3、R4和R5独立地是氢或烷基；Z是芳基、杂芳基、杂环或-NR15R16，其中R15和R16独立地是氢或烷基，或者R15和R16与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R6选自由氢或烷基组成的组；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组；R8选自由羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；R9和R10独立地选自由氢、烷基、氰基烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，或者R9和R10联合形成杂环氨基；R12和R13独立地选自由氢、烷基、羟基烷基和芳基组成的组，或者R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R17选自由羟基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或其药学上可接受的盐。
另一种实施方式是药物组合物，包含式I、Ia或II的化合物或盐和药学上可接受的载体或赋形剂。
另一种实施方式是蛋白激酶催化活性的调制方法，包含使蛋白激酶与式I、Ia或II化合物或盐接触。用于这种方法的蛋白激酶可以是受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶。
另一种实施方式是治疗或预防生物体蛋白激酶相关性功能障碍的方法，包含对该生物体给以治疗有效量的药物组合物，该组合物包含式I、Ia或II的化合物或盐和药学上可接受的载体或赋形剂。用于这种方法的蛋白激酶可以是受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶。蛋白激酶相关性功能障碍可以是EGFR相关性功能障碍、PDGFR相关性功能障碍、IGFR相关性功能障碍和flk相关性功能障碍。蛋白激酶功能障碍还可以是鳞状上皮细胞癌、星形细胞瘤、卡波济氏肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、泌尿生殖癌和胃肠癌。而且，蛋白激酶功能障碍还可以是糖尿病、自体免疫疾病、过度增殖症、再狭窄、纤维变性、牛皮癣、林-希氏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、血管生成、炎症、免疫功能障碍和心血管功能障碍。这些方法可以用于治疗人。
另一种实施方式中，本发明涉及制备式(I)化合物的方法。
最后，本发明涉及鉴别调制蛋白激酶催化活性的化合物，使表达该蛋白激酶的细胞与本发明化合物或盐接触，然后监测对细胞的效果。
发明的详细说明定义除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。
“烷基”表示饱和的脂族烃基团，包括1至20个碳原子的直链和支链基团(本文所述数字范围、例如1-20无论何时都意味着该基团、在这种情况下的烷基，可以含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。更优选地，它是具有1至10个碳原子的中等大小烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最优选地，它是具有1至4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时取代基优选为卤素、羟基、低级烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂脂环基、C(O)R8、NR9R10和C(O)NR9R10。
“环烷基”表示3至8元全碳单环、全碳5元/6元或6元/6元稠合二环或多环稠合环(“稠合”环系意味着系统中的每个环与系统中的其它环共享毗邻的一对碳原子)基团，其中一个或多个环可以含有一条或多条双键，但是没有一个环具有完全共轭的π电子系统。环烷基的非限制性实例有环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、金刚烷、环庚烷、环庚三烯等。环烷基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个、更优选一个或两个取代基，独立地选自由低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、芳基(可选地被一个或多个、优选一个或两个基团取代，取代基彼此独立地是卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基)、芳氧基(可选地被一个或多个、优选一个或两个基团取代，取代基彼此独立地是卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基)、6元杂芳基(环中具有1至3个氮原子，环中的碳可选地被一个或多个、优选一个或两个基团取代，取代基彼此独立地是卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基)、5元杂芳基(具有1至3个选自氮、氧和硫的杂原子，该基团的碳和氮原子可选地被一个或多个、优选一个或两个基团取代，取代基彼此独立地是卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基)、5或6元杂脂环基(具有1至3个选自氮、氧和硫的杂原子，该基团的碳和氮原子(如果有的话)可选地被一个或多个、优选一个或两个基团取代，取代基彼此独立地是卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基)、巯基、(低级烷基)硫基、芳硫基(可选地被一个或多个、优选一个或两个基团取代，取代基彼此独立地是卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基)、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R9S(O)-、R9S(O)2-、-C(O)OR9、R9C(O)O-和-NR9R10组成的组，R9和R10定义同上。
“链烯基”表示由至少两个碳原子和至少一条碳-碳双键组成的如上所定义的烷基。代表性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等。
“炔基”表示由至少两个碳原子和至少一条碳-碳叁键组成的如上所定义的烷基。代表性实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等。
“芳基”表示1至12个碳原子的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，具有完全共轭的π电子系统。芳基的非限制性实例有苯基、萘基和蒽基。芳基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个、更优选一个、两个或三个、进而更优选一个或两个，独立地选自由低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R9S(O)-、R9S(O)2-、-C(O)OR9、R9C(O)O-和-NR9R10组成的组，R9和R10定义同上。优选地，芳基可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基氨基、羧基或N-磺酰氨基。
“杂芳基”表示5至12个环原子的单环或稠合环(也就是共享毗邻原子对的环)基团，含有一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。未取代的杂芳基的非限制性实例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤、四唑、三嗪和咔唑。杂芳基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个、更优选一个、两个或三个、进而更优选一个或两个，独立地选自由低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R9S(O)-、R9S(O)2-、-C(O)OR9、R9C(O)O-和-NR9R10组成的组，R9和R10定义同上。优选地，杂芳基可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基氨基、羧基或N-磺酰氨基。
“杂脂环基”表示单环或稠合环基团，在环中具有5至9个环原子，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)n(其中n是整数0至2)的杂原子，其余环原子是C。这些环还可以具有一条或多条双键。不过，这些环不具有完全共轭的π电子系统。未取代的杂脂环基的非限制性实例有吡咯烷基、哌啶子基、哌嗪子基、吗啉代基、硫代吗啉代基、高哌嗪子基等。杂脂环基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个、更优选一个、两个或三个、进而更优选一个或两个，独立地选自由低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基、R9S(O)-、R9S(O)2-、-C(O)OR9、R9C(O)O-和-NR9R10组成的组，R9和R10定义同上。优选地，杂脂环基可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基氨基、羧基或N-磺酰氨基。
“杂环”表示3至8个环原子的饱和环状基团，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)n(其中n是整数0至2)的杂原子，其余环原子是C，其中一个或两个C原子可以可选地被羰基代替。杂环基的环可以可选地独立地被一个、两个或三个取代基取代，取代基选自低级烷基(可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自羧基或酯基)、卤代烷基、氰基烷基、卤素、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、芳烷基、杂芳烷基和-COR(其中R是烷基)。更具体地，术语杂环基包括但不限于四氢吡喃基、2，2-二甲基-1，3-二氧戊环、哌啶子基、N-甲基哌啶-3-基、哌嗪子基、N-甲基吡咯烷-3-基、吡咯烷基、吗啉代基、硫代吗啉代基、硫代吗啉代-1-氧化物、硫代吗啉代-1，1-二氧化物、4-乙氧羰基哌嗪子基、3-氧代哌嗪子基、2-咪唑啉酮、2-吡咯烷酮、2-氧代高哌嗪子基、四氢嘧啶-2-酮及其衍生物。优选地，杂环基团可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、被羧基或酯基取代的低级烷基、羟基、单或二烷基氨基。
“杂环氨基”表示3至8个环原子的饱和环状基团，其中至少一个环原子是氮，可选地其中另外一个或两个环原子是选自N、O或S(O)n(其中n是整数0至2)的杂原子，其余环原子是C，其中一个或两个C原子可以可选地被羰基代替。杂环氨基可以可选地独立地被一个、两个或三个取代基取代，取代基选自低级烷基(可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自羧基或酯基)、卤代烷基、氰基烷基、卤素、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、芳烷基、杂芳烷基和-COR(其中R是烷基)。更具体地，术语杂环氨基包括但不限于哌啶-1-基、哌嗪-1-基、吡咯烷-1-基、吗啉-4-基、硫代吗啉-4-基、硫代吗啉代-1-氧化物、硫代吗啉代-1，1-二氧化物、4-乙氧羰基哌嗪-1-基、3-氧代哌嗪-1-基、2-咪唑啉酮-1-基、2-吡咯烷酮-1-基、2-氧代高哌嗪子基、四氢嘧啶-2-酮及其衍生物。优选地，杂环氨基可选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、被羧基或酯基取代的低级烷基、羟基、单或二烷基氨基。杂环氨基是上述杂环基团的子集。
“羟基”表示-OH基团。
“烷氧基”表示-O-(烷基)和-O-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
“卤代烷氧基”表示-O-(卤代烷基)。代表性实例包括但不限于三氟甲氧基、三溴甲氧基等。
“芳氧基”表示-O-芳基和-O-杂芳基，芳基和杂芳基定义同上。代表性实例包括但不限于苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基、噻吩氧基、嘧啶氧基、吡嗪氧基等及其衍生物。
“巯基”表示-SH基团。
“烷硫基”表示-S-(烷基)和-S-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、环丙硫基、环丁硫基、环戊硫基、环己硫基等。
“芳硫基”表示-S-芳基和-S-杂芳基，芳基和杂芳基定义同上。代表性实例包括但不限于苯硫基、吡啶硫基、呋喃硫基、噻吩硫基、嘧啶硫基等及其衍生物。
“酰基”表示-C(O)-R″基团，其中R″选自由氢、低级烷基、三卤甲基、未取代的环烷基、芳基(可选地被一个或多个、优选一个、两个或三个取代基取代，取代基选自由低级烷基、三卤甲基、低级烷氧基、卤素和-NR9R10组成的组)、杂芳基(通过环碳键合的)(可选地被一个或多个、优选一个、两个或三个取代基取代，取代基选自由低级烷基、三卤烷基、低级烷氧基、卤素和-NR9R10组成的组)和杂脂环基(通过环碳键合的)(可选地被一个或多个、优选一个、两个或三个取代基取代，取代基选自由低级烷基、三卤烷基、低级烷氧基、卤素和-NR9R10组成的组)。代表性酰基包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。
“醛”表示其中R″是氢的酰基。
“硫代酰基”表示-C(S)-R″基团，其中R″定义同上。
“酯”表示-C(O)O-R″基团，其中R″定义同上，但是R″不能是氢。
“乙酰基”表示-C(O)CH3基团。
“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选氟或氯。
“三卤甲基”表示-CX3基团，其中X是如上所定义的卤素。
“三卤甲磺酰基”表示X3CS(＝O)2基团，其中X定义同上。
“氰基”表示-C≡N基团。
“S-磺酰氨基”表示-S(O)2NR9R10基团，其中R9和R10定义同上。
“N-磺酰氨基”表示-NR9S(O)2R10基团，其中R9和R10定义同上。
“O-氨基甲酰基”表示-OC(O)NR12R13基团，其中R12和R13定义同上。
“N-氨基甲酰基”表示R9OC(O)NR10-基团，其中R9和R10定义同上。
“O-硫代氨基甲酰基”表示-OC(S)NR12R13基团，其中R12和R13定义同上。
“N-硫代氨基甲酰基”表示R9OC(S)NR10-基团，其中R9和R10定义同上。
“氨基”表示-NR9R10基团，其中R9和R10都是氢。
“C-酰氨基”表示-C(O)NR9R10基团，其中R9和R10定义同上。
“N-酰氨基”表示R9C(O)NR10-基团，其中R9和R10定义同上。
“硝基”表示-NO2基团。
“卤代烷基”表示烷基，优选如上所定义的低级烷基，它被一个或多个相同或不同的卤原子取代，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“羟基烷基”表示烷基，优选如上所定义的低级烷基，它被一个、两个或三个羟基取代，例如羟甲基、1-或2-羟基乙基、1，2-、1，3-或2，3-二羟基丙基等。
“芳烷基”表示烷基，优选如上所定义的低级烷基，它被如上所定义的芳基取代，例如-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、CH3CH(CH3)CH2苯基等及其衍生物。
“杂芳烷基”表示烷基，优选如上所定义的低级烷基，它被杂芳基取代，例如-CH2吡啶基、-(CH2)2嘧啶基、-(CH2)3咪唑基等及其衍生物。
“单烷基氨基”表示基团-NHR，其中R是如上所定义的烷基或未取代的环烷基，例如甲氨基、(1-甲基乙基)氨基、环己氨基等。
“二烷基氨基”表示基团-NRR，其中每个R独立地是如上所定义的烷基或未取代的环烷基，例如二甲氨基、二乙氨基、(1-甲基乙基)-乙氨基、环己基甲氨基、环戊基甲氨基等。
“可选”或“可选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生和不发生的场合。例如，“可选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
术语“2-二氢吲哚酮”、“二氢吲哚-2-酮”和“2-氧代吲哚”在本文中是可互换使用的，表示具有下列化学结构的分子 术语“吡咯”表示具有下列结构的分子 具有相同分子式但是原子键合性质或顺序或者原子空间排列不同的化合物被称为“异构体”。原子空间排列不同的异构体被称为“立体异构体”。彼此不是镜像的立体异构体被称为“非对映体”，彼此是不可叠加镜像的立体异构体被称为“对映体”。当化合物具有不对称中心时，例如它与四个不同的基团键合，有一对对映体是可能的。对映体可以以它的不对称中心的绝对构型为特征，可以用R-与S-顺序规则加以描述，或者通过这类方式加以描述，其中分子围绕偏振光的平面旋转，被命名为右旋或左旋(也就是分别为(+)或(-)异构体)。手性化合物可以存在单个的对映体或其混合物。含有等比例对映体的混合物被称为“外消旋混合物”。
本发明的化合物可以具有一个或多个不对称中心；这类化合物因此可以被制成单个的(R)-或(S)-立体异构体或其混合物。例如，在式(I)化合物的-CONHCHR3-CR4(OH)CR5Z中携带羟基的碳原子是不对称中心，因此式(I)化合物可以存在(R)-或(S)-立体异构体。除非有相反指示，说明书和权利要求书中对特定化合物的说明或命名打算包括单个的对映体及其混合物，其外消旋体或其它。立体化学的测定方法和立体异构体的分离方法是本领域熟知的(参见″Advanced OrganicChemistry″第4版第4章的讨论，J.March，John Wiley and Sons，NewYork，1992)。
式(I)化合物可以表现互变异构现象和结构异构现象。例如，本文所述化合物可以在连接2-二氢吲哚酮部分与吡咯部分的双键采取E或Z构型，或者它们可以是E与Z的混合物。本发明涵盖所有互变异构或结构异构形式及其混合物，它们具有调制RTK、CTK和/或STK活性的能力，并不限于任意一种互变异构或结构异构形式。
“药物组合物”表示一种或多种本文所述化合物或其生理学上/药学上可接受的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，其他组分例如生理学上/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
式(I)化合物还可以充当前体药物。“前体药物”表示体内转化为母体药物的成分。前体药物也经常是有用的，因为在有些情形中，它们可能比母体药物更容易给药。例如，它们通过口服给药可以是生物可利用的，而母体药物则不然。前体药物还可以提高母体药物在药物组合物中的溶解性。前体药物的非限制性实例将是以酯形式给药的本发明化合物(“前体药物”)，以促进跨越细胞膜的传输，在那里水溶性不利于移动，但是一旦进入细胞之后被水解代谢为羧酸、即活性实体，在那里水溶性是有益的。
前体药物的另一个实例也许是短多肽，非限制性地例如2-10个氨基酸的多肽，通过末端氨基与本发明化合物的羧基键合，其中该多肽被体内水解或代谢，释放活性分子。式(I)化合物的前体药物属于本发明的范围。
另外，式(I)化合物将被生物(例如人)体内的酶代谢生成能够调制蛋白激酶活性的代谢产物。这类代谢产物属于本发明的范围。
本文所用的“生理学上/药学上可接受的载体”表示载体或稀释剂，它不会对生物体导致显著的刺激作用，并且不会抵消给药化合物的生物活性和性质。
“药学上可接受的赋形剂”表示加入到药物组合物中以进一步促进化合物给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖与各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括(1)酸加成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸等，有机酸例如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等，优选盐酸或(L)苹果酸；或(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。
“PK”表示受体蛋白质酪氨酸激酶(RTK)、非受体或“细胞”酪氨酸激酶(CTK)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STK)。
“方法”表示完成既定任务的方式、手段、技术和工艺，包括但不限于化学、药学、生物学、生物化学和医学领域人员已知的或者容易从已知方式、手段、技术和工艺开发的那些方式、手段、技术和工艺。
“调制作用”或“调制”表示RTK、CTK和STK的催化活性的改变。确切而言，调制表示RTK、CTK和STK的催化活性的活化，优选RTK、CTK和STK的催化活性的活化或抑制，这依赖于暴露于RTK、CTK或STK的化合物或盐的浓度，或者更优选为RTK、CTK和STK的催化活性的抑制。
“催化活性”表示在RTK和/或CTK的直接或间接影响下，酪氨酸的磷酸化作用速率，或者表示在STK的直接或间接影响下，丝氨酸和苏氨酸的磷酸化作用速率。
“接触”表示以这样一种方式使本发明化合物与靶PK在一起，该化合物能够影响PK的催化活性，这种影响是直接的，也就是与激酶本身发生相互作用，或者是间接的，也就是与另一种分子发生相互作用，激酶的催化活性依赖于该分子。这类“接触”可以是“体外”完成的，也就是在试管、陪替氏皿等中。在试管中，接触可以仅牵涉化合物和有关PK，或者可以牵涉全细胞。还可以将细胞供养或生长在细胞培养皿中，再与该环境中的化合物接触。在本文中，特定化合物影响PK相关性功能障碍的能力、也就是如下所定义的化合物的IC50可以在将化合物尝试体内用于更复杂的活生物体之前加以测定。关于生物体外部的细胞，存在本领域技术人员熟知的多种方法使PK与化合物接触，包括但不限于直接的细胞微量注射和大量的跨膜载体技术。
“体外”表示在人工环境中进行的过程，非限制性地例如在试管或培养基中。
“体内”表示在活生物体内进行的过程，非限制性地例如小鼠、大鼠或兔。
“PK相关性功能障碍”、“受PK驱使的功能障碍”和“异常的PK活性”都表示以不适当的、也就是过低或更普遍为过高的PK催化活性为特征的条件，其中特定的PK可以是一种RTK、CTK或STK。不适当的催化活性可以由下列结果引起(1)在正常情况下不表达PK的细胞表达PK，(2)PK表达上升，引起所不希望的细胞增殖、分化和/或生长，或(3)PK表达下降，引起所不希望的细胞增殖、分化和/或生长减少。PK活性过高表示编码特定PK的基因扩增或者产生与细胞增殖、分化和/或生长功能障碍相关的PK活性水平(也就是说，随着PK的水平上升，细胞功能障碍的一种或多种症状的严重性也增加)。活性过低当然是相反的，其中随着PK活性水平下降，细胞功能障碍的一种或多种症状的严重性也增加。
动词“治疗”、名词“治疗”和“治疗作用”表示减轻或抵消PK介导的细胞功能障碍和/或其伴随症状的方法。尤其是，关于癌症，这些术语简单地意味着患有癌症的个体的寿命预期将被延长或者疾病的一种或多种症状将被减少。
“生物体”表示包含至少一个细胞的所有活的实体。活生物体可以简单到例如单一的真核细胞，或者复杂到例如哺乳动物，包括人类。
“治疗有效量”表示化合物将在一定程度上缓解所治疗功能障碍的一种或多种症状的给药量。参照癌症的治疗，治疗有效量表示具有下列效果的量(1)减少肿瘤的大小；(2)抑制(也就是在一定程度上延缓，优选终止)肿瘤转移；(3)在一定程度上抑制(也就是在一定程度上延缓，优选终止)肿瘤生长；和/或(4)在一定程度上缓解(或者优选消除)与癌症有关的一种或多种症状。
“监测”表示观察或检测使化合物与表达特定PK的细胞接触的效果。所观察或检测的效果可以是细胞表型、PK的催化活性或PK与天然结合配偶体的相互作用的变化。用于观察或检测这类效果的技术是本领域熟知的。
在本发明的最后一个方面，上述效果选自细胞表型的变化与否、所述蛋白激酶的催化活性的变化与否或者所述蛋白激酶与天然结合配偶体的相互作用的变化与否。
“细胞表型”表示细胞或组织的外观或细胞或组织的生物功能。细胞表型的非限制性实例有细胞大小、细胞生长、细胞增殖、细胞分化、细胞存活、细胞程序死亡和营养物的摄取与利用。这类细胞表型特征是可用本领域熟知的技术测量的。
“天然结合配偶体”表示在细胞中与特定PK结合的多肽。天然结合配偶体可以在PK介导的信号转导过程中扮演传播信号的角色。天然结合配偶体与PK的相互作用变化本身可以表现为PK/天然结合配偶体复合体的浓度上升或下降，其结果是可观察到的PK介导信号转导的能力变化。
本发明的代表性化合物如下表1a所示。
表1a
10 5-{(Z)-[4-(3-氯苯基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-N-(2-羟基-3-吡咯烷-1-基丙基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺11 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺12 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基}氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺13 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯2-基]亚甲基}-N-(2-羟基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺14 N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]-4-(4-氟苯基)-2-甲基-5-{(Z)-[5-(吗啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺15 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺16 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺
17 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-(2-羟基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺18 (3Z)-3-{[3-(4-氰基苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N，N-二甲基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺19 4-(4-氰基苯基)-N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]-2-甲基-5-{(Z)-[5-(吗啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺20 (3Z)-3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺21 (3Z)-3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺22 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺23 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
24 N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺25 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺26 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺27 N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺28 N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺29 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-2，4-甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺30 N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺31 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
32 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺33 N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺34 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺35 N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺36 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺37 N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-(2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺38 N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺39 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺40 5-[(Z)-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
41 442.49 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-吗啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺42 442.49 5-([(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-吗啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺43 458.95 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-吗啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺44 458.95 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-吗啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺47 5-(5-(Z)-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺48 5-(5-(Z)-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺
49 2，4-(Z)-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺50 5-(5-(Z)-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺51 5-(5-(Z)-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺52 2，4-(Z)-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧-苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺本发明的其他代表性化合物如下表1b所示。
表1b化合物号 结构 名称1N 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羟基-丙基)-酰胺2N5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-酰胺3N2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺4N5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-酰胺5N5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢亚吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺6N 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺
7N 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺8N 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺9N 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢亚吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺11N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺12N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺
13N (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-(2-羟基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺14N N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]-4-(4-氟苯基)-2-甲基-5-{[5-(吗啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺15N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺16N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺
17N 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-(2-羟基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺18N 3-{[3-(4-氰基苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N，N-二甲基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺19N 4-(4-氰基苯基)-N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]-2-甲基-5-{[5-(吗啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺20N 3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺
21N 3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺22N 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺23N 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺24N N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺25N 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
26N 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺27N N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺28N N-{3-[2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺29N 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-{3-[2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺30N N-{3-[2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺
34N 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺35N N-[2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺36N 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺37N N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-5-[(2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺38N N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺39N 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺
40N 5-[(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺47N 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺48N 5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3 ]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺49N 2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3 ]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺50N 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-51N 5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺
52N 2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧-苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺本发明的其他代表性化合物如下表1c所示。
表1c化合物号 结构 名称45N 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-甲基-酰胺；45S 5-((Z)-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸((S)-2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺；和46S5-((Z)-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸((R)-2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺表1a-1c所列化合物仅供例证，决不被解释为以任何方式限制本发明的范围。
优选的实施方式尽管发明概述部分给出了最广泛的定义，不过下列一些式(I)化合物是优选的。
1、一组优选的式(I)化合物是这样的，其中R6选自由氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基；和R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，更优选地，R7是氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，进而更优选甲基、氢或苯基。
2、另一组优选的式(I)化合物是这样的，其中R6选自由氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基，最优选甲基；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、烷基或芳基，R7更优选为氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，进而更优选甲基、氢或苯基；和R3、R4和R5是氢；和Z是芳基。
3、另一组优选的式(I)化合物是这样的，其中R6选自由氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基，最优选甲基；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、烷基或芳基，R7更优选为氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，进而更优选甲基、氢或苯基，最优选甲基；和R3、R4和R5是氢；和
Z是杂芳基，优选三嗪基、四唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基或吡嗪基。
4、另一组优选的式(I)化合物是这样的，其中R6选自由氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基，最优选甲基；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、烷基或芳基，R7更优选为氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，进而更优选甲基、氢或苯基；和R3、R4和R5是氢；和Z是杂环。
5、另一组优选的式(I)化合物是这样的，其中R6选自由氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基，最优选甲基；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、烷基或芳基，R7更优选为氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，进而更优选甲基、氢或苯基，最优选甲基；和R3、R4和R5是氢；和Z是-NR15R16，其中R15和R16联合形成杂环氨基，优选哌啶-1-基、N-甲基哌啶-1-基、哌嗪-1-基、N-甲基吡咯烷-1-基、吡咯烷-1-基、吗啉-4-基、硫代吗啉-4-基、硫代吗啉代-1-氧化物、硫代吗啉代-1，1-二氧化物、4-乙氧羰基甲基哌嗪-1-基、3-氧代哌嗪-1-基、咪唑烷-1-基-2-酮、吡咯烷-1-基-2-酮、2-氧代高哌嗪-1-基或四氢嘧啶-1-基-2-酮，更优选吗啉-4-基。
6、另一组优选的式(I)化合物是这样的，其中R6选自由氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、烷基或芳基，R7更优选为氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，进而更优选甲基、氢或苯基；和R3、R4和R5是氢；和Z是-NR15R16，其中R15和R16是烷基，优选二乙氨基、二甲氨基或乙氨基。
7、在上述优选的和更优选的第(1)-(6)组中，进而更优选的一组化合物是这样的，其中R1是氢、烷基、-C(O)NR12R13、未取代的环烷基，优选氢、3，4-二甲氧基苯氨基羰基、4-甲氧基-3-氯苯氨基羰基，进而更优选氢或甲基，最优选氢；和R2是氢、氰基、卤素、低级烷氧基或-S(O)2NR9R10，其中R9是氢，R10是氢、芳基或烷基，并且位于氧代吲哚环的5位，优选地，R2是氢、氯、溴、氟、甲氧基、乙氧基、苯基、二甲氨基磺酰基、3-氯苯氨基磺酰基、羧基、甲氧基、氨基磺酰基、甲氨基磺酰基、苯氨基磺酰基、吡啶-3-基氨基磺酰基、二甲氨基磺酰基、异丙氨基磺酰基，更优选氢、氟或溴。最优选地，R2是氟，并且位于二氢吲哚酮环的5位。
在上述优选的、更优选的和进而更优选的化合物中，在-CONHCH(R3)*CR4(OH)CR5Z链中携带羟基并且用*表示的碳原子的立体化学是RS、R或S，更优选S。
实用性催化活性受本发明化合物调制的PK包括蛋白质酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶(STK)，前者有两种类型受体酪氨酸激酶(RTK)和细胞酪氨酸激酶(CTK)。RTK介导的信号转导开始于与特异性生长因子(配体)的细胞外相互作用，继之以受体二聚化作用、内在蛋白质酪氨酸激酶活性的瞬时刺激作用和磷酸化作用。由此产生细胞内信号转导分子的结合位点，与一系列胞质发信号分子生成复合体，促进适当的细胞反应(例如细胞分裂、对细胞外微环境的代谢效应等)。参见Schlessinger和Ullrich，1992，Neuron9303-391。
有人已经指出，生长因子受体上的酪氨酸磷酸化位点充当发信号分子SH2(src同源性)结构域的高亲合性结合位点。Fantl等，1992，Cell69413-423，Songyang等，1994，Mol.Cell.Biol.142777-2785)，Songyang等，1993，Cell72767-778和Koch等，1991，Science252668-678。已经鉴别了若干与RTK缔合的细胞内底物蛋白。它们可以分为主要的两组(1)具有催化结构域的底物，和(2)缺乏这类结构域、但是充当衔接物并且与催化活性分子缔合的底物。Songyang等，1993，Cell72767-778。受体与其底物SH2结构域之间的相互作用的特异性取决于磷酸化酪氨酸残基周围的氨基酸残基。SH2结构域与特定受体上围绕磷酸酪氨酸残基的氨基酸序列之间的结合亲合性差异与所观察到的其底物磷酸化作用差异是一致的。Songyang等，1993，Cell72767-778。这些观察结果提示，每种RTK的功能不仅取决于它的表达模式和配体的可利用性，而且取决于下游信号转导途径的排列，这些途径是由特定受体激活的。因而，磷酸化作用提供了重要的调节步骤，它决定了发信号途径的选择性，这些途径得到特异性生长因子受体以及分化因子受体的补充。
STK主要是cytosol，影响细胞的内部生物化学，经常作为对PTK事件的下行反应。STK已经参与发信号过程，后者引发DNA合成和随后引起细胞增殖的有丝分裂。
因而，PK信号转导导致细胞增殖、分化、生长和代谢，而非其他反应。异常的细胞增殖可能导致广泛的功能障碍和疾病，包括瘤形成，例如癌、肉瘤、成胶质细胞瘤和血管瘤，白血病、牛皮癣、动脉硬化、关节炎和糖尿病性视网膜病等功能障碍，和其他涉及血管生成和/或血管发生失控的功能障碍。
为了实施本发明，并不需要精确地理解本发明化合物抑制PK的机理。不过，不局限于任何特定的机理或理论，据信这些化合物与PK催化区中的氨基酸发生相互作用。PK通常具有双叶结构，其中ATP似乎结合在两叶之间的裂口中，在氨基酸被保存在PK内的区域中。PK的抑制剂据信通过非共价的相互作用(例如氢键、范德华力和离子相互作用)结合在相同的通用区域中，在那里上述ATP与PK结合。更具体地，据认为本发明化合物的2-二氢吲哚酮组分结合在通常被ATP的腺嘌呤环所占据的通用空间中。特定分子对特定PK的特异性可能是另外在2-二氢吲哚酮核上各种取代基与对特定PK而言特异性氨基酸结构域之间的相互作用的结果。因而，不同的二氢吲哚酮取代基可以有助于优先与特定PK结合。选择对不同ATP(或其他核苷酸)结合位点有活性的化合物的能力使本发明化合物可用于利用这样一种位点定向任意蛋白质。本文所公开的化合物因而在这类蛋白质的体外测定法中具有实用性，以及通过与这类蛋白质的相互作用表现体内治疗作用。
另外，本发明的化合物提供了多种实体肿瘤的治疗方法，包括但不限于癌、肉瘤，包括卡波济氏肉瘤、成红细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、星形细胞瘤、黑素瘤和成肌细胞瘤。非实体肿瘤癌症的治疗或预防也是本发明所关注的，例如白血病。适应症可以包括但不限于脑癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、血癌、肺癌和骨癌。
进一步涉及不适当PK活性的功能障碍类型的非限制性实例有细胞增殖功能障碍、纤维变性症和代谢功能障碍，本文所述化合物可以用于预防、治疗和研究它们。
可以被本发明预防、治疗或进一步研究的细胞增殖功能障碍包括癌症、血管增生功能障碍和肾小球膜细胞增殖功能障碍。
血管增生功能障碍表示涉及异常的血管发生(血管形成)和血管生成(血管的蔓延)的功能障碍。尽管血管发生和血管生成在各种正常生理过程中扮演重要角色，例如胚胎发育、黄体形成、伤口愈合和器官再生，不过它们也在癌症形成中扮演关键角色，其中它们会导致保持肿瘤存活所需的新毛细血管的形成。血管增生功能障碍的其他实例包括关节炎，其中新的毛细血管侵入关节，破坏软骨，和眼疾病，象糖尿病性视网膜病，其中视网膜中的新毛细血管侵入玻璃体，出血，导致失明。
有人已经鉴别了两种结构上相关的RTK，它们结合VEGF的亲合性很高fms样酪氨酸1(flt-1)受体(Shibuya等，1990，Oneogene，5519-524；De Vries等，1992，Science，255989-991)和KDR/FLK-1受体，也已知为VEGF-R2。有人已经报道血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮细胞特异性有丝分裂原，具有体外内皮细胞生长促进活性。Ferrara & Henzel，1989，Biochein.Biophys.Res.Comm.，161851-858；Vaisman等，1990，J.Biol.Chem.，26519461-19566。美国专利申请Ser.Nos.08/193,829、08/038,596和07/975,750中的信息明确提示了VEGF不仅负责内皮细胞的增殖，而且是正常的与病理性血管生成的基本调节剂。一般参见Klagsburn & Soker，1993，Current Biology，3(10)699-702；Houck等，1992，J.Biol.Chem.，26726031-26037。
正常的血管发生和血管生成在各种生理过程中扮演重要角色，例如胚胎发育、伤口愈合、器官再生和女性生殖过程，例如排卵期间的黄体卵泡发育和妊娠之后的胎盘生长。Folkman & Shing，1992，J.Biological Chem.，267(16)10931-34。失控的血管发生和/或血管生成与糖尿病等疾病以及恶性实体肿瘤有关，后者依靠血管形成进行生长。Klagsburn & Soker，1993，Current Biology，3(10)699-702；Folkham，1991，J.Natl.Cancer Inst.，824-6；Weidner等，1991，New Engl.J.Med.，3241-5。
据推测的VEGF在血管生成和血管发生期间的内皮细胞增殖和移行中的角色表明了KDR/FLK-1受体在这些过程中的重要角色。糖尿病(Folkman，198，XIthCongress of Thrombosis and Haemostasis(Verstraeta等，eds.)，pp.583-596，Leuven University Press，Leuven)和关节炎等疾病以及恶性肿瘤生长可以是由失控的血管生成所导致的。例如参见Folkman，1971，N.Engl.J.Med.，2851182-1186。与VEGF特异性结合的受体是重要的和强大的治疗目标，用于调节和调制血管发生和/或血管生成和各种牵涉由这类过程导致的异常细胞生长的严重疾病。Plowman等，1994，DN & P，7(6)334-339。更确切地，KDR/FLK-1受体在新血管形成中的特殊角色使其成为治疗方法的选择目标，以治疗癌症和其他牵涉血管形成失控的疾病。
因而，本发明提供能够调节和/或调制酪氨酸激酶信号转导、包括KDR/FLK-1受体信号转导的化合物，目的是抑制或促进血管生成和/或血管发生，也就是抑制、防止或干扰在被配体、例如VEGF激活时被KDR/FLK-1转导的信号的化合物。尽管据信本发明化合物作用于受体或其他沿行酪氨酸激酶信号转导途径的组分，不过它们也可以直接作用于由失控的血管生成所产生的肿瘤细胞。
尽管人与鼠的对应“flk-I”属受体的命名法是不同的，不过它们在很多方面是可互换的。鼠受体Flk-1及其人对应物KDR在细胞内结构域内共享93.4％的序列同源性。同样，鼠FLK-I结合人VEGF的亲合性与小鼠VEGF相同，因此被来自这两种受体的配体激活。Millauer等，1993，Cell，72835-846；Quinn等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907533-7537。当在293细胞(人胚胎肾成纤维细胞)中被共同表达时，FLK-1还与酪氨酸缔合，并随后磷酸化人RTK底物(例如PLC-γ或p85)。
依赖于FLK-1受体的模型因此可直接用于了解KDR受体。例如，鼠FLK-1受体在鉴别调节鼠信号转导途径的化合物的方法中的用途可直接用于可以用于鉴别调节人信号转导途径的化合物，也就是调节涉及KDR受体的活性的化合物。因而，被鉴别为体外KDR/FLK-1抑制剂的化合物也能被确认为适合于体内模型。体内小鼠和大鼠模型都已被证明对作用于KDR/FLK-1诱导信号转导途径的成分的临床潜力检查具有优异的价值。
因而，本发明提供这样的化合物，它们通过影响KDR/FLK-1受体的酶活性和干扰受KDR/FLK-1转导的信号来调节、调制和/或抑制血管发生和/或血管生成。因而，本发明提供多种实体肿瘤的治疗方法，包括但不限于成胶质细胞瘤、黑紊瘤、卡波济氏肉瘤、和卵巢、肺、乳腺、前列腺、胰腺、结肠与表皮样癌。另外，有数据提示抑制KDR/Flk-1介导信号转导途径的化合物给药还可以用于血管瘤、再狭窄和糖尿病性视网膜病的治疗。
此外，本发明涉及通过其他受体介导途径抑制血管发生和血管生成，包括包含flt-1受体的途径。
受体酪氨酸激酶介导的信号转导开始于与特异性生长因子(配体)的细胞外相互作用，继之以受体二聚化作用、内在蛋白质酪氨酸激酶活性的瞬时刺激作用和自磷酸化作用。由此产生细胞内信号转导分子的结合位点，与一系列胞质发信号分子生成复合体，促进适当的细胞反应，例如细胞分裂、对细胞外微环境的代谢效应等。参见Schlessinger和Ullrich，1992，Neuron91-20。
KDR/FLK-1的细胞内区域与PDGF-P受体和/或相关性flt-1受体的密切同源性(50.3％同源性)说明了重叠信号转导途径的诱导作用。例如，对PDGF-P受体而言，已知有src家族成员(Twamley等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907696-7700)、磷脂酰肌醇-3′-激酶(Hu等，1992，Mol.Cell.Biol.，12981-990)、磷脂酶cγ(Kashishian & Cooper，1993，Mol.Cell.Biol.，449-51)、ras-GTP酶-活化蛋白(Kashishian等，1992，EMBO J.，111373-1382)、PTP-lD/syp(Kazlauskas等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，10 906939-6943)、Grb2(Arvidsson等，1994，Mol.Cell.Biol.，146715-6726)和衔接分子Shc与Nck(Nishimura等，1993，Mol.Cell.Biol.，136889-6896)结合牵涉不同自磷酸化位点的区域。一般参见Claesson-Welsh，1994，Prog.GrowthFactor Res.，537-54。因而，有可能被KDR/FLK-1激活的信号转导途径包括ras途径(Rozakis等，1992，Nature，360689-692)、PI-3′-激酶、src-介导的和plcγ-介导的途径。每种这些途径都可能在内皮细胞中KDR/FLK-1的血管生成和/或血管发生效应中扮演关键角色。所以，本发明的进一方面涉及本文所述有机化合物调制血管生成和血管发生的用途，因为这类过程是受这些途径控制的。
相反，涉及血管皱缩、收缩或闭合的功能障碍(例如再狭窄)也受到牵连，可以用本发明的方法治疗或预防。
纤维变性症表示细胞外基质的异常生成。纤维变性症的实例包括肝硬化和肾小球膜细胞增殖功能障碍。肝硬化是以导致肝瘢痕形成的细胞外基质成分增加为特征的。导致肝瘢痕的细胞外基质增加还可以是由病毒感染所致，例如肝炎。脂肪细胞似乎在肝硬化中扮演主要角色。其他所牵连的纤维变性症包括动脉粥样硬化。
肾小球膜细胞增殖功能障碍表示由肾小球膜细胞的异常增殖所引起的功能障碍。肾小球膜增殖功能障碍包括各种人类肾疾病，例如肾小球性肾炎、糖尿病性肾病和恶性肾硬化以及诸如血栓性微血管病综合征、移植排斥和肾小球病。RTK PDGFR参与肾小球膜细胞增殖的维持。Floege等，1993，Kidney International4347S-54S。
很多癌症是细胞增殖功能障碍，如前面所述，PK与细胞增殖功能障碍有关。因而，PK、例如RTK家族成员与癌症的形成有关也就不足为奇了。有些受体，象EGFR(Tuzi等，1991，Br.J.Cancer63227-233，Torp等，1992，APMIS100713-719)、HER2/neu(Slamon等，1989，Science244707-712)和PDGF-R(Kumabe等，1992，Oncogene，7627-633)在很多肿瘤中被过度表达，和/或持续被自分泌环激活。事实上，在大多数常见的和严重的癌症中，已经证实了这些受体的过度表达(Akbasak和Suner-Akbasak等，1992，J.Neurol.Sci.，111119-133，Dickson等，1992，Cancer Treatment Res.61249-273，Korc等，1992，J.Clin.Invest.901352-1360)和自分泌环(Lee和Donoghue，1992，J.Cell.Biol.，1181057-1070，Korc等，supra，Akbasak和Suner-Akbasak等，supra)。例如，EGFR与鳞状上皮细胞癌、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、肺癌和膀胱癌有关。HER2与乳腺、卵巢、胃、肺、胰腺和膀胱癌有关。PDGFR与成胶质细胞瘤和黑素瘤以及肺、卵巢与前列腺癌有关。RTK c-met也与恶性肿瘤形成有关。例如，c-met尤其与结肠直肠、甲状腺、胰腺、胃与肝细胞癌和淋巴瘤有关。另外，c-met还与白血病有关。在何杰金氏病和布吉特氏病患者中也检测到c-met基因的过度表达。
IGF-IR除了与营养物供养和II型糖尿病有牵连以外，还与若干癌症类型有关。例如，IGF-I是若干肿瘤类型的自分泌生长刺激剂，例如人乳腺癌细胞(Arteaga等，1989，J.Clin.Invest.841418-1423)和小细胞肺肿瘤细胞(Macauley等，1990，Cancer Res.，502511-2517)。另外，IGF-I尽管整体而言参与神经系统的正常生长和分化，不过也似乎是人神经胶质瘤的自分泌刺激剂。Sandberg-Nordqvist等，1993，Cancer Res.532475-2478。IGF-IR及其配体在细胞增殖中的重要性进一步得到这样一个事实的支持，即很多细胞类型培养物(成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞、骨髓细胞、软骨细胞和成骨细胞(骨髓干细胞))都被IGF-I刺激生长。Goldring和Goldring，1991，Eukaryotic Gene Expression，1301-326。Baserga和Coppola提出IGF-IR在转化作用机理中扮演核心角色，它可能成为广谱人类恶性肿瘤的治疗干预的优选目标。Baserga，1995，Cancer Res.，55249-252，Baserga，1994，Cell79927-930，Coppola等，1994，Mol.Cell.Biol.，144588-4595。
STK在很多癌症类型中都有牵连，尤其包括乳腺癌(Cance等，Int.J.Cancer，54571-77(1993))。
异常PK活性与疾病之间的关系并不限于癌症。例如，RTK与诸如牛皮癣、糖尿病、子宫内膜异位、血管生成、动脉粥样化斑形成、阿尔茨海默氏病、再狭窄、林-希氏病、表皮过度增生、神经变性疾病、衰老相关性黄斑变性和血管瘤等疾病有关。例如，在角膜和皮肤伤口愈合中显示有EGFR。在II型糖尿病中显示有胰岛素-R和IGF-1R缺乏。更完全的特定RTK与它们的治疗适应症之间的相互关系参见Plowman等，1994，DN & P7334-339。
如前面所述，不仅RTK，而且CTK、包括但不限于src，abl，fps，yes，fyn，lyn，lck，blk，hck，fgr和yrk(Bolen等，1992，FASEB J.，63403-3409)都参与增殖性和代谢性信号转导途径，因而能够预期、并且已经显示参与本发明所涉及的很多PTK介导功能障碍。例如突变的src(v-src)已经显示是鸡中的一种致癌蛋白(pp60v-src)。而且，它的细胞同系物原致癌基因pp60c-src传送很多受体的致癌基因信号。EGFR或HER2/neu在肿瘤中的过度表达引起PP60c-src的结构活化，这是恶性肿瘤细胞所特有的，但是在正常细胞中则不存在。另一方面，缺乏c-src表达的小鼠表现骨硬化表型，说明了c-src参与破骨细胞功能，并且可能牵涉相关的功能障碍。
类似地，Zap70在可能涉及自体免疫疾病的T细胞发信号。
STK与炎症、自体免疫疾病、免疫应答、和诸如再狭窄、纤维变性、牛皮癣、骨关节炎和类风湿性关节炎等过度增殖症有关。
PK在胚胎植入中有牵连。因而，本发明的化合物可以提供预防这类胚胎植入的有效方法，由此可用作分娩控制剂。另外可以用本发明化合物治疗或预防的功能障碍有免疫功能障碍，例如自体免疫疾病；AIDS；和心血管功能障碍，例如动脉粥样硬化。
最后，RTK和CTK在目前都被怀疑牵涉超免疫功能障碍。
所列举的化合物和数据无论如何也决不被解释为以任何方式限制本发明的范围。
给药和药物组合物本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以直接对人类患者给药，或者可以在药物组合物中给药，其中上述物质是与适合的载体或赋形剂混合的。药物的配制与给药工艺可以参见″Remington′sPharmacological Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA.最新版。
本文所用的“给以”或“给药”表示本发明的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或含有式(I)化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物对生物体的释放，目的是PK相关性功能障碍的预防或治疗。
适合的给药途径可以非限制性地包括口服、直肠、透粘膜或肠道给药，或者肌内、皮下、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、脉络膜内、腹膜内、鼻内或眼内注射。优选的给药途径是口服和肠胃外。
作为替代选择，可以以局部而非全身的方式给以化合物，例如化合物直接注射到实体肿瘤内，经常是药库或缓释制剂。
此外，可以在定向药物释放系统中给以药物，例如在涂有肿瘤特异性抗体的脂质体中。脂质体将被定向于肿瘤，并且被肿瘤选择性吸收。
本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的过程加以制造，例如借助常规的混合、溶解、造粒、包糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冷冻干燥过程。
按照本发明所使用的药物组合物可以按常规方式加以配制，其中使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于活性化合物加工为可以药用的制剂。恰当的制剂依赖于所选择的给药途径。
关于注射，本发明化合物可以被配制成水溶液，优选地在生理学上可相容的缓冲液中，例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。关于透粘膜给药，在制剂中使用适合于所要渗透的屏障的渗透剂。这类渗透剂是本领域公知的。
关于口服给药，化合物可以这样配制，将活性化合物与本领域熟知的、药学上可接受的载体混合。这类载体使本发明化合物能够配制成片剂、丸剂、锭剂、糖锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬液等，以被患者口服摄取。口用药物制剂可以这样制备，使用一种固体赋形剂，可选地研磨所得混合物，如果需要的话加入其他适合的助剂后，加工颗粒混合物，得到片剂或糖锭剂药芯。有用的赋形剂确切地有填充剂，例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉和马铃薯淀粉，和其他材料，例如明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸。还可以使用一种盐，例如藻酸钠。
为糖锭剂药芯提供适合的包衣。为此，可以使用浓的糖溶液，它可以可选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝胶、聚乙二醇和或二氧化钛；漆溶液；和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖锭剂包衣加入染剂或色素，用于鉴别或区分活性化合物剂量的不同组合。
可以口用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊、以及由明胶和增塑剂制成的软密封胶囊，增塑剂例如甘油或山梨糖醇。推入配合式胶囊可以含有活性成分与下列成分的混合物填充剂，例如乳糖；粘合剂，例如淀粉；和/或润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁；和可选的稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在适合的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。在这些制剂中还可以加入稳定剂。
还可以使用的药物组合物包括硬明胶胶囊。作为非限制性实例，活性化合物胶囊口用药物产品制剂可以是50和200mg剂量强度的。这两种剂量强度是从相同的颗粒制成的，填充在不同大小的硬明胶胶囊中，3号胶囊填充50mg，0号胶囊填充200mg。制剂的组成例如可以如表2所示。
表2
可以将胶囊包装在褐色玻璃或塑料瓶内，以保护活性化合物避光。含有活性化合物胶囊制剂的容器必须贮存在受控制的室温下(15-30℃)。
关于通过吸入给药，按照本发明所使用的化合物适宜以气雾喷雾剂的形式释放，其中使用加压包装或雾化器和适合的推进剂，非限制性地例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气雾剂的情况下，提供计量释放的阀门可以控制剂量单元。可以配制胶囊和药筒，例如由明胶制成，用在吸入器或吹入器内，含有化合物与适合的粉剂基质的混合物，例如乳糖或淀粉。
化合物还可以被配制成肠胃外给药的形式，例如通过大丸剂注射或连续输注。注射制剂可以是单元剂量形式，例如在安瓿或多剂溶剂内，其中加入一种防腐剂。组合物可以采取诸如在油性或水性载体中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制材料，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括活性化合物的水溶性形式的水溶液，非限制性地例如盐形式。另外，可以在亲脂性载体中制备活性化合物的悬液。适合的亲脂性载体包括脂肪油，例如芝麻油；合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯和甘油三酯；或诸如脂质体等材料。水性注射悬液可以含有增加悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，悬液还可以含有适合的稳定剂和/或增加化合物的溶解度以便制备高浓度溶液的试剂。
作为替代选择，活性成分可以是粉末的形式，用于在使用前与适合的载体再生，例如无菌无热原的水。
化合物还可以被配制在直肠组合物中，例如栓剂或保留灌肠剂，例如使用常规的栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯。
除了前面所述制剂以外，化合物还可以被配制成药库制剂。这类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或肌内注射给药。本发明的化合物可以与下列成分被配制成用于这种给药途径的形式适合的聚合材料或疏水性材料(例如在乳液中与药理学上可接受的油)、离子交换树脂、或微溶性衍生物，非限制性地例如微溶性盐。
疏水性本发明化合物的药物载体的非限制性实例有助溶剂系统，包含苯甲醇、非极性表面活性剂、水可混溶性有机聚合物和含水相，例如VPD助溶剂系统。VPD是3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80与65％w/v聚乙二醇300的溶液，在绝对乙醇中补足体积。VPD助溶剂系统(VPD∶D5W)由被5％葡萄糖水溶液稀释1∶1的VPD组成。这种助溶剂系统良好地溶解疏水性化合物，本身在全身给药后仅产生低毒性。自然，这样一种助溶剂系统的比例可以各不相同，而不破坏它的溶解度和毒性特征。此外，助溶剂组分的特性可以各不相同例如，可以使用其他低毒性非极性表面活性剂代替聚山梨醇酯80，可以改变聚乙二醇的成分大小，其他生物可相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮，其他糖或多糖可以取代葡萄糖。
作为替代选择，可以采用疏水性药物化合物的其他释放系统。脂质体和乳剂是熟知的疏水性药物的释放载体实例。另外，还可以采用某些有机溶剂，例如二甲基亚砜，尽管经常是以更大的毒性为代价的。
另外，化合物可以利用缓释系统加以释放，例如含有治疗剂的固体疏水性聚合物的半渗透性基质。已有各种缓释材料，是本领域技术人员所熟知的。缓释胶囊可以释放化合物达几周至100天以上，这依赖于它们的化学性质。根据治疗剂的化学性质和生物稳定性，可以采用另外的使蛋白质稳定的策略。
本文的药物组合物还可以包含适合的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶、和聚合物，例如聚乙二醇。
很多调制PK的本发明化合物可以被提供为生理学上可接受的盐，其中所要求保护的化合物可以构成带负电或带正电的部分。其中化合物构成带正电部分的盐的实例非限制性地包括季铵(本文另有定义)，诸如盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐等盐，其中季铵基团的氮原子是所选择的本发明化合物已经与适当的酸反应的氮。其中本发明化合物构成带负电部分的盐非限制性地包括钠、钾、钙和镁盐，由化合物的羧酸基团与适当的碱(例如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钙(Ca(OH)2)等)的反应所生成。
适合用在本发明中的药物组合物包括这样的组合物，其中活性成分的含量足以达到预期的目的，例如PK活性的调制或PK相关性功能障碍的治疗或预防。
更具体而言，治疗有效量表示化合物有效预防、减轻或改善疾病症状或者延长受治疗者存活期的量。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围之内，尤其按照本文所提供的详细公开内容。
关于任何用在本发明方法中的化合物，首先可以从细胞培养测定法估计治疗有效量或剂量。然后，可以制订用于动物模型的剂量，以便达到包括如细胞培养所测定的IC50(也就是供试化合物达到PK活性的半数最大抑制作用的浓度)的循环浓度范围。这类信息然后可以用于更精确地确定对人有用的剂量。
本文所述化合物的毒性和治疗功效可以通过标准的药学程序在细胞培养物或实验动物中加以测定，例如测定主体化合物的IC50和LD50(本文另有对二者的讨论)。从这些细胞培养测定法和动物研究所得数据可以用于制订用于人的剂量范围。剂量可以因所采用的剂型和所利用的给药途径而异。各医师可以根据患者条件选择确切的制剂、给药途径和剂量(例如参见Fingl等，1975，″The Pharmacological Basis ofTherapeutics″，Ch.1 p.1)。
可以个别调整给药量和间隔，以提供活性成分足以维持激酶调制效应的血浆水平。这些血浆水平被称为最低有效浓度(MEC)。MEC将因每种化合物而异，但是可以从体外数据估计出来，例如利用本文所述测定法可以确定达到50-90％激酶抑制作用所需的浓度。达到MEC所需的剂量将依赖于个别特征和给药途径。HPLC测定法或生物测定法可以用于测定血浆浓度。
给药间隔也可以用MEC值确定。化合物应当采用这样一种制度给药，维持血浆水平在MEC以上的时间占10-90％，优选在30-90％之间，最优选在50-90％之间。
目前，式I、Ia或II化合物的治疗有效量从大约25mg/m2至1500mg/m2每天；优选约3mg/m2/天。进而更优选50mg/qm qd至400mg/qd。
在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可以不涉及血浆浓度，可以采用本领域已知的其他方法确定正确的给药量和间隔。
组合物的给药量当然将依赖于受治疗者、病痛的严重性、给药的方式、医师的判断等。
如果需要的话，组合物可以存在于包装或分散装置内，例如FDA批准的试剂盒，它可以含有一种或多种含有活性成分的单元剂型。包装例如可以包含金属或塑料箔，例如泡眼包装。包装或分散装置可以附带有给药指导。包装或分散器还可以在容器内附带有由调节药品制造、使用或销售的政府机构发布的通告，证明该组合物或者对人或兽给药已经得到该机构的批准。这类通告例如可以是由美国食品与药品管理局批准的处方药标签或产品插件。还可以制备配制在相容性药物载体中的、包含本发明化合物的组合物，置于适当的容器内，标示所治疗的适应症。标签上适合的适应症可以包括肿瘤的治疗、血管生成的抑制、纤维变性、糖尿病的治疗等。
本发明可以与CMC悬液载体一起给药。例证性CMC悬液列在下表3中。
表3
*依赖于所需浓度(日期)。
1.0升CMC悬液载体的方案如下。计算利用表格制备载体制剂所需赋形剂的适当的量，表格显示载体制剂的组成和批量大小。称重适合的空容器，例如清洁的广口玻璃瓶或聚乙烯瓶。向容器加入约600ml水。称重羧甲基纤维素钠(5mg)，转移至容器内。利用磁搅拌棒或带有叶片的实验室搅拌器搅拌至均匀(约2-3小时)。称重NaCl，加入到容器内。继续混合至溶解(约10分钟)。加入聚山梨醇酯80。混合至溶液均匀(约20分钟)。加入苯甲醇。混合至溶液均匀(约10分钟)。加入其余的水，使溶液的重量达到所需重量或体积(1010mg或1000ml，22℃下的密度为1.01)。贮存在2-8℃下(在冷却下)。
悬液制剂可以制造如下。利用研钵和研棒研磨API，得到看起来均匀的粉末，粒径很小(没有大块或大的颗粒——理想地应当通过美国标准筛＞80，也就是历经＜180μm)。称重计算量的API，放入容器。向容器加入约90％总需求量的CMC悬液载体。利用带有叶片的实验室搅拌器或等价物将化合物悬浮在载体中。叶片的直径应当匹配容器底部的直径，以确保混合充分。在50rpm下搅拌30分钟，或者直至药物充分悬浮。加入载体制剂至“qs”(适量)，即对应于批量大小的适当重量。在50rpm下搅拌另外30分钟。立即等分悬液至琥珀色玻璃或聚乙烯容器内。保护容器避光。在2-8℃下搅拌(在冷却下，不冻结)。
本发明还有一个方面，本文所述化合物或其盐或前体药物可能与其他化疗剂联合用于上述疾病和功能障碍的治疗。例如，本发明的化合物、盐或前体药物可以与单独的烷基化剂联合，例如氟尿嘧啶(5-FU)，或者进一步与叶酸联合；或其他烷基化剂，非限制性地例如其他嘧啶类似物，例如UFT、capecitabine、吉西他滨和阿糖胞苷，烷基磺酸酯，例如白消安(用于慢性粒细胞性白血病的治疗)、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶类，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；环乙亚胺类和甲基三聚氰胺类，例如六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；和氮芥类，例如苯丁酸氮芥(用于慢性淋巴细胞性白血病、原发性巨球蛋白血症和非何杰金氏淋巴瘤的治疗)、环磷酰胺(用于何杰金氏病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、维耳姆斯氏瘤和横纹肌肉瘤的治疗)、雌莫司汀、异环磷酰胺、新氮芥、泼尼莫司汀和尿嘧啶氮芥(用于原发性血小板增多、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病和卵巢癌的治疗)；和三嗪类，例如达卡巴嗪(用于软组织肉瘤的治疗)。
本发明的化合物、盐或前体药物还可以与其他抗代谢化疗剂联合使用，非限制性地例如叶酸类似物，例如甲氨蝶呤(用于急性淋巴细胞性白血病、绒膜癌、蕈样真菌病、乳腺癌、头颈癌和骨原性肉瘤的治疗)和蝶罗呤；和嘌呤类似物，例如巯基嘌呤和硫代鸟嘌呤(用于急性粒细胞性、急性淋巴细胞性和慢性粒细胞性白血病的治疗)。
受到关注的是本发明的化合物、盐或前体药物还可以与天然产物类化疗剂联合使用，非限制性地例如长春花属生物碱，例如长春花碱(用于乳腺癌和睾丸癌的治疗)、长春新碱和长春地辛；表鬼臼毒素类，例如依托泊苷和替尼泊苷，二者都可用于睾丸癌和卡波济氏肉瘤的治疗；抗生素化疗剂，例如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、丝裂霉素(用于治疗胃、宫颈、结肠、乳腺、膀胱和胰腺癌症)、放线菌素、替莫唑胺、普卡霉素、博莱霉素(用于皮肤、食管和泌尿生殖道癌症的治疗)；和酶化疗剂，例如L-天冬酰胺酶。
除了上述以外，本发明的化合物、盐或前体药物还可以与下列药物联合使用铂配合物(顺铂等)；取代的脲，例如羟基脲；甲基肼衍生物，例如丙卡巴肼；肾上腺皮质抑制剂，例如米托坦、氨鲁米特；激素和激素拮抗剂，例如肾上腺皮质类固醇(例如泼尼松)、孕激素(例如羟孕酮己酸酯)、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、雄性激素(例如丙酸睾酮)；和芳化酶抑制剂，例如anastrozole。
最后，还受到关注的是本发明化合物与下列药物的组合也是有效的米托蒽醌；紫杉醇；本领域已知的环加氧酶-2抑制剂，确切为Celebrex、Paracoxib、Vioxx、公开在PCT公报No.WO 99/11605中的Abbott′s Cox-189；拓扑异构酶抑制剂，例如Camptosar；Her-2受体拮抗剂，例如Herceptin、endostatin、Gleevac；ImClone VEGF受体拮抗剂IMC C225，用于实体肿瘤癌症或白血病的治疗，非限制性地例如急性骨髓性(非淋巴细胞性)白血病。
一般合成方法下列一般方法可以用于制备本发明化合物将适当取代的2-氧代吲哚(1eq.)、适当取代的3-羧基-5-甲酰基吡咯(1.2eq.)和碱(0.1eq.)混合在溶剂(1-2ml/mmol 2-氧代吲哚)中，然后将混合物加热约2至约12小时。冷却后，将所生成的沉淀过滤，用冷乙醇或乙醚洗涤，真空干燥，得到对应的5-(2-氧代-1，2-二氢亚吲哚-(3Z)-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸。如果没有沉淀生成，浓缩反应混合物，将残余物用二氯甲烷/乙醚研制，过滤收集所得固体，然后干燥。产物可以可选地用色谱法进一步纯化。
碱可以是有机或无机碱。如果使用有机碱，优选地它是含氮碱。有机含氮碱的实例包括但不限于二异丙胺、三甲胺、三乙胺、苯胺、吡啶、1，8-二氮杂二环并[5.4.1]十一碳-7-烯、吡咯烷和哌啶。
无机碱的实例非限制性地有氨、碱金属或碱土金属的氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐和酰胺。碱金属包括锂、钠和钾，碱土金属包括钙、镁和钡。
在目前优选的本发明实施方式中，当溶剂是质子性溶剂时，例如水或醇，碱是碱金属或碱土金属无机碱，优选碱金属或碱土金属氢氧化物。
将为本领域技术人员所清楚的是，基于已知的有机合成的一般原理和本文的公开内容，该碱将是最适合于所关注的反应的。
进行反应的溶剂可以是质子性溶剂或质子惰性溶剂，优选地它是质子性溶剂。“质子性溶剂”是这样一种溶剂，氢原子与氧或氮原子共价键合，赋予氢原子相当的酸性，因而能够通过氢键被溶质“共享”。质子性溶剂的实例非限制性地包括水和醇。
“质子惰性溶剂”可以是极性的或非极性的，但是在两种情况下都不含有酸性氢，因此不能与溶质形成氢键。非极性质子惰性溶剂的实例非限制性地有戊烷、己烷、苯、甲苯、二氯甲烷和四氯化碳。极性质子惰性溶剂的实例有氯仿、四氢呋喃、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺。
在目前优选的本发明实施方式中，溶剂是质子性溶剂，优选水或醇，例如乙醇。
反应是在高于室温的温度下进行的。温度一般从大约30℃至大约150℃，优选大约80℃至大约100℃，最优选大约60℃至大约85℃，后者大约是乙醇的沸点。“大约”意味着温度范围优选地在所示温度的10摄氏度以内，更优选地在所示温度的5摄氏度以内，最优选地在所示温度的2摄氏度以内。因而，例如，“大约75℃”表示75℃±10℃，优选75℃±5℃，最优选75℃±2℃。
使用容易获得的原料，利用化学领域熟知的方法，可以容易地合成2-氧代吲哚和3-羧基-5-甲酰基吡咯。
在有机溶剂中，例如二甲基甲酰胺、四氢呋喃等，在适合的偶联剂的存在下，例如二环己基碳二亚胺、DEAD、EDC和HOBt，5-(2-氧代-1，2-二氢亚吲哚-(3Z)-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸与式ZCH(R5)-CR4(OH)-CHR3NH2胺的偶联得到式(I)化合物。式ZCH(R5)-CR4(OH)-CHR3NH2胺是商业上可得到的，或者它们可以用本领域熟知的方法制备。一些这类方法在下文中有所描述。
将为本领域技术人员领会到的是，用于生成本发明化合物的其他合成途径也是可利用的，下列实施例仅供举例而非限制。
实施例给出下列制备例和实施例，使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。它们不应被解释为限制本发明的范围，仅仅是其例证和代表。
合成实施例实施例15-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸的合成步骤1将二甲基甲酰胺(25ml，3eq.)在冰浴中冷却，同时搅拌。向其中加入POCl3(1.1eq.，10.8ml)。30分钟后，向反应加入3，5-二甲基-4-乙基酯吡咯(17.7g，105.8mmol)的DMF溶液(2M，40ml)，继续搅拌。2小时后，将反应用水(250ml)稀释，用1N NaOH水溶液碱化至pH＝11。过滤除去白色固体，用水和己烷冲洗，干燥，得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯(19.75g，95％)，为黄褐色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12.11(br s，1H，NH)，9.59(s，1H，CHO)，4.17(q，J＝6.7Hz，2H，OCH2CH3)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.26(d，J＝6.7Hz，3H，OCH2CH3).
步骤2向氢氧化钾(3g，53mmol)的甲醇(3ml)与水(10ml)溶液加入5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯(2g，10mmol)。将混合物回流3小时，冷却至室温，用6N盐酸酸化至pH 3。过滤收集固体，用水洗涤，在真空烘箱内干燥过夜，得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(1.6g，93％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ12.09(s，br，2H，NH & COOH)，9.59(s，1H，CHO)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3).
步骤3将5-氟靛红(8.2g，49.7mmol)溶于50ml水合肼，回流1小时。然后将反应混合物倒入冰水中。然后将沉淀过滤，用水洗涤，在真空烘箱内干燥，得到5-氟-2-氧代吲哚(7.5g)。
步骤4将5-氟氧代吲哚(100mg，0.66mmol)、5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(133mg，0.79mmol)与10滴哌啶在乙醇(3ml)中的反应混合物在60℃下搅拌过夜，过滤。将固体用1M盐酸水溶液、水洗涤，干燥，得到5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(201mg，定量)，为黄色固体。MS m/z(相对强度，％)299([M-1]+，100).
实施例25-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羟基-丙基)-酰胺的合成步骤1在30℃下，向2-氯甲基环氧乙烷(95g，1.03mol)加入水(3.08g，0.17mol)与二乙胺(106.2ml，1.03mol)的混合物。然后将反应混合物在28-35℃下搅拌6小时，冷却至20-25℃，得到1-氯-3-二乙氨基-丙-2-醇。
步骤2向氢氧化钠(47.9g，1.2mol)的78ml水溶液加入1-氯-3-二乙氨基-丙-2-醇。将所得混合物在20-25℃下搅拌1小时，用178ml水稀释，用乙醚萃取两次。合并乙醚溶液，用固体氢氧化钾干燥，蒸发，得到135g粗产物，经过分布蒸馏纯化，得到纯的缩水甘油基二乙胺(98g，76％)，为一种油。
步骤3历经10分钟向冰冷却的25％(w/w)氢氧化铵溶液(25ml，159mmol)滴加缩水甘油基二乙胺(3.2g，24.8mmol)。将反应混合物在0-5℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌14小时。将所得反应混合物蒸发和蒸馏(84-90℃，500-600mT)，得到1-氨基-3-二乙氨基-丙-2-醇(3.3g，92％)。MS m/z 147([M+1]+).
步骤4向5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3羧酸(100mg，0.43mmol)、EDC(122.7mg，0.64mmol)与HOBt(86.5mg，0.64mmol)的1.0ml DMF溶液加入1-氨基-3-二乙氨基-丙-2-醇(93.2mg，0.64mmol)。将所得反应溶液在室温下搅拌过夜，蒸发。将残余物溶于10ml水，过滤。将固体用饱和碳酸氢钠和水洗涤，在高真空烘箱内干燥过夜，得到粗产物，经过柱色谱纯化，用含有三乙胺的6％甲醇-二氯甲烷(2滴/100ml 6％甲醇-二氯甲烷)洗脱，得到5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羟基-丙基)-酰胺(62mg，34％)，为黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.70(s，1H，NH-1′)，10.90(s，1H，NH-1)，7.76(dd，J＝2.38，9.33Hz，1H，H-4)，7.72(s，1H，烯属的-H)，7.60(m，br.，1H，CONHCH2CH(OH)-CH2N(C2H5)2-4′)，6.93(dt，J＝2.38，8.99Hz，1H，H-5)，6.85(dd，J＝4.55，8.99Hz，1H，H-6)，3.83(m，br，1H，OH)，3.33(m，4H)，2.67(m，br，5H)，2.46(s，3H，CH3)，2.44(s，3H，CH3)，1.04(m，br，6H，CH3x2).MS m/z(相对强度，％)427([M+1]+.，100).
实施例35-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺的合成步骤1将吗啉(2.6ml，30mmol)与表氯醇(2.35ml，30mmol)在乙醇(50ml)中的混合物在70℃下搅拌过夜。除去溶剂后，将残余物用二氯甲烷(50ml)稀释。通过真空过滤收集所沉淀的澄清固体，得到1-氯-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(2.0g，37％)。1HNMR(DMSO-d6)δ3.49(t，J＝4.8Hz，2H)，3.60(t，J＝4.6Hz，2H)，3.75(m，4H，2xCH2)，4.20(dd，J＝5.2，12Hz，2H)，4.54(m，2H)，4.62(m，1H，CH)，6.64(d，J＝6.4Hz，1H，OH).MS(m/z)180.2(M+1).
步骤2在室温下，将1-氯-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(2.0g，11mmol)用NH3的甲醇溶液(25重量％，20ml)处理。向反应混合物通入氮，除去氨。蒸发溶剂，得到1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇的氯化氢盐(2.0g，91％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.30(d，J＝6.0Hz，2H)，2.36(m，4H，NCH2)，2.65(dd，J＝8.4，12.8Hz，1H)，2.91(dd，J＝3.6，12.8Hz，1H)，3.52(m，4H，OCH2)，3.87(m，1H，CH)，5.32(s，1H，OH)，8.02(brs.，3H，NH3+).MS(m/z)161.1(M+1).
步骤3使5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(120mg，0.4mmol)与1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)缩合，以沉淀出5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(65mg，36％)。蒸发母液至干，残余物经过快速色谱纯化，得到另外2N(70mg，39％)。1H NMR(DMSO-d6)δ2.28(m，1H)，2.32(m，1H)，2.40(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.31(m，1H)，3.55(m，4H)，3.78(m，1H)，4.73(brs，1H，OH)，6.82(dd，J＝4.5，8.4Hz，1H)，6.90(td，2J＝2.8，3J＝10.0Hz，1H)，7.53(m，1H)，7.70(s，1H)，7.74(dd，J＝2.0，9.6Hz，1H)(芳香和烯属的)，10.87(s，1H，CONH)，13.66(s，1H，NH).LC-MS(m/z)441.4(M-1).
氯化2-羟基-7-氧杂-4-氮杂螺[3.5]壬烷的合成 向装有热电偶、氮入口和250ml加液漏斗的1L 3颈圆底烧瓶内装入吗啉(91.5g，91.5ml，1.05mol，1.0eq.)和100ml乙醇。将溶液迅速搅拌，同时历经约30分钟从加液漏斗加入表氯醇(100g，84.5ml，1.08mol，1.03eq.)。监测温度，当罐温达到27℃时，用冰水浴冷却反应。将澄清的溶液搅拌18小时。用GC测定反应(将5滴反应混合物稀释在1ml乙醇中，注射到15m DB-5毛细GC柱上，运行参数如下注射器250℃，检测器250℃，初始烘箱温度28℃，加热至250℃，每分钟升10℃)。反应完全后，剩余少于3％吗啉。在旋转蒸发器上浓缩反应，直至不再有蒸馏物凝结，条件为50℃全真空室。将所得油在室温下贮存24-48小时，或者直至观察到大量晶体(接种将加速该过程)。将浆液用250ml丙酮稀释，过滤。将固体在60℃真空烘箱内干燥18-24小时。得到84g结晶性产物。浓缩母液，重复结晶过程，可增加收率。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ6.55(d，1H)，4.64(m，1H)，4.53(m，2H)，4.18(m，2H)，3.74(m，4H)，3.60(m，2H)，3.48(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.9，61.39，61.04，60.25，58.54，57.80.
1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-丙醇(外消旋)的合成
向带有磁搅拌棒的3L 1颈圆底烧瓶内装入氯化2-羟基-7-氧杂-4-氮杂螺[3.5]壬烷(150g，835mmol)，然后装入23wt.％无水氨的甲醇溶液(2120ml)。将烧瓶用塞子塞住，将所得澄清溶液在20-23℃下搅拌18小时。在上述条件下进行GC，显示没有剩余的原料。除去塞子，使氨从溶液中冒出达30分钟。然后将烧瓶转移至旋转蒸发器，浓缩至白色固体，条件为45℃浴和全室真空。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13C NMR(100MHz DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1.
遵照上述实施例3所述方法，但是用如下制备的2-(S)-1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇代替2-(RS)-1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇，得到所需化合物5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-(S)-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺。
1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-丙醇(非外消旋)的合成 向装有机械搅拌器、热电偶和加液漏斗的1L 3颈圆底烧瓶内装入吗啉(91.5g，91.5ml，1.05mol，1.0eq.)和45ml叔丁醇。将溶液迅速搅拌，同时历经约30分钟从加液漏斗加入R-表氯醇(100g，84.5ml，1.08mol，1.03eq.)。监测温度，当罐温达到27℃时，用冰水浴冷却反应。将澄清的溶液搅拌18小时。用GC测定反应(将5滴反应混合物稀释在1ml乙醇中，注射到15m DB-5毛细GC柱上，运行参数如下注射器250℃，检测器250℃，初始烘箱温度28℃，加热至250℃，每分钟升10℃)。反应完全后，剩余少于3％吗啉。将溶液冷却至10℃，滴加20wt％叔丁醇钾的THF溶液(576g)，同时保持温度低于15℃。将所得白色浆液在10-15℃下搅拌2小时，在上述条件下用GC检查。可以观察到没有氯醇。在旋转蒸发器上浓缩混合物，条件为50℃全室真空。将所得混合物用水(500ml)和二氯甲烷稀释。分离各相，含水相用二氯甲烷(500ml)洗涤。合并有机层，经硫酸钠干燥，浓缩至澄清无色的油。得到145g，97％环氧化物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.3(dd，4H)，3.1(m，1H)，2.6(dd，1H)，2.5(dd，1H)，2.4(m，4H)，2.2(dd，2H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ65.4，60.1，53.1，48.9，43.4.
将上述粗的环氧化物装入带有磁搅拌棒的3L 1颈圆底烧瓶内。加入无水氨的甲醇溶液(24％w/w，2.5L)，将烧瓶用塞子塞住，将混合物在室温下搅拌24小时。在上述条件下进行GC，显示没有剩余的原料。除去塞子，使氨从溶液中冒出达30分钟。然后将烧瓶转移至旋转蒸发器，浓缩至澄清无色的油，条件为45℃浴和全室真空。得到124g产物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1.
1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-(S)-丙醇的合成向装有机械搅拌器、热电偶和加液漏斗的1L 3颈圆底烧瓶内装入吗啉(91.5g，91.5ml，1.05mol，1.0eq.)和200ml甲醇。将溶液迅速搅拌，同时历经约30分钟从加液漏斗加入R-表氯醇(100g，84.5ml，1.08mol，1.03eq.)。监测温度，当罐温达到27℃时，用冰水浴冷却反应。将澄清的溶液搅拌18小时。用GC测定反应(将5滴反应混合物稀释在1ml乙醇中，注射到15m DB-5毛细GC柱上，运行参数如下注射器250℃，检测器250℃，初始烘箱温度28℃，加热至250℃，每分钟升10℃)。反应完全后，剩余少于3％吗啉。将溶液冷却至10℃，滴加25wt％甲醇钠的甲醇溶液(233g，1.08mol，247ml)，同时保持温度低于15℃。将所得白色浆液在10-15℃下搅拌2小时，在上述条件下用GC检查。可以观察到没有氯醇。在旋转蒸发器上浓缩混合物，条件为50℃全室真空。将所得混合物用水(500ml)和二氯甲烷稀释。分离各相，含水相用二氯甲烷(500ml)洗涤。合并有机层，经硫酸钠干燥，浓缩至澄清无色的油。得到145g，97％1，2-环氧-3-吗啉-4-基丙烷。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.3(dd，4H)，3.1(m，1H)，2.6(dd，1H)，2.5(dd，1H)，2.4(m，4H)，2.2(dd，2H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ65.4，60.1，53.1，48.9，43.4.
将上述粗的1，2-环氧-3-吗啉-4-基丙烷装入带有磁搅拌棒的3L 1颈圆底烧瓶内。加入无水氨的甲醇溶液(24％w/w，2.5L)，将烧瓶用塞子塞住，将混合物在室温下搅拌24小时。在上述条件下进行GC，显示没有剩余的原料。除去塞子，使氨从溶液中冒出达30分钟。然后将烧瓶转移至旋转蒸发器，浓缩至澄清无色的油，条件为45℃浴和全室真空。得到124g 1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-(S)-丙醇。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1.
将咪唑酰胺(7.0g，32.3mmol)、胺(15.0g，64.6mmol)、5-氟氧代吲哚(4.93g，32.6mmol)、三乙胺(9.79g，96.9mmol)和THF(88ml)混合，加热至60℃。形成褐色溶液。在60℃下搅拌24小时后，将黄色浆液冷却至rt(室温)，过滤。将滤饼用80ml THF洗涤，在50℃真空下干燥过夜。得到褐色固体(23.2g)。将固体悬浮在350ml水中，在rt下5小时后过滤。将滤饼用100ml水洗涤，在50℃真空下干燥过夜。得到8.31g，化学收率56％。

向装有温度计、冷凝器、磁搅拌器和氮入口的0.25L烧瓶内装入4.92g 5-氟氧代吲哚、7.0g咪唑酰胺、15.5g(R)-1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-丙醇、9.78g三乙胺和88ml四氢呋喃。将混合物加热至60℃达16.5小时。将反应冷却至环境温度，过滤。将所得固体悬浮在乙腈中，连续三次，浓度11ml/g，在真空中干燥，得到3.6g(25.25％)。[HPLC，Hypersil BDS，C-18，5p，(6∶4)，乙腈0.1M氯化铵，PHA-571437＝4.05min.]H1NMR(DMSO)δ10.86(1H，bs)；7.75(1H，d)；7.70(1H，s)；7.50(1H，m)；6.88(2H，m)；4.72(1H，bs)；3.78(1H，bs)；3.56(4H，m)；3.32(6H，m)；3.15(1H，m)； 2.43(8H，bm).
实施例42，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺的合成使5-(2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(113mg，0.4mmol)与1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)缩合，沉淀出2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(77mg，45.3％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.27(m，1H)，2.32(m，1H)，2.40(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.32(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.8Hz，1H，OH)，6.86(d，J＝7.6Hz，1H)，6.96(t，J＝7.2Hz，1H)，7.10(t，J＝7.6Hz，1H)，7.49(t，J＝5.6Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.77(d，J＝8.0Hz，1H)(芳香和烯属的)，10.88(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)425.4(M+1).
实施例55-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(126.6mg，0.4mmol)与1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)缩合，沉淀出5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(107mg，58％)。1H NMR(DMSO-d6)δ2.29(m，1H)，2.33(m，1H)，2.39(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.37(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.8Hz，1H，OH)，6.85(d，J＝8.4Hz，1H)，7.11(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.53(t，J＝5.6Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)(芳香和烯属的)，10.99(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)457.4(M-1).
R和S立体异构体可以如下制备。
将咪唑酰胺(7.0g，32.3mmol)、胺(15.5g，96.9mmol)、5-氯氧代吲哚(5.48g，32.6mmol)、三乙胺(14ml)和THF(88ml)混合，加热至60℃。形成红色溶液。在60℃下搅拌16小时后，将黄色浆液冷却至rt，过滤。将滤饼用2×50ml THF洗涤，在50℃真空下干燥过夜。得到4.36g，化学收率29％。
将咪唑酰胺(6.8g，31.3mmol)、胺(10.0g，62.5mmol)、5-氯氧代吲哚(5.3g，31.6mmol)和THF(100ml)混合，加热至60℃。形成红色溶液。在60℃下搅拌68小时后，加入三乙胺(14ml)，在60℃下搅拌5小时。反应不完全。加入4.6g胺侧链，在60℃下搅拌20小时。将黄色浆液冷却至rt，过滤。将滤饼用2×50ml THF洗涤，在50℃真空下干燥过夜。得到5.48g，化学收率38％。
实施例65-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(72.2mg，0.2mmol)与1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(38mg，0.24mmol)缩合，沉淀出5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(55mg，55％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.27(m，1H)，2.32(m，1H)，2.39(m，4H)，2.41，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.13(s，1H)，3.35(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.4Hz，1H，OH)，6.80(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.51(t，J＝5.6Hz，1H)，7.76(s，1H)，8.09(d，J＝2.0Hz，1H)(芳香和烯属的)，10.99(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)503.4(M-1).
实施例72，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成步骤1将3-[1，2，3]三唑(2.0g，29mmol)、表氯醇(3.4ml，43.5mmol)与N，N-二异丙基乙胺(2.6ml，15mmol)在乙醇(50ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂后，残余物经过快速色谱纯化(CH2Cl2/CH3OH＝100/1-100/2-100/4)，得到1-氯-3-(1，2，3)三唑-2-基丙-2-醇(2.1g，45％)，1H NMR(CDCl3)δ3.52(m，2H，OH和CH2)，3.60(dd，J＝5.2，11.2Hz，1H)，4.36(m，1H，CH)，4.68(m，2H)，7.67(s，2H).MS(m/z)162.1(M+1)和1-氯-3-(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇(2.3g，49％).1H NMR(CDCl3)δ3.56(s，1H)，3.57(s，1H)，4.35(m，1H)，4.53(dd，J＝7.2，14Hz，1H)，4.67(dd，J＝3.8，14Hz，1H)，7.67(s，1H)，7.71(s，1H).MS(m/z)162.1(M+1).
步骤2在60℃密封的压力容器内，将1-氯-3-(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇(2.3g，13mmol)用NH3的甲醇溶液(25重量％，20ml)处理过夜。冷却至室温后，向反应混合物通入氮，以除去氨。蒸发溶剂，得到1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇的氯化氢盐(2.57g，100％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.68(dd，J＝8.8，12.8Hz，1H)，2.97(dd，J＝3.6，12.8Hz，1H)，4.15(m，1H)，4.44(dd，J＝6.4，14Hz，1H)，4.57(dd，J＝4.6，14Hz，1H)，5.95(d，J＝5.2Hz，1H，OH)，7.77(s，1H)，8.01(brs.，3H，NH3+)，8.12(s，1H).MS(m/z)143.1(M+1).
步骤3使5-(2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(113mg，0.4mmol)与1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)缩合，沉淀出2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3 ]三唑-1-基-丙基)-酰胺(70mg，41％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.45，2.48(2xs，6H，2xCH3)，3.35(m，2H)，4.02(m，1H)，4.32(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.53(dd，J＝3.4，14Hz，1H)，5.43(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.91(d，J＝7.6Hz，1H)，7.01(t，J＝7.6Hz，1H)，7.15(t，J＝8.0Hz，1H)，7.66(s，1H)，7.12(t，J＝5.6Hz，1H)，7.74(s，1H)，7.77(d，J＝7.6Hz，1H)，8.11(s，1H)，10.93(s，1H，CONH)，13.68(s，1H，NH).LC-MS(m/z)405.4(M-1).
实施例85-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(120mg，0.4mmol)与1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)缩合，沉淀出5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺(100mg，62％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.42，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.98(m，1H)，4.27(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.50(dd，J＝3.4，13.6Hz，1H)，5.38(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.82(dd，J＝4.4，8.4Hz，1H)，6.91(td，2J＝2.4，3J＝9.0Hz，1H)，7.70(m，3H)，7.75(dd，J＝2.4，9.2Hz，1H)，8.11(s.1H)，10.93(s，1H，CONH)，13.73(s，1H，NH).LC-MS(m/z)423.4(M-1).
实施例95-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(126.6mg，0.4mmol)与1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)缩合，沉淀出5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺(48mg，27％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.42，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.99(m，1H)，4.28(dd，J＝7.8，14Hz，1H)，4.51(dd，J＝3.2，14Hz，1H)，5.39(d，J＝6.0Hz，1H，OH)，6.85(d，J＝8.4Hz，1H)，7.12(dd，J＝2.0，8.2Hz，1H)，7.70(m，2H)，7.74(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)，8.07(s，1H)，10.99(s，1H，CONH)，13.65(s，1H，NH).LC-MS(m/z)439.4(M-1).
实施例105-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3(Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成使5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(144.4mg，0.4mmol)与1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)缩合，沉淀出5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基丙基)-酰胺(130mg，67％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.41，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.99(m，1H)，4.28(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.50(dd，J＝3.6，14Hz，1H)，5.40(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.70(m，2H)，7.77(s，1H)，8.07(s.1H)，8.10(d，J＝1.6Hz，1H)，11.0(s，1H，CONH)，13.64(s，1H，NH).LC-MS(m/z)485.4(M-1).
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸、5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸、5-(2-氧代-1，2-二氢亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸的合成描述在本申请人于2001年2月14日与本申请同时提交的专利申请中，发明名称为“吡咯取代的2-二氢吲哚酮——蛋白激酶抑制剂”，系列号No.09/783,264，其公开内容全文引用在此作为参考。
实施例111-氨基-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-丙-2-醇的合成 向硫代吗啉(5.0g，48.7mmol)的HOCH3(200ml)溶液加入过硫酸氢钾制剂oxone(36.0g，58.5mmol)的H2O(100ml)溶液。将混合物在40℃下充分搅拌48小时，然后冷却至0℃。滴加NaOH水溶液，调节pH＝12。滤出固体，用HOCH3洗涤(3×40ml)。合并液体，冷凝，经过硅胶快速色谱纯化(CHCl3/CH3OH/NH3.H2O＝3/1/0.1-2/1/0.1)，得到硫代吗啉1，1-二氧化物(6.2g)，收率93％。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.97(m，4H)，3.07(m，4H)，3.42(brs，1H)，MS(m/z)136(M+1).
将硫代吗啉1，1-二氧化物(2.5g，18.5mmol)与(R)-(-)-表氯醇(1.55ml，20mmol)在混合溶剂乙醇(50ml)与H2O(5ml)中的混合物在25℃下搅拌24小时。除去溶剂后，残余物经过快速色谱纯化，得到(R)-1-氯-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-丙-2-醇(4.0g，96％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.50(m，2H)，2.94(m，4H)，305(m，4H)，3.54(dd，J＝5.8，11.2，Hz，1H)，3.63(dd，J＝4.4，11.2Hz，1H)，3.78(m，H，CH)，5.10(d，J＝5.2Hz，1H，OH)，MS(m/z)228.2(M+1).
在50℃下，将(R)-1-氯-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-丙-2-醇(2.27g，10mmol)用NH3的甲醇溶液(25重量％，20ml)处理12小时。蒸发溶剂后，将残余物用阴离子交换树脂(AG1×8，OH型)在水中处理，得到粗的(S)-1-氨基-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-丙-2-醇(2.0g)。它被约30％它的二聚物所污染，几乎不能用柱色谱纯化。MS(m/z)209.2(M+1)。使(S)-1-氨基-3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-丙-2-醇与氧代吲哚缩合，得到所需的二氢吲哚酮(纯化后的收率50-80％)。
(R)-5-(2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-2-羟基-丙基]-酰胺 1H NMR(DMSO-d6)δ2.39，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.49(m，1H)，2.56(m，1H)，2.97(m，4H)，3.07(m，4H)，3.16(m，1H)，3.34(m，1H)，3.74(m，1H)，4.83(d，J＝4.8Hz，IH，OH)，6.86(d，＝7.6Hz，1H)，6.97(t，J＝7.4Hz，1H)，7.11(t，J＝7.5Hz，1H)，7.50(t，J＝5.6Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.76(d，J＝7.6Hz，1H)(芳香和烯属的)，10.88(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH)，LC-MS(m/z)473.4(M+1).
(R)-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-2-羟基-丙基]-酰胺
1H NMR(DMSO-d6)δ2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.47(m，1H)，2.54(m，1H)，2.97(m，4H)，3.06(m，4H)，3.17(m，1H)，3.30(m，1H)，3.74(m，1H)，4.83(d，J＝4.4Hz，1H)，6.82(t，J＝4.0Hz，1H)6.91(td，2J＝2.8，3J＝9.0Hz，1H)，7.53(t，J＝5.8Hz，1H)，7.70(s，1H)7.75(dd，J＝2.4，9.2Hz，1H)，10.88(s，1H)，13.67(s，1H).LC-MS(m/z)491.4(M+1).
(R)-5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-2-羟基-丙基]-酰胺 1H NMR(DMSO-d6)δ2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.45(m，1H)，2.53(m，1H)，2.96(m，4H)，3.06(m，4H)，3.17(m，1H)，3.33(m，1H)，3.75(m，1H)，4.83(d，J＝4.4Hz，1H，OH)，6.85(t，J＝8.4Hz，1H)，7.11(dd，J＝2.2，8.2Hz，1H)，7.53(t，J＝5.5Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)，10.98(s，1H)，13.62(s，1H)，LC-MS(m/z)507.2(M+1).
(R)-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1，1-二氧代-λ6-硫代吗啉-4-基)-2-羟基-丙基]-酰胺
1H NMR(DMSO-d6)δ2.41，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.47(m，1H)，2.54(m，1H)，2.97(m，4H)，3.06(m，4H)，3.18(m，1H)，3.30(m，1H)，3.74(m，1H)，4.83(d，J＝4.8Hz，1H)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝1.8，8.2Hz，1H)，7.53(t，J＝5.8，1H)，7.76(s，1H)，8.09(d，J＝2.0Hz，1H)，10.98(s，1H)13.62(s，1H)，LC-MS(m/z)553.6(M+1).
实施例12(S)或(R)-1-甲氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇的合成 将吗啉(1.74ml，20mmol)与(R)-表氯醇(1.56ml，20mmol)在乙醇(10ml)中的混合物在rt下搅拌48小时。除去溶剂后，在rt下将残余物用CH3NH2的水溶液(40重量％，20ml)处理14小时。除去溶剂，得到粗的(S)-1-甲氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇，可以经过真空蒸馏或柱色谱纯化(2.4g，70％)。(R)-1-甲氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇是从(S)-表氯醇制备的，收率76％。
1H NMR(CDCl3)δ2.33(dd，J＝3.6，12.4Hz，1H)，2.42(m，1H)，2.44(dd，J＝2.8，9.8Hz，2H)，2.45(s，3H)，2.53(dd，J＝7.6，11.8Hz，1H)，2.62(m，2H)，2.65(dd，J＝3.6，12.0Hz，1H)，3.71(m，4H)，3.85(m，1H)，13CNMR(CDCl3)δ67.06，65.58，62.80，55.87，53.94，36.72，MS(m/z)175(M+1).
使(S)-1-甲氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇与5-氟氧代吲哚缩合，得到(R)-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺
1H NMR(DMSO-d6)δ2.0(s，3H)，2.15(m，1H)，2.25(m，6H)，2.28(m，2H)，2.42(s，1H)，2.95(s，1H)，3.0(s，3H)，3.25(m，2H)，3.57(m，2H)，3.97&3.68(2xbrs，1H)，4.80&4.74(2xbrs，1H)，6.82(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H)，6.90(td，2J＝2.3，3J＝8.7Hz，1H)，7.67(s，1H)，7.71(dd，J＝2.2，9.0Hz，1H)，10.86(s，1H)，13.57(s，1H)，LC-MS(m/z)457.2(M+1).
从(R)-1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇得到(S)-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺 1H NMR(DMSO-d6)δ2.0(m，3H)，2.10(m，1H)，2.22(m，6H)，2.25(m，2H)，2.38(m，1H)，2.90(s，1H)，2.96(s，3H)，3.27(m，2H)，3.52(m，2H)，3.93&3.64(2xbrs，1H)，4.75&4.70(2xbrs，1H)，6.77(dd，J＝4.6，8.2Hz，1H)，6.85(td，2J＝2.5，3J＝8.8Hz，1H)，7.62(s，1H)，767(dd，J＝2.0，9.6Hz，1H)，10.81(s，1H)13.52(s，1H)，LC-MS(m/z)457.2(M+1).
实施例13胺侧链制备3-(1-H-四唑-1-基)-2-羟基-1-氯丙烷和3-(2-H-四唑-2-基)-2-羟基-1-氯丙烷将6.905g四唑(100mmol)、1.75ml二异丙基乙胺(10mmol)与11.73ml表氯醇(150mmol)在无水乙腈(30ml)中的混合物在60℃下搅拌4小时。将所得溶液蒸发，在highvac上干燥，经过硅胶柱纯化，用氯仿-甲醇100∶8洗脱。第一部分得到纯的3-(2-H-四唑-2-基)-2-羟基-1-氯丙烷6.215g(无色的油，38％Y)，第二部分得到9.208g纯的3-(1-H-四唑-1-基)-2-羟基-1-氯丙烷(粘性胶状物，57％Y)。
3-(1H-四唑-1-基)-2-羟基-1-氨基丙烷将9.110g 3-(1-H-四唑-1-基)-2-羟基-1-氯丙烷、15g碳酸钾和130ml饱和氨的甲醇溶液搅拌21小时，然后过滤，蒸发。残余物经过硅胶柱纯化，用氯仿-甲醇-氨水80∶35∶4洗脱。Y＝7.326g白色粘性胶(91.5％th)。
3-(2-H-四唑-2-基)-2-羟基-1-氨基丙烷将6.105g 3-(2-H-四唑-2-基)-2-羟基-1-氯丙烷、10g碳酸钾和95ml饱和氨的甲醇溶液搅拌21小时，然后过滤，蒸发。残余物经过硅胶柱纯化，用氯仿-甲醇-氨水60∶25∶2洗脱。Y＝3.726g白色结晶性固体(69.5％th)。
3-[(2R，6S)-2，6-二甲基-吗啉-4-基]-2-羟基-1-氨基丙烷向冰冷却的顺式-2，6-二甲基吗啉(4.607g，40mmol)的三氟乙醇(5ml)溶液加入4.7ml表氯醇(60mmol)。将溶液在0-5℃下搅拌1小时，除去冷却浴，在RT下搅拌另外5小时。将混合物在highvac上蒸发，将所得油性残余物溶于无水乙醇(50ml)，将溶液在冰浴上冷却，分两批加入固体甲醇钠(2.27g)，将混合物在0-5℃下搅拌2小时。然后过滤反应混合物，将盐用乙醇(30ml)洗涤，合并滤液，加入到冰冷却的浓氨水(200ml)中。将混合物在RT下搅拌12小时，然后在highvac上蒸发。残余物经过硅胶柱纯化，用氯仿-甲醇-7M氨的甲醇溶液80∶15∶3洗脱。Y＝5.75g白色结晶性吸湿性固体(76.3％th)。
(2S)-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)-2-羟基-1-氯丙烷和(2S)-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)-2-羟基-1-氨基丙烷将3.423g 3-甲基-2，5-二氧代咪唑啉、3.60ml R-表氯醇(-)(99％e.e.)与0.30ml Barton碱(1.5mmol)在无水乙腈中的混合物在60℃下搅拌20小时。将所得溶液在highvac上蒸发，在硅胶柱上纯化，用氯仿-甲醇洗脱(5至20％甲醇的梯度)，得到5.572g氯代化合物，为白色无定形固体(90％Y)。氯化物如下转化为胺。将所得羟基-氯代中间体溶于氨的甲醇溶液(用氨气饱和)，加入碳酸钾，将混合物在密闭的烧瓶内搅拌2.5天。过滤反应混合物，蒸发滤液。残余物经过硅胶柱纯化，用氯仿-甲醇-浓氨水80∶15∶1.5的混合物洗脱。
实施例145-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物22)(一般方法)向105mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮杂苯并三唑酯(制备如下在DMF(5ml)中，在Hunig碱(3.0mol，0.525ml)的存在下，将(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(480mg，1.6mmol)用HATU试剂(570mg，1.5mmol)活化，用氯仿(5ml)沉淀分离纯的形式，在高真空下干燥，收率92％(579mg))的无水二甲基乙酰胺(1.5ml)浆液加入72mg 3-(2-H-四唑-2-基)-2-羟基-1-氨基丙烷。将混合物搅拌30分钟，高真空蒸发。将残余物悬浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)内结晶1小时，过滤，将沉淀用冰冷的甲醇洗涤，高真空干燥。Y＝106mg橙色结晶性固体。
实施例155-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物23)(一般方法)向109mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮杂苯并三唑酯(制备如下在DMF(20ml)中，在Hunig碱(9.0mmol，1.58ml)的存在下，将(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基)亚甲基)-5-氯-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(1.520g，4.8mmol)用HATU试剂(1.768g，4.65mmol)活化，用氯仿(20ml)沉淀分离纯的形式，在高真空下干燥，收率94％(1.907g))的无水二甲基乙酰胺(1.5ml)浆液加入72mg 3-(2-H-四唑-2-基)-2-羟基-1-氨基丙烷。将混合物搅拌30分钟，高真空蒸发。将残余物悬浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)内结晶1小时，过滤，将沉淀用冰冷的甲醇洗涤，高真空干燥。Y＝109mg橙色结晶性固体。
实施例16N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物24)(一般方法)向1 21.5mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-三氟甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮杂苯并三唑酯(制备如下在DMF(25ml)中，在Hunig碱(9.0mmol，1.58ml)的存在下，将(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亚甲基)-5-三氟甲氧基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(1.768g，4.8mmol)用HATU试剂(1.758g，4.8mmol)活化，蒸发和用无水乙腈沉淀分离纯的形式，在高真空下干燥，收率85.5％(1.929g))的无水二甲基乙酰胺(1.5ml)浆液加入72mg 3-(2-H-四唑-2-基)-2-羟基-1-氨基丙烷。将混合物搅拌30分钟，在highvac上蒸发。将残余物悬浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)内结晶1小时，过滤，将沉淀用冰冷的甲醇洗涤，高真空干燥。Y＝113mg橙色结晶性固体。
实施例175-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物25)按照实施例14的方法从72mg对应的胺制备。Y＝113mg橙色结晶性固体。
实施例185-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物26)按照实施例15的方法从72mg对应的胺制备。Y＝122mg橙色结晶性固体。
实施例19N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物27)按照实施例16的方法从72mg对应的胺制备。Y＝118mg橙色结晶性固体。
实施例20N-[3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物28)按照实施例14的方法从95mg对应的胺制备。Y＝99mg橙色结晶性固体。
实施例215-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物29)按照实施例15的方法从95mg对应的胺制备。Y＝101mg橙色结晶性固体。
实施例22N-[3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物30)按照实施例16的方法从95mg对应的胺制备。Y＝89mg橙色结晶性固体。
实施例235-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物34)按照实施例14的方法从95mg对应的胺制备。Y＝109mg橙色结晶性固体。
实施例245-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物36)按照实施例15的方法从95mg对应的胺制备。Y＝107mg橙色结晶性固体。
实施例25N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物35)按照实施例16的方法从95mg对应的胺制备。Y＝123mg橙色结晶性固体。
实施例265-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物31)按照实施例14的方法从95mg对应的胺制备。Y＝110mg橙色结晶性固体。
实施例275-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物32)按照实施例15的方法从95mg对应的胺制备。Y＝103mg橙色结晶性固体。
实施例28N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺(化合物33)按照实施例16的方法从95mg对应的胺制备。Y＝120mg橙色结晶性固体。
实施例29
5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯 在冰浴中冷却DMF(4ml，3eq.)，同时搅拌。向其中加入POCl3(1.1eq.，1.8ml)。30分钟后，向反应加入3，5-二甲基-4-乙基酯吡咯(4g，17.4mmol)的DMF溶液(2M，9ml)，继续搅拌。10分钟后，反应混合物固化。将其用5ml DMF稀释，在90℃油浴中加热。1小时后，将反应冷却至室温，用水(100ml)稀释，用1N NaOH碱化至pH＝11。将产物用二氯甲烷萃取(3×200ml)，将有机层用盐水(200ml)洗涤，干燥(MgSO4)，浓缩，得到4.3g(95％)5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯，为褐色固体。1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12.5(br s，1H，NH)，9.11(s，1H，CHO)，7.35(s，5H，ArH)，3.98(q，J＝6.8和7.2Hz，2H，OCH2CH3)，2.48(s，3H，CH3)，0.98(t，J＝7Hz，3H，OCH2CH3).
5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸 在搅拌下，将5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙基酯溶于水(100ml)和甲醇(45ml)。加入KOH(2eq.，1.9g)，在100℃下加热。2.5小时后，冷却至室温，用乙酸乙酯(200ml)萃取除去剩余的酯，干燥，浓缩。水层用2N HCl酸化至pH＝3。过滤除去白色固体，用水冲洗。将固体再次从甲苯中浓缩，用己烷研制，干燥，得到2g(52％)灰白色固体。1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12.46(br s，1H，CO2H)，11.95(s，1H，NH)，9.08(s，1H，CHO)，7.36(s，5H，ArH)，2.49(s，3H，CH3).MS m/z(相对强度％，ion)实测值229(100，M+)；calc.229.2.
5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羟基-丙基)-酰胺 将5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(1.0mg，4.36mmol)、1-氨基-3-二乙氨基-2-丙醇(950mg，6.54mmol)、DDC(900mg，4.36mmol)与HOBt(884mg，6.54mmol)在氯仿(60ml)中的混合物在rt下搅拌12小时。将反应倒入饱和碳酸氢钠(60ml)中，向其中加入1N NaOH(8ml)。然后用EtOAc萃取(3×100ml)，用水和盐水洗涤，干燥，浓缩，得到400mg 5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羟基-丙基)-酰胺。
实施例30化合物11-21的合成方法在DMSO中制备每种氧代吲哚的0.36M溶液以及每种醛的0.576M溶液。在200μl DMSO的存在下，将300μl适当的氧代吲哚与300μl适当的醛混合。然后加入40mg二亚乙基三胺清除剂树脂。将混合物置于Robbins Block内，密封，置于60℃烘箱内，在那里摇动18小时。
18小时后，从烘箱内取出Robbins Block。除去顶部的密封，向混合物加入800μl DMSO。然后再次密封，再次置于60℃烘箱内，在那里继续旋转1小时。
1小时结束后，从烘箱内取出Robbins Block，冷却。小心地除去Robbins Block的底部密封，完整地装入过滤装置内，使新合成的化合物能够从树脂中过滤出来。
实施例313-[1-H-(7-氮杂苯并三唑基)-氧基]-2-羟基-1-氨基丙烷将4.083g 1-羟基-7-氮杂苯并三唑(30mmol)、0.53ml二异丙胺(3mmol)与4.70ml表氯醇在无水氯仿中的混合物在60℃下搅拌2小时。将反应混合物倒在硅胶柱上，用氯仿-甲醇100∶3混合物洗脱。将所得羟基-氯代中间体(4.83g，淡黄色油，70％Y)溶于氨的甲醇溶液(100ml，用氨气饱和)，加入8.3g碳酸钾，将混合物在密闭的烧瓶内搅拌2.5天。过滤反应混合物，蒸发滤液。残余物经过硅胶柱纯化，用氯仿-甲醇-浓氨水80∶15∶1.5混合物洗脱。Y＝2.793g白色结晶性固体(63th，从氯化物计)。
3-[1-H-(苯并三唑基)-氧基]-2-羟基-1-氯丙烷和3-[1-H-(苯并三唑基-3-N-氧)]-2-羟基-1-氯丙烷将12.162g羟基氮杂苯并三唑(90mmol)、1.59ml二异丙基乙胺(9mmol)与14.1ml表氯醇(180mmol)在无水氯仿中的混合物在55℃下搅拌2小时。蒸发反应混合物，将残余物在highvac上干燥，然后在硅胶柱上纯化，用氯仿-甲醇100∶5混合物洗脱。第一部分得到3-[1-H-(苯并三唑基)-氧基]-2-羟基-1-氯丙烷10.570g(淡黄色蜜状物，51.5％Y)，后一部分是3-[1-H-(苯并三唑基-3-N-氧)]-2-羟基-1-氯丙烷9.990g(白色结晶性固体，48.5％Y)。
3-[1-H-(苯并三唑基-3-N-氧)]-2-羟基-1-氨基丙烷类似于3-[1-H-(7-氮杂苯并三唑基)-氧基]-2-羟基-1-氨基丙烷的合成，通过3-[1-H-(苯并三唑基-3-N-氧)]-2-羟基-1-氯丙烷的氨解作用制备。
实施例325-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3H-[1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(一般方法)向105mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮杂苯并三唑酯(制备如下在DMF(5ml)中，在Hunig碱(3.0mmol，0.525ml)的存在下，将(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(480mg，1.6mmol)用HATU试剂活化，用氯仿(5ml)沉淀分离纯的形式，在高真空下干燥，收率92％(579mg))的无水二甲基乙酰胺(1.5ml)浆液加入105mg 3-[1-H-(7-氮杂苯并三唑基)-氧基]-2-羟基-1-氨基丙烷。将混合物搅拌30分钟，在highvac上蒸发。将残余物悬浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)内结晶1小时，过滤，将沉淀用冰冷的甲醇洗涤，高真空干燥。Y＝121mg橙色结晶性固体。
实施例335-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3H-[1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(一般方法)向109mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮杂苯并三唑酯(制备如下在DMF(20ml)中，在Hunig碱(9.0mmol，1.58ml)的存在下，将(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亚甲基)-5-氯-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(1.520g，4.8mmol)用HATU试剂(1.768g，4.65mmol)活化，用氯仿(20ml)沉淀分离纯的形式，在高真空下干燥，收率94％(1.907g))的无水二甲基乙酰胺(1.5ml)浆液加入105mg 3-[1-H-(7-氮杂苯并三唑基)-氧基]-2-羟基-1-氨基丙烷。将混合物搅拌30分钟，在highvac上蒸发。将残余物悬浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)内结晶1小时，过滤，将沉淀用冰冷的甲醇洗涤，高真空干燥。Y＝130mg橙色结晶性固体。
实施例345-[(Z)-(5-三氟甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3H-[1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(一般方法)向121.5mg(0.25mmol)5-[(Z)-(5-三氟甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基-7-氮杂苯并三唑酯(制备如下在DMF(25ml)中，在Hunig碱(9.0mmol，1.58ml)的存在下，将(3Z)-3-({3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基}亚甲基)-5-三氟甲氧基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(1.768g，4.8mmol)用HATU试剂(1.758g，4.8mmol)活化，蒸发和用无水乙腈沉淀分离纯的形式，在高真空下干燥，收率85.5％(1.929g))的无水二甲基乙酰胺(1.5ml)浆液加入105mg 3-[1-H-(7-氮杂苯并三唑基)-氧基]-2-羟基-1-氨基丙烷。将混合物搅拌30分钟，高真空蒸发。将残余物悬浮在甲醇-二乙胺20∶1混合物(3ml)中，在冰箱(5℃)内结晶1小时，过滤，将沉淀用冰冷的甲醇洗涤，高真空干燥。Y＝142mg橙色结晶性固体。
实施例355-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3-氧-1H-1，2，3-苯并三唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺按照实施例32的方法，从105mg对应的胺制备。Y＝120mg橙色结晶性固体。
实施例365-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3-氧-1H-1，2，3-苯并三唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺按照实施例33的方法，从105mg对应的胺制备。Y＝127mg橙色结晶性固体。
实施例37N-[2-羟基-3-(3-氧-1H-1，2，3-苯并三唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺按照实施例34的方法，从105mg对应的胺制备。Y＝141mg橙色结晶性固体。
生物学实施例采用下列测定法发现那些证实有最佳程度的所需活性的化合物。
A.测定方法下列测定法可以用于测定不同的本发明化合物对一种或多种PK的活性和作用水平。利用本领域熟知的方法，可以对任意PK设计相似的测定法。
本文所述的若干测定法是按照ELISA(酶联免疫吸附三明治测定法)格式进行的(Voller等，1980，″Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，″Manual of Clinical Immunology，2d ed.，Rose and Friedman，Am.Soc.Of Microbiology，Washington，D.C.，pp.359-371)。一般程序如下向表达供试激酶的细胞按天然方式或重组方式引入化合物达所选择的时间阶段，然后，如果供试激酶是一种受体，那么加入已知激活该受体的配体。使细胞溶解，将溶胞产物转移至ELISA平板小孔，小孔预先涂有识别酶磷酸化反应底物的特异性抗体。洗去溶胞产物的非底物组分，利用特异性识别磷酸酪氨酸的抗体检测关于底物的磷酸化作用量，与没有接触供试化合物的对照细胞对比。
下面提供目前优选用于进行特异性PK的ELISA实验方案。不过，为了测定化合物对其他PTK以及CTK和STK的活性而对这些方案加以调整，也完全在本领域技术人员的知识范围内。本文所述的其他测定法测量响应于供试激酶的活化而产生的DNA量，这是增殖响应的一般量度。关于这种测定法的一般程序如下向表达供试激酶的细胞按天然方式或重组方式引入化合物达所选择的时间阶段，然后，如果供试激酶是一种受体，那么加入已知激活该受体的配体。培育至少过夜后，加入DNA标记试剂，例如5-溴脱氧尿苷(BrdU)或H3-胸苷。利用抗BrdU抗体或者通过测量放射性检测所标记的DNA量，与没有接触供试化合物的对照细胞对比。
GST-FLK-1生物测定法本测定法分析GST-Flk1对聚(glu，tyr)肽的酪氨酸激酶活性。
材料和试剂1、Corning 96孔ELISA平板(Corning Catalog No.5805-96)。
2、聚(glu，tyr)4∶1，冻干产物(Sigma Catalog#P0275)。
3、涂有聚(glu，tyr)(pEY)制备物的测定平板涂以2μg/孔聚(glu，tyr)(pEY)的100μl PBS溶液，保持在室温下达2小时或者在4℃下过夜。盖好平板防止蒸发。
4、PBS缓冲液关于1L，在大约900ml dH2O中混合0.2g KH2PO4，1.15g Na2HPO4，0.2g KCl和8g NaCl。当全部试剂都已溶解后，用HCl调节pH至7.2。用dH2O加至总体积1L。
5、PBST缓冲液向1L PBS缓冲液加入1.0ml Tween-20。
6、TBB-封闭缓冲液关于1L，在大约900ml dH2O中混合1.21gTRIS，8.77g NaCl，1ml Tween-20。用HCl调节pH至7.2。加入10gBSA，搅拌至溶解。用dH2O加至总体积1L。过滤除去颗粒物。
7、含1％BSA的PBS为了制备1x工作溶液，向大约990ml PBS缓冲液加入10g BSA，搅拌至溶解。用PBS缓冲液调节总体积至1L，过滤除去颗粒物。
8、50mM Hepes pH 7.5。
9、从sf9重组杆状病毒转化作用纯化的GST-Flk1cd(SUGEN，Inc.)。
10、含4％DMSO的dH2O。
11、含10mM ATP的dH2O。
12、40mM MnCl2。
13、激酶稀释缓冲液(KDB)混合10ml Hepes(pH 7.5)，1ml 5MNaCl，40μL 100mM原钒酸钠，0.4ml含5％BSA的dH2O和88.56mldH2O。
14、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板，Applied Scientific Catalog#AS-72092。
15、EDTA混合14.12g乙二胺四乙酸(EDTA)与大约70ml dH2O。加入10N NaOH直至EDTA溶解。调节pH至8.0。用dH2O调节总体积至100ml。
16、1°抗体稀释缓冲液混合10ml含5％BSA的PBS缓冲液与89.5ml TBST。
17、与辣根过氧化物酶缀合的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(PY99HRP，Santa Cruz Biotech)。
18、2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，Moss，Cat.No.ABST)。
19、10％SDS。
方法1、将Corning 96孔ELISA平板涂以2μg聚EY肽的无菌PBS溶液，如“材料和试剂”的步骤3所述。
2、倒置平板，从小孔中除去未结合的液体。用TBST洗涤一次。在纸巾上轻拍平板，除去过量液体。
3、向每孔加入100μl含1％BSA的PBS。在室温下培育1小时，并摇动。
4、重复步骤2。
5、用50mM HEPES(pH 7.5)浸泡小孔(150μl/孔)。
6、在96孔聚丙烯平板中，用dH2O/4％DMSO稀释供试化合物至4倍于所需最终测定浓度。
7、向ELISA平板加入25μl稀释后的供试化合物。在对照小孔中，放置25μl dH2O/4％DMSO。
8、向每孔加入25μl 40mM MnCl2和4x ATP(2μM)。
9、向阴性对照小孔加入25μl 0.5M EDTA。
10、用KDB稀释GST-Flk1至0.005μg(5ng)/孔。
11、向每孔加入50μl稀释后的酶。
12、在室温下培育15分钟，并摇动。
13、加入50μl 250mM EDTA(pH 8.0)终止反应。
14、用TBST洗涤3X，在纸巾上轻拍平板，除去过量液体。
15、加入100μl/孔的抗磷酸酪氨酸HRP缀合物在抗体稀释缓冲液中的1∶5,000稀释液。在室温下培育90分钟，并摇动。
16、洗涤，同步骤14。
17、向每孔加入100μl室温ABTS溶液。
18、培育10至15分钟，并摇动。除去所有气泡。
19、向每孔加入20μl 10％SDS终止反应。
20、在Dynatech MR7000 ELISA读数器上读取结果，供试滤光器设置在410nM下，参照滤光器设置在630nM下。
PYK2生物测定法本测定法用于在ELISA测定法中测量HA表位定向的全长pyk2(FL.pyk2-HA)的体外激酶活性。
材料和试剂1、Corning 96孔ELISA平板。
2、12CA5单克隆抗HA抗体(SUGEN，Inc.)。
3、PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，Gibco Catalog#450-1300EB)。
4、TBST缓冲液关于1L，在大约900ml dH2O中混合8.766g NaCl，6.057g TRIS和1ml 0.1％Triton X-100。调节pH至7.2，加至体积1L。
5、封闭缓冲液关于1L，混合100g 10％BSA，12.1g 100mM TRIS，58.44g NaCl和10mL 1％Tween-20。
6、来自sf9溶胞产物的FL.pyk2-HA(SUGEN，Inc.)。
7、含4％DMSO的MilliQue H2O。
8、含10mM ATP的dH2O。
9、1M MnCl2。
10、1M MgCl2。
11、1M二硫苏糖醇(DTT)。
12、10X激酶缓冲液磷酸化在2.8ml dH2O中混合5.0ml 1M Hepes(pH 7.5)，0.2ml 1M MnCl2，1.0ml 1M MgCl2，1.0ml 10％Triton X-100。在使用前加入0.1ml 1M DTT。
13、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
14、含500mM EDTA的dH2O。
15、抗体稀释缓冲液关于100ml，在88ml TBS中混合1mL 5％BSA/PBS和1mL 10％Tween-20。
16、与HRP缀合的抗Ptyr PY99，Santa Cruz Biotech Cat.No.SC-7020。
17、ABTS，Moss，Cat.No.ABST-2000。
18、10％SDS。
方法1、将Corning 96孔ELISA平板涂以0.5μg每孔的12CA5抗HA抗体的100μl PBS溶液。在4℃下贮存过夜。
2、倒置平板，从小孔中除去未结合的HA抗体。用dH2O洗涤平板。在纸巾上轻拍平板，除去过量液体。
3、向每孔加入150μl封闭缓冲液。在室温下培育30分钟，并摇动。
4、用TBS-T洗涤平板4x。
5、在PBS中稀释细胞溶胞产物(1.5μg细胞溶胞产物/100μl PBS)。
6、向每孔加入100μl稀释后的细胞溶胞产物。在室温下摇动1小时。
7、洗涤，同步骤4。
8、向含有所捕获的pyk2-HA的ELISA平板加入50μl 2X激酶缓冲液。
9、向每孔加入25μl含400μM供试化合物的4％DMSO。对照小孔使用单独的4％DMSO。
10、向阴性对照孔加入25μl 0.5M EDTA。
11、向所有小孔加入25μl 20μM ATP。培育10分钟，并摇动。
12、向所有小孔加入25μl 500mM EDTA(pH 8.0)，终止反应。
13、洗涤，同步骤4。
14、向每孔加入100μl按1∶6000稀释在抗体稀释缓冲液中的与HRP缀合的抗Ptyr。在室温下培育1小时，并摇动。
15、用TBST洗涤平板3X，用PBS洗涤1X。
16、向每孔加入100μl ABST溶液。
17、如果必要的话，向每孔加入20μl 10％SDS终止显色反应。
18、在ELISA读数器上读取平板，供试滤光器设置在410nM下，参照滤光器设置在630nM下。
FGFR1生物测定法本测定法用于在ELISA测定法中测量FGF1-R的体外激酶活性。
材料和试剂1、Costar 96孔ELISA平板(Corning Catalog#3369)。
2、聚(Glu-Tyr)(Sigma Catalog#P0275)。
3、PBS(Gibco Catalog#450-1300EB)。
4、50mM Hepes缓冲溶液。
5、封闭缓冲液(5％BSA/PBS)。
6、纯化的GST-FGFR1(SUGEN，Inc.)。
7、激酶稀释缓冲液。混合500μl 1M Hepes(GIBCO)，20μl 5％BSA/PBS，10μl 100mM原钒酸钠和50μl 5M NaCl。
8、10mM ATP。
9、ATP/MnCl2磷酸化混合物混合20μl ATP，400μl 1M MnCl2和9.56ml dH2O。
10、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板(Applied Scientific Catalog#AS-72092)。
11、0.5M EDTA。
12、0.05％TBST。向1升TBS加入500μl Tween。
13、兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)。
14、山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(Biosource，Catalog#ALI0404)。
15、ABTS溶液。
16、ABTS/H2O2溶液。
方法1、将Costar 96孔ELISA平板涂以1μg每孔的聚(Glu，Tyr)的100μl PBS溶液。在4℃下贮存过夜。
2、用PBS洗涤涂过的平板一次。
3、向每孔加入150μl 5％BSA/PBS封闭缓冲液。在室温下培育1小时，并摇动。
4、用PBS洗涤平板2x，然后用50mM Hepes洗涤一次。在纸巾上轻拍平板，除去过量液体和气泡。
5、向平板加入25μl含0.4mM供试化合物的4％DMSO或单独的4％DMSO(对照)。
6、在激酶稀释缓冲液中稀释纯化的GST-FGFR1(5ng激酶/50μlKDB/孔)。
7、向每孔加入50μl稀释后的激酶。
8、加入25μl/孔的新鲜制备的ATP/Mn++(0.4ml 1M MnCl2，40μl10mM ATP，9.56ml dH2O)，开始激酶反应。
9、这是一种快速的激酶反应，必须用25μl 0.5M EDTA终止，方式类似于ATP的加入。
10、用新鲜的TBST洗涤平板4x。
11、配制抗体稀释缓冲液每50ml混合5ml 5％BSA，250μl 5％牛奶和50μl 100mM钒酸钠，用0.05％TBST加至最终体积。
12、加入100μl每孔的抗磷酸酪氨酸(在ADB中的1∶10000稀释液)。在室温下培育1小时，并摇动。
13、洗涤，同步骤10。
14、加入100μl每孔的Biosource山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(在ADB中的1∶6000稀释液)。在室温下培育1小时，并摇动。
15、洗涤，同步骤10，然后用PBS洗涤，除去气泡和过量Tween。
16、向每孔加入100μl ABTS/H2O2溶液。
17、培育10至20分钟，并摇动。除去所有气泡。
18、在Dynatech MR7000 ELISA读数器上读取测定结果，供试滤光器设置在410nM下，参照滤光器设置在630nM下。
EGFR测定法本测定法用于在ELISA测定法中测量FGF1-R的体外激酶活性。
材料和试剂1、Corning 96孔ELISA平板。
2、SUMO1单克隆抗EGFR抗体(SUGEN，Inc.)。
3、PBS。
4、TBST缓冲液。
5、封闭缓冲液关于100ml，混合5.0g Carnation Instant脱脂牛奶和100ml PBS。
6、A431细胞溶胞产物(SUGEN，Inc.)。
7、TBS缓冲液。
8、TBS+10％DMSO关于1L，混合1.514g TRIS，2.192g NaCl和25ml DMSO；用dH2O加至1升总体积。
9、ATP(腺苷-5′-三磷酸，来自马肌肉，Sigma Cat.No.A-5394)，在dH2O中的1.0mM溶液。该试剂应当现用现配，保存在冰上。
10、1.0mM MnCl2。
11、ATP/MnCl2磷酸化混合物混合300μl 1mM ATP，500μl MnCl2和9.2ml dH2O。现用现配，保存在冰上。
12、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
13、EDTA。
14、兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)。
15、山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(Biosource Cat.No.ALI0404)。
16、ABTS。
17、30％过氧化氢。
18、ABTS/H2O2。
19、0.2M HCl。
方法1、将Corning 96孔ELISA平板每孔涂以0.5μg SUMO1的100μlPBS溶液，在4℃下贮存过夜。
2、倒置平板，从小孔中除去未结合的SUMO1，以除去液体。用dH2O洗涤1x。在纸巾上轻拍平板，除去过量液体。
3、向每孔加入150μl封闭缓冲液。在室温下培育30分钟，并摇动。
4、用去离子水洗涤平板3x，然后用TBST洗涤一次。在纸巾上轻拍平板，除去过量液体和气泡。
5、在PBS中稀释溶胞产物(7μg溶胞产物/100μl PBS)。
6、向每孔加入100μl稀释后的溶胞产物。在室温下摇动1小时。
7、洗涤平板，同上4。
8、向含有所捕获的EGFR的ELISA平板加入120μl TBS。
9、在TBS中按1∶10稀释供试化合物，置于小孔中。
10、向ELISA平板加入13.5μl稀释后的供试化合物。向对照小孔加入13.5μl TBS的10％DMSO溶液。
11、在室温下培育30分钟，并摇动。
12、向除阴性对照小孔以外的所有小孔加入15μl磷酸化混合物。最终的小孔容量应当为大约150μl，每孔中的最终浓度为3μMATP/5mM MnCl2。培育5分钟，并摇动。
13、加入16.5μl EDTA溶液终止反应，并摇动。摇动另外1分钟。
14、用去离子水洗涤4x，用TBST洗涤2x。
15、每孔加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中的1∶3000稀释液)。在室温下培育30-45分钟，并摇动。
16、洗涤，同上4。
17、向每孔加入100μl Biosource山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(在TBST中的1∶2000稀释液)。在室温下培育30分钟，并摇动。
18、洗涤，同上4。
19、向每孔加入100μl ABTS/H2O2溶液。
20、培育5至10分钟，并摇动。除去所有气泡。
21、如果必要的话，每孔加入100μl 0.2M HCl终止反应。
22、在Dynatech MR7000 ELISA读数器上读取测定结果，供试滤光器设置在410nM下，参照滤光器设置在630nM下。
PDGFR生物测定法本测定法用于在ELISA测定法中测量FGF1-R的体外激酶活性。
材料和试剂1、Corning 96孔ELISA平板。
2、28D4C10单克隆抗PDGFR抗体(SUGEN，Inc.)。
3、PBS。
4、TBST缓冲液。
5、封闭缓冲液(与EGFR生物测定法相同)。
6、表达PDGFR-β的NIH 3T3细胞溶胞产物(SUGEN，Inc.)。
7、TBS缓冲液。
8、TBS+10％DMSO。
9、ATP。
10、MnCl2。
11、激酶缓冲液磷酸化混合物关于10ml，在足够的dH2O中混合250μl 1M TRIS，200μl 5M NaCl，100μl 1M MnCl2和50μl 100mMTriton X-100，制成10ml。
12、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
13、EDTA。
14、兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)。
15、山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(Biosource Cat.No.ALI0404)。
16、ABTS。
17、过氧化氢，30％溶液。
18、ABTS/H2O2。
19、0.2M HCl。
方法1、将Corning 96孔ELISA平板每孔涂以0.5μg 28D4C10的100μlPBS溶液，在4℃下贮存过夜。
2、倒置平板，从小孔中除去未结合的28D4C10，以除去液体。用dH2O洗涤1x。在纸巾上轻拍平板，除去过量液体。
3、向每孔加入150μl封闭缓冲液。在室温下培育30分钟，并摇动。
4、用去离子水洗涤平板3x，然后用TBST洗涤一次。在纸巾上轻拍平板，除去过量液体和气泡。
5、在HNTG中稀释溶胞产物(10μg溶胞产物/100μl HNTG)。
6、向每孔加入100μl稀释后的溶胞产物。在室温下摇动60分钟。
7、洗涤平板，如步骤4所述。
8、向含有所捕获的PDGFR的ELISA平板加入80μl工作激酶缓冲液混合物。
9、在TBS中按1∶10稀释供试化合物，置于96孔聚丙烯平板中。
10、向ELISA平板加入10μl稀释后的供试化合物。向对照小孔加入10μl TBS+10％DMSO。在室温下培育30分钟，并摇动。
11、直接向除阴性对照小孔以外的所有小孔加入10μl ATP(最终的小孔容量应当为大约100μl，每孔含有20μM ATP)。培育30分钟，并摇动。
12、向每孔加入10μl EDTA溶液终止反应。
13、用去离子水洗涤4x，用TBST洗涤2x。
14、每孔加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中的1∶3000稀释液)。在室温下培育30-45分钟，并摇动。
15、洗涤，同步骤4。
16、向每孔加入100μl Biosource山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(在TBST中的1∶2000稀释液)。在室温下培育30分钟，并摇动。
17、洗涤，同步骤4。
18、向每孔加入100μl ABTS/H2O2溶液。
19、培育10至30分钟，并摇动。除去所有气泡。
20、如果必要的话，每孔加入100μl 0.2M HCl终止反应。
21、在Dynatech MR7000 ELISA读数器上读取测定结果，供试滤光器设置在410nM下，参照滤光器设置在630nM下。
细胞HER-2激酶测定法本测定法用于按ELISA格式测量全细胞中的HER-2激酶活性。
材料和试剂1、DMEM(GIBCO Catalog# 11965-092)。
2、胎牛血清(FBS，GIBCO Catalog# 16000-044)，在56℃水浴中热灭活30分钟。
3、胰蛋白酶(GIBCO Catalog# 25200-056)。
4、L-谷氨酰胺(GIBCO Catalog# 25030-081)。
5、HEPES(GIBCO Catalog# 15630-080)。
6、生长培养基混合500ml DMEM，55ml热灭活FBS，10mlHEPES和5.5ml L-谷氨酰胺。
7、饥饿培养基混合500ml DMEM，2.5ml热灭活FBS，10mlHEPES和5.5ml L-谷氨酰胺。
8、PBS。
9、平底96孔组织培养微量滴定平板(Corning Catalog# 25860)。
10、15cm组织培养皿(Corning Catalog# 08757148)。
11、Corning 96孔ELISA平板。
12、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
13、用于Transtar 96的Costar转移药筒(Costar Catalog# 7610)。
14、SUMO1单克隆抗EGFR抗体(SUGEN，Inc.)。
15、TBST缓冲液。
16、封闭缓冲液含5％Carnation Instant牛奶的PBS。
17、EGF配体EGF-201，Shinko American，Japan。将粉末悬浮在100μl 10mM HCl中。加入100μl 10mM NaOH。加入800μl PBS，转移至Eppendorf试管，贮存在-20℃下备用。
18、HNTG溶解缓冲液。关于储备5X HNTG，混合23.83g Hepes，43.83g NaCl，500ml甘油，100ml Triton X-100和足够的dH2O，制成1L溶液。关于1X HNTG*，混合2ml HNTG，100μl 0.1M Na3VO4，250μl0.2M Na4P2O7和100μl EDTA。
19、EDTA。
20、Na3VO4。为了制备储备溶液，混合1.84g Na3VO4与90mldH2O。调节pH至10。在微波中沸腾1分钟(溶液变澄清)。冷却至室温。调节pH至10。重复加热/冷却循环，直至pH停留在10。
21、200mM Na4P2O7。
22、磷酸酪氨酸特异性兔多克隆抗血清(抗Ptyr抗体，SUGEN，Inc.)。
23、亲合性纯化抗血清，山羊抗兔IgG抗体，过氧化物酶缀合物(Biosource Cat# AL10404)。
24、ABTS溶液。
25、30％过氧化氢溶液。
26、ABTS/H2O2。
27、0.2M HCl。
方法1、将Corning 96孔ELISA平板涂以SUMO1的PBS溶液，每孔1.0μg，最终体积100μl/孔。在4℃下贮存过夜。
2、在使用当天，除去涂覆缓冲液，用dH2O洗涤平板3次，用TBST缓冲液洗涤一次。本测定法中的所有洗涤都应当以这种方式进行，另有指定的除外。
3、向每孔加入100μl封闭缓冲液。在室温下培育30分钟，并摇动。临使用前洗涤平板。
4、本测定法使用EGFr/HER-2嵌合体/3T3-C7细胞系。
5、选择具有80-90％融合率的平皿。通过胰蛋白酶的作用收集细胞，在室温、1000rpm下离心5分钟。
6、将细胞再次悬浮在饥饿培养基中，用台盼蓝计数。要求存活率在90％以上。在96孔微量滴定平板中，将细胞接种在饥饿培养基中，密度为2,500细胞每孔，90μl每孔。在37℃、5％CO2下培育所接种的细胞。
7、接种后两天开始测定。
8、将供试化合物溶于4％DMSO。然后将样本直接用饥饿DMEM稀释在平板上。通常，该稀释比将是1∶10或以上。然后将所有小孔转移至细胞平板，进一步用饥饿培养基按1∶10稀释(向90μl饥饿培养基加入10μl样本与培养基)。最终的DMSO浓度应当是1％或以下。还可以采用标准系列稀释。
9、在5％CO2、37℃下培育2小时。
10、将储备EGF(16.5μM)稀释在温热的DMEM中至150nM，制成EGF配体。
11、制备新鲜的HNTG*，足够每孔100μl；置于冰上。
12、与供试化合物培育2小时后，向细胞加入所制备的EGF配体，50μl每孔，最终浓度50nM。阳性对照小孔接受等量的EGF。阴性对照不接受EGF。在37℃下培育10分钟。
13、除去供试化合物、EGF和DMEM。用PBS洗涤细胞一次。
14、转移HNTG*至细胞，100μl每孔。置于冰上5分钟。同时，从ELISA平板上除去封闭缓冲液，洗涤。
15、用微量吸移管从平板上刮取细胞，通过反复搅拌和分散HNTG*溶解缓冲液，使细胞材料均质化。转移溶胞产物至经过涂覆的、封闭的、洗涤的ELISA平板。或者，利用Costar转移药筒转移溶胞产物至平板。
16、在室温下培育1小时，并摇动。
17、除去溶胞产物，洗涤。转移新鲜稀释的抗Ptyr抗体(按1∶3000稀释在TBST中)至ELISA平板，100μl每孔。
18、在室温下培育30分钟，并摇动。
19、除去抗Ptry抗体，洗涤。转移新鲜稀释的BIOSOURCE抗体(按1∶8000稀释在TBST中)至ELISA平板，100μl每孔。
20、在室温下培育30分钟，并摇动。
21、除去BIOSOURCE抗体，洗涤。转移新鲜制备的ABTS/H2O2溶液至ELISA平板，100μl每孔。
22、培育5-10分钟，并摇动。除去所有气泡。
23、每孔加入100μl 0.2M HCl终止反应。
24、在Dynatech MR7000 ELISA读数器上读取测定结果，供试滤光器设置在410nM下，参照滤光器设置在630nM下。
CDK2/细胞周期蛋白A测定法本测定法用于在闪烁近似性测定法(SPA)中测量人cdk2/细胞周期蛋白A的体外丝氨酸/苏氨酸激酶活性。
材料和试剂1、Wallac 96孔聚乙烯对苯二甲酸酯(flexi)平板(Wallac Catalog#1450-401)。
2、Amersham Redivue[γ33P] ATP(Amersham catalog# AH 9968)。
3、Amersham涂有链霉抗生物素的聚乙烯甲苯SPA珠粒(Amersham catalog# RPNQ0007)。珠粒应当在不含镁或钙的PBS中再生，浓度20mg/ml。
4、从Sf9细胞纯化的活化cdk2/细胞周期蛋白A酶复合体(SUGEN，Inc.)。
5、生物素基化的肽底物(Debtide)。将肽生物素-X-PKTPKKAKKL溶于dH2O，浓度5mg/ml。
6、肽/ATP混合物关于10ml，混合9.979ml dH2O，0.00125ml″冷″ATP，0.010ml Debtide和0.010ml[γ33P]ATP。每孔的最终浓度将是0.5μM″冷″ATP，0.1μg Debtide和0.2μCi γ33P ATP。
7、激酶缓冲液关于10ml，混合8.85ml dH2O，0.625ml TRIS(pH7.4)，0.25ml 1M MgCl2，0.25ml 10％NP40和0.025ml 1M DTT，临使用前加入新鲜品。
8、含10mM ATP的dH2O。
9、1M Tris，用HCl调节pH至7.4。
10、1M MgCl2。
11、1M DTT。
12、PBS(Gibco Catalog# 14190-144)。
13、0.5M EDTA。
14、终止溶液关于10ml，混合9.25ml PBS，0.005ml 100mM ATP，0.1ml 0.5M EDTA，0.1ml 10％Triton X-100和1.25ml 20mg/ml SPA珠粒。
方法1、在5％DMSO中制备供试化合物的溶液，浓度5倍于所需最终浓度。向每孔加入10μl。关于阴性对照，在小孔中使用单独的10μl5％DMSO。
2、将5μl cdk2/细胞周期蛋白A溶液用2.1ml 2x激酶缓冲液稀释。
3、向每孔加入20μl酶。
4、向阴性对照小孔加入10μl 0.5M EDTA。
5、为了开始酶反应，向每孔加入20μl肽/ATP混合物。培育1小时，不摇动。
6、向每孔加入200μl终止溶液。
7、保持至少10分钟。
8、使平板在大约2300rpm下自旋3-5分钟。
9、利用Trilux或相似的读数器计数平板。
MET转磷酸作用测定法本测定法用于测量关于聚(谷氨酸∶酪氨酸(4∶1))的磷酸酪氨酸水平，作为鉴别对底物met转磷酸作用的激动作用/拮抗作用的手段。
材料和试剂1、Corning 96孔ELISA平板，Corning Catalog# 25805-96。
2、聚(glu，tyr)4∶1，Sigma，Cat.No；P 0275。
3、PBS，Gibco Catalog# 450-1300EB。
4、50mM HEPES。
5、封闭缓冲液将25g牛血清白蛋白Sigma Cat.No A-7888溶于500ml PBS，通过4μm滤器过滤。
6、纯化的GST融合蛋白，含有met激酶结构域，Sugen，Inc。
7、TBST缓冲液。
8、10％含水(MilliQue H2O)DMSO。
9、10mM含水(dH2O)腺苷-5′-三磷酸，Sigma Cat.No.A-5394。
10、2X激酶稀释缓冲液关于100ml，在88.4ml dH2O中混合10ml1M HEPES pH 7.5，0.4ml 5％BSA/PBS，0.2ml 0.1M原钒酸钠和1mL5M氯化钠。
11、4X ATP反应混合物关于10ml，在9.56ml dH2O中混合0.4ml1M氯化锰和0.02mL 0.1M ATP。
12、4X阴性对照混合物关于10ml，在9.6ml dH2O中混合0.4ml1M氯化锰。
13、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板，Applied Scientific Catalog#S-72092。
14、500mM EDTA。
15、抗体稀释缓冲液关于100ml，在88.4ml TBST中混合10ml5％BSA/PBS，0.5ml含5％Carnation Instant牛奶的PBS和0.1ml0.1M原钒酸钠。
16、兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗体，Sugen，Inc。
17、山羊抗兔辣根过氧化物酶缀合抗体，Biosource，Inc。
18、ABTS溶液关于1L，混合19.21g柠檬酸，35.49g Na2HPO4和500mg ABTS，用足量dH2O加至1L。
19、ABTS/H2O2在使用前5分钟混合15ml ABST溶液与2μlH2O2。
20、0.2M HCl。
方法1、将ELISA平板涂以2μg聚(Glu-Tyr)的100μl PBS溶液，在4℃下贮存过夜。
2、将平板用150μl 5％BSA/PBS封闭60分钟。
3、用PBS洗涤平板两次，用50mM Hepes缓冲液pH 7.4洗涤一次。
4、向所有小孔加入50μl稀释后的激酶(将纯化的激酶用激酶稀释缓冲液稀释。最终浓度应当是10ng/孔)。
5、向平板加入25μl供试化合物(的4％DMSO溶液)或单独的DMSO(的4％dH2O溶液)，用于对照。
6、将激酶/化合物混合物培育15分钟。
7、向阴性对照小孔加入25μl 40mM MnCl2。
8、向所有其他小孔(阴性对照除外)加入25μl ATP/MnCl2混合物。培育5分钟。
9、加入25μl 500mM EDTA终止反应。
10、用TBST洗涤平板3x。
11、向每孔加入按1∶10,000稀释在抗体稀释缓冲液中的100μl兔多克隆抗Ptyr。在室温下培育1小时，并摇动。
12、用TBST洗涤平板3x。
13、将Biosource与HRP缀合的抗兔抗体按1∶6,000稀释在抗体稀释缓冲液中。每孔加入100μl，在室温下培育1小时，并摇动。
14、用PBS洗涤平板1x。
15、向每孔加入100μl ABTS/H2O2。
16、如果必要的话，每孔加入100μl 0.2M HCl终止显色反应。
17、在Dynatech MR7000 ELISA读数器上读取平板，供试滤光器设置在410nM，参照滤光器设置在630nM。
IGF-1转磷酸作用测定法本测定法用于测量聚(谷氨酸∶酪氨酸(4∶1))中的磷酸酪氨酸水平，用于鉴别对底物gst-IGF-1转磷酸作用的激动作用/拮抗作用。
材料和试剂1、Corning 96孔ELISA平板。
2、聚(glu，tyr)4∶1，Sigma，Cat.No；P 0275。
3、PBS，Gibco Catalog# 450-1300EB。
4、50mM HEPES。
5、TBB封闭缓冲液关于1L，混合100g BSA，12.1g TRIS(pH 7.5)，58.44g氯化钠和10ml 1％Tween-20。
6、纯化的GST融合蛋白，含有IGF-1激酶结构域，Sugen，Inc。
7、TBST缓冲液关于1L，混合6.057 Tris，8.766g氯化钠和0.5mlTween-20，用足够的dH2O加至1升。
8、含4％DMSO的MilliQue H2O。
9、含10mM ATP的dH2O。
10、2X激酶稀释缓冲液关于100ml，混合10ml 1M HEPES pH7.5，0.4ml含5％BSA的dH2O，0.2ml 0.1M原钒酸钠和1mL 5M氯化钠，用足够的dH2O加至100ml。
11、4X ATP反应混合物关于10ml，混合0.4ml 1M MnCl2，0.008mL 0.01M ATP和9.56ml dH2O。
12、4X阴性对照混合物关于10ml，混合0.4ml 1M氯化锰和9.60ml dH2O。
13、NUNC 96孔V形底聚丙烯平板。
14、含500mM EDTA的dH2O。
15、抗体稀释缓冲液关于100ml，在88.4ml TBST中混合10ml含5％BSA的PBS，0.5ml含5％Carnation Instant无脂牛奶的PBS和0.1ml 0.1M原钒酸钠。
16、兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗体，Sugen，Inc。
17、山羊抗兔HRP缀合抗体，Biosource，Inc。
18、ABTS溶液。
20、ABTS/H2O2在使用前5分钟混合15ml ABST与2μl H2O2。
21、含0.2M HCl的dH2O。
方法1、将ELISA平板涂以2.0μg/孔的聚(Glu-Tyr)4∶1(Sigma P0275)的100μl PBS溶液，将平板在4℃下贮存过夜。
2、用PBS洗涤平板一次。
3、向每孔加入100μl TBB封闭缓冲液。在室温下培育1小时，并摇动。
4、用PBS洗涤平板一次，然后用50mM Hepes缓冲液pH 7.5洗涤两次。
5、向平板加入25μl供试化合物的4％DMSO溶液(将10mM供试化合物在100％DMSO中的储备溶液用dH2O稀释而得)。
6、向所有小孔加入10.0ng gst-IGF-1激酶的50μl激酶稀释缓冲液。
7、向所有供试小孔和阳性对照小孔加入25μl 4X ATP反应混合物，开始激酶反应。向所有阴性对照小孔加入25μl 4X阴性对照混合物。在室温下培育10分钟，并摇动。
8、向所有小孔加入25μl 0.5M EDTA(pH 8.0)。
9、用TBST缓冲液洗涤平板4x。
10、向所有小孔加入按1∶10,000稀释在100μl抗体稀释缓冲液中的兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗血清。在室温下培育1小时，并摇动。
11、洗涤平板，同步骤9。
12、向所有小孔加入100μl按1∶10,000稀释在抗体稀释缓冲液中的Biosource抗兔HRP。在室温下培育1小时，并摇动。
13、洗涤平板，同步骤9，然后用PBS洗涤一次，以减少气泡和过量的Tween-20。
14、向每孔加入100μl ABTS/H2O2，显色。
15、约5分钟后，在ELISA读数器上读数，供试滤光器设置在410nM，参照滤光器设置在630nM。
BRDU掺入测定法下列测定法使用被加工以表达所选择的受体的细胞，然后通过测定向DNA掺入的BrdU，评价有关化合物对配体诱导DNA合成的作用。
下列材料、试剂和程序是每种下列BrdU掺入测定法所通用的。具体测定法的差别已注明。
材料和试剂1、适当的配体。
2、适当的被加工的细胞。
3、BrdU标记试剂10mM，PBS溶液(pH 7.4)(BoehringerMannheim，Germany)。
4、FixDenat固定溶液(即用型)(Boehringer Mannheim，Germany)。
5、抗-BrdU-POD与过氧化物酶缀合的小鼠单克隆抗体(Boehringer Mannheim，Germany)。
6、TMB底物溶液四甲基联苯胺(TMB，Boehringer Mannheim，Germany)。
7、PBS洗涤溶液1X PBS，pH 7.4。
8、牛白蛋白(BSA)，V级粉末(Sigma Chemical Co.，USA)。
一般方法1、将10％CS、2mM Gln的DMEM中的细胞接种在96孔平板中，8000细胞/孔。将细胞在37℃、5％CO2下培育过夜。
2、24小时后，将细胞用PBS洗涤，然后在无血清培养基(含0.1％BSA的0％CS DMEM)中饥饿24小时。
3、第3天，同时向细胞加入适当的配体和供试化合物。阴性对照小孔仅接受含0.1％BSA的无血清DMEM；阳性对照小孔接受配体但是没有供试化合物。在96孔平板中制备供试化合物在含有配体的无血清DMEM中的溶液，连续稀释成7种供试浓度。
4、配体活化18小时后，加入稀释后的BrdU标记试剂(按1∶100稀释在含0.1％BSA的DMEM中)，将细胞与BrdU(最终浓度＝10μM)培育1.5小时。
5、与标记试剂培育后，倾析和轻拍倒置在纸巾上的平板，除去培养基。加入FixDenat溶液(50μl/孔)，在平板摇动器上在室温下培育45分钟。
6、倾析和轻拍倒置在纸巾上的平板，彻底除去FixDenat溶液。加入牛奶(含5％脱水牛奶的PBS，200μl/孔)作为封闭溶液，在平板摇动器上将平板在室温下培育30分钟。
7、倾析除去封闭溶液，将小孔用PBS洗涤一次。加入抗-BrdU-POD溶液(按1∶200稀释在含1％BSA的PBS中)(50μl/孔)，在平板摇动器上将平板在室温下培育90分钟。
8、倾析和用PBS冲洗小孔5次，彻底除去抗体缀合物，将平板倒置在纸巾上轻拍，使干燥。
9、加入TMB底物溶液(100μl/孔)，在平板摇动器上在室温下培育20分钟，直至显色足以进行光度检测。
10、在Dynatech ELISA平板读数器上，在410nm下测量样本的吸光度(以“双波长”模式，滤光器在490nm下的读数作为参照波长)。
EGF诱导BrdU掺入测定法材料和试剂1、小鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2、3T3/EGFRc7。
EGF诱导的Her-2驱动的BrdU掺入测定法材料和试剂1、小鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2、3T3/EGFr/Her2/EGFr(具有Her-2激酶结构域的EGFr)。
EGF诱导的Her-4驱动的BrdU掺入测定法材料和试剂1、小鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2、3T3/EGFr/Her4/EGFr(具有Her-4激酶结构域的EGFr)。
PDGF诱导BrdU掺入测定法材料和试剂1、人PDGF B/B(Boehringer Mannheim，Germany)。
2、3T3/EGFRc7。
FGF诱导BrdU掺入测定法材料和试剂1、人EGF2/bFGF(Gibco BRL，USA)。
2、3T3c7/EGFr。
IGF-1诱导BrdU掺入测定法材料和试剂1、人重组(G511，Promega Corp.，USA)。
2、3T3/IGF1r。
胰岛素诱导BrdU掺入测定法材料和试剂1、胰岛素，结晶性，牛，锌(13007，Gibco BRL，USA)。
2、3T3/H25。
HGF诱导BrdU掺入测定法材料和试剂；1、重组人HGF(Cat.No.249-HG，R&D Systems，Inc.，USA)。
2、BxPC-3细胞(ATCC CRL-1687)。
方法1、将含10％FBS的RPMI中的细胞接种在96孔平板中，9000细胞/孔。将细胞在37℃、5％CO2下培育过夜。
2、24小时后，将细胞用PBS洗涤，然后在100μl无血清培养基(含0.1％BSA的RPMI)中饥饿24小时。
3、第3天，向细胞加入25μl配体(在含0.1％BSA的RPMI中制成1μg/ml；最终的HGF浓度为200ng/ml)和供试化合物。阴性对照小孔仅接受25μl含0.1％BSA的无血清RPMI；阳性对照小孔接受配体(HGF)但是没有供试化合物。在96孔平板中制备供试化合物在含有配体的无血清RPMI中的溶液，浓度5倍于它们的最终浓度，连续稀释，得到7种供试浓度。通常，供试化合物的最高最终浓度为100μM，稀释比使用1∶3(也就是说，最终的供试化合物浓度范围为0.137-100μM)。
4、配体活化18小时后，向每孔加入12.5μl稀释后的BrdU标记试剂(按1∶100稀释在含0.1％BSA的RPMI中)，将细胞与BrdU(最终浓度为10μM)培育1小时。
5、与一般程序相同。
6、与一般程序相同。
7、倾析除去封闭溶液，将小孔用PBS洗涤一次。加入抗-BrdU-POD溶液(按1∶100稀释在含1％BSA的PBS中)(100μl/孔)，在平板摇动器上将平板在室温下培育90分钟。
8、与一般程序相同。
9、与一般程序相同。
10、与一般程序相同。
HUV-EC-C测定法本测定法用于测量化合物对PDGF-R、FGF-R、VEGF、aFGF或Flk-1/KDR的活性，它们都是被HUV-EC细胞天然表达的。
第0天1、洗涤和用胰蛋白酶处理HUV-EC-C细胞(人脐静脉内皮细胞，American Type Culture Collection，catalogue no.1730 CRL)。用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS，得自Gibco BRL，catalogue no.14190-029)洗涤2次，用量约1ml/10cm2组织培养瓶。用0.05％胰蛋白酶-EDTA的无酶细胞解离溶液(Sigma Chemical Company，catalogueno.C-1544)进行胰蛋白酶处理。0.05％胰蛋白酶是这样制备的，将0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA(Gibco，catalogue no.25200-049)稀释在细胞解离溶液中。在37℃下用1ml/25-30cm2组织培养瓶的胰蛋白酶处理约5分钟。细胞从瓶子脱离后，加入等体积的测定培养基，转移至50ml无菌离心管(Fisher Scientific，catalogue no.05-539-6)。
2、如下在50ml无菌离心管内将细胞用约35ml测定培养基洗涤加入测定培养基，在大约200xg下离心10分钟，搅拌上清液，用35mlD-PBS再次悬浮。用D-PBS重复洗涤两次，将细胞再次悬浮在约1ml测定培养基/15cm2组织培养瓶中。测定培养基由F12K培养基(GibcoBRL，catalogue no.21127-014)和0.5％热灭活的胎牛血清组成。用Coulter计数器(Coulter Electronics，Inc.)计数细胞，向细胞加入测定培养基，得到浓度为0.8-1.0×105细胞/ml。
3、向96孔平底平板加入细胞，密度为100μl/孔或0.8-1.0×104细胞/孔，在37℃、5％CO2下培育～24小时。
第1天1、在单独的96孔平板中进行两倍供试化合物滴定，一般50μM向下至0μM。使用与上述第0天第2步相同的测定培养基。滴定是这样进行的，向特定平板列的顶部小孔加入90μl/孔的供试化合物，浓度为200μM(4倍于最终的小孔浓度)。由于储备供试化合物通常是20mMDMSO溶液，200μM药物浓度含有2％DMSO。
使用含2％DMSO的测定培养基(F12K+0.5％胎牛血清)作为供试化合物滴定的稀释剂，目的是稀释供试化合物，但是保持DMSO浓度恒定。向该列其余小孔加入这种稀释剂，60μl/孔。从该列顶部小孔中的120μl 200μM供试化合物稀释液中取60μl，与该列第二小孔中的60μl混合。从该小孔中取60μl，与该列第三小孔中的60μl混合，依此类推，直至完成两倍滴定。在混合倒数第二个小孔时，从该小孔的120μl中取60μl弃去。留下含有60μl DMSO/培养基稀释剂的最后一个小孔作为不含供试化合物的对照。准备9列滴定供试化合物，下列三种测定一式三份(1)VEGF(Tech Inc.，catalogue no.100-200)，(2)内皮细胞生长因子(ECGF)(也已知为酸性成纤维细胞生长因子或aFGF)(Boehringer Mannheim Biochemica，catalogue no.1439 600)，或(3)人PDGF B/B(1276-956，Boehringer Mannheim，Germany)，和一个测定培养基对照。ECGF是与肝素钠的制备物的形式。
2、转移50μl/孔供试化合物稀释液至含有来自第0天的0.8-1.0×104细胞/100μl/孔HUV-EC-C细胞的96孔测定平板，在37℃、5％CO2下培育～2小时。
3、向每种供试化合物条件一式三份地加入50μl/孔的80μg/mlVEGF、20ng/ml ECGF或培养基对照。关于供试化合物，生长因子的浓度4倍于所需的最终浓度。使用来自第0天第2步的测定培养基制备各种浓度的生长因子。在37℃、5％CO2下培育大约24小时。每孔将具有50μl供试化合物稀释液、50μl生长因子或培养基和100μl细胞，计算得到总计200μl/孔。因而，一旦向小孔加入全部成分，供试化合物和生长因子的4X浓度变为1X。
第2天1、加入3H-胞苷(Amersham，catalogue no.TRK-686)，1μCi/孔(在RPMI培养基+10％热灭活的胎牛血清中制成10μl/孔的100μCi/nl溶液)，在37℃、5％CO2下培育～24小时。RPMI得自Gibco BRL，catalogue no.11875-051。
第3天1、将平板在-20℃下冷冻过夜。
第4天融化平板，用96孔平板收获器(Tomtec Harvester 96)收获在滤垫(Wallac，catalogue no.1205-401)上，在Wallac BetaplateTM液体闪烁计数器上读数。
下面详细描述已经或者能够用于评价化合物的生物测定法。试验了化合物1-9，发现在flkGST、FGFR1和PDGF测定法中有活性。
体内动物模型异种移植动物模型人肿瘤作为异种移植物生长在无胸腺小鼠(例如Balb/c，nu/nu)中的能力提供了有用的体内模型，用于研究对人肿瘤疗法的生物学反应。自从第一次成功地将人肿瘤异种移植到无胸腺小鼠上(Rygaardand Povlsen，1969，Acta Pathol.Microbial.Scand.77758-760)，很多不同的人肿瘤细胞系(例如乳腺、肺、泌尿生殖、胃肠、头颈、成胶质细胞、骨和恶性黑素瘤)已经移植和成功生长在裸鼠中。下列测定法可以用于测定不同的本发明化合物的活性、特异性与作用水平。这些一般类型的测定法可以用于评价化合物细胞/催化性、细胞/生物学和体内方式。细胞/催化性测定法的目的是测定化合物对TK磷酸化细胞已知底物上的酪氨酸的能力的作用。细胞/生物学测定法的目的是测定化合物对由TK刺激的细胞生物学反应的作用。体内测定法的目的是测定化合物在特定功能障碍的动物模型中的作用，例如癌症。
适合于皮下异种移植实验的细胞系包括C6细胞(神经胶质瘤，ATCC# CCL 107)、A375细胞(黑素瘤，ATCC#CRL 1619)、A431细胞(表皮样癌，ATCC# CRL 1555)、Calu 6细胞(肺，ATCC#HTB 56)、PC3细胞(前列腺，ATCC# CRL 1435)、SKOV3TP5细胞和NIH 3T3成纤维细胞，它们经过基因工程的加工，过度表达EGFR、PDGFR、IGF-1R或其他任意供试激酶。下列方案可以用于进行异种移植实验雌性无胸腺小鼠(BALB/c，nu/nu)得自Simonsen Laboratories(Gilroy，CA)。所有动物均被供养在清洁房间条件下的Micro-isolator笼子内，笼子带有Alpha-dri基底。它们可自由获取无菌的啮齿动物饲料和水。
使细胞系生长在适当的培养基中(例如MEM、DMEM、Ham’s F10或Ham’s F12加5％-10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺(GLN))。所有细胞培养基、谷氨酰胺和胎牛血清都是购自Gibco LifeTechnologies(Grand Island，NY)，另有指定的除外。细胞的生长条件为37℃，90-95％空气与5-10％CO2的潮湿气氛。将所有细胞系进行常规次代培养，一周两次，根据Mycotect法(Gibco)的测定，对支原体属是阴性的。
在融合或接近融合时用0.05％胰蛋白酶-EDTA收获细胞，在450xg下离心10分钟。将沉淀再次悬浮在无菌PBS或培养基(无FBS)中至特定浓度，将细胞植入小鼠的后胁腹(每组8-10只小鼠，2-10×106细胞/动物)。利用venier测径规测量3至6周内的肿瘤生长。计算肿瘤体积等于长×宽×高，另有指定的除外。利用学生t检验计算P值。一般从植入后第一天开始，可以将供试化合物在50-100μl赋形剂(DMSO或VPD∶D5W)中的溶液通过IP注射按不同浓度给药。
肿瘤侵袭模型已经开发了下列肿瘤侵袭模型，可以用于评价被鉴别为选择性抑制KDR/FLK-1受体的化合物的治疗作用和功效。
方法使用8周龄裸鼠(雌性)(Simonsen Inc.)作为实验动物。肿瘤细胞的植入是在板状流式通风橱中进行的。关于麻醉，腹膜内给以赛拉嗪/氯胺酮鸡尾酒试剂(100mg/kg氯胺酮和5mg/kg赛拉嗪)。进行中线切开，暴露腹腔(长大约1.5cm)，注入107个肿瘤细胞，培养基体积为100μl。将细胞注射到胰腺的十二指肠叶或结肠的绒膜下。将腹膜和肌肉用6-0丝缝合线缝合，用伤口钳封闭皮肤。每日观察动物。
分析2-6周后，根据对动物的粗略观察结果，处死小鼠，切除向各种器官(肺、肝、脑、胃、脾、心、肌肉)转移的局部肿瘤，分析(测量肿瘤大小、侵袭的级别、免疫化学、就地杂交测定等)。
C-KIT测定法本测定法用于检测c-kit酪氨酸磷酸化作用的水平。
使MO7E(人急性骨髓性白血病)细胞在0.1％血清中饥饿过夜。在配体刺激之前，将细胞用化合物预处理(与血清饥饿同时进行)。将细胞用250ng/ml rh-SCF刺激15分钟。刺激后，使细胞溶解，用抗c-kit抗体进行免疫沉淀。通过蛋白质印迹测定磷酸酪氨酸和蛋白质水平。
MTT增殖测定法对MO7E细胞进行血清饥饿处理，用化合物预处理，如磷酸化作用实验所述。将细胞平板接种在96孔平皿中的100μl RPMI+10％血清中，密度4×105细胞/孔。加入rh-SCF(100ng/ml)，将平板培育48小时。48小时后，加入10μl 5mg/ml MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)，培育4小时。加入酸性异丙醇(100μl含0.04NHCl的异丙醇)，在550nm波长下测量光密度。
细胞程序死亡测定法在含有rh-GM-CSF(10ng/ml)和rh-IL-3(10ng/ml)的10％FBS中，培育MO7E细胞+/-SCF和+/-化合物。在24和48小时测定样本。为了测量活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3，将样本用PBS洗涤，用冰冷的70％乙醇渗透。然后将细胞用与PE缀合的多克隆兔抗活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3染色，用FACS分析。为了测量所裂解的PARP，使样本溶解，利用抗PARP抗体通过蛋白质印迹加以分析。
其他测定法其他可以用于评价本发明化合物的测定法非限制性地包括bio-flk-1测定法、全细胞中EGF受体-HER2嵌合受体测定法、bio-src测定法、bio-lck测定法和测量raf的磷酸化功能的测定法。每种这些测定法的方案可以参见美国专利申请Ser.No.09/099,842，引用在此作为参考，包括其所有附图。
细胞毒性的测量治疗性化合物应当在抑制受体酪氨酸激酶活性上比在表现细胞毒性作用上更有力。化合物的有效性和细胞毒性的量度可以通过测定治疗指数而获得，即IC50/LD50。IC50是达到50％抑制作用所需的剂量，可以利用标准工艺测量，例如本文所述那些。LD50是导致50％毒性的剂量，也可以利用标准工艺测量(Mossman，1983，J.Immunol.Methods，6555-63)，或者在动物模型中测量所释放的LDH的量(Korzeniewski和Callewaert，1983，J.Immunol.Methods，64313，Decker和Lohmann-Matthes，1988，J.Immunol.Methods，11561)或致死剂量。治疗指数大的化合物是优选的。治疗指数应当大于2，优选至少为10，更优选至少为50。
本领域技术人员还将容易领会到，本发明加以充分调整，可实现所提到的目的、获得所提到的优点，以及本身固有的那些。本文所述的分子配合物和方法、程序、处理、分子、具体化合物是优选实施方式的代表，是例证性的，不打算限制发明的范围。本领域技术人员可以想到其中的变化和其他用途，这些都涵盖在由权利要求书所定义的发明精神范围内。
对本领域技术人员显而易见的是，对本文所公开的发明可以进行各种替换和修改，而不背离发明的范围和精神。
说明书中提到的所有专利和出版物是发明所属领域技术水平的说明。所有专利和出版物都引用在此作为参考，其程度仿佛每份个别的出版物被具体和单独引用在此作为参考一样。
本文所阐述的发明可以适合在没有任何在本文中没有具体公开的要素或限制的存在下加以实施。因而，例如，在本文中的每种情况下，任何一个术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”都可以用其他两个术语代替。所采用的术语和表达方式在使用时是说明性的和没有限制的，在使用这类术语和表达方式时不打算排除其任何所示或所述特征的等价方式或部分，在所要求保护的发明范围内各种修改都是可能的。因而，应当这样理解，尽管本发明已经被优选的实施方式和可选的特征所具体公开，不过本领域技术人员可以诉诸所公开概念上的修改和变化，这类修改和变化被视为属于由权利要求书所定义的本发明范围。
另外，若在马库什组的含义上描述本发明的特征或方面，本领域技术人员将认识到，还可以在马库什组的个别成员或成员小组的含义上描述本发明。例如，如果X被描述为选自由溴、氯和碘组成的组，那么关于X是溴的权利要求和关于X是溴和氯的权利要求也被完整描述了。
其他实施方式在所附权利要求的范围之内。
权利要求
1.式(I)化合物 其中R1选自由氢、卤素、烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13组成的组；R2选自由氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基)组成的组；R3、R4和R5独立地是氢或烷基；Z是芳基、杂芳基、杂环或-NR15R16，其中R15和R16独立地是氢或烷基，或者R15和R16与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R6选自由氢或烷基组成的组；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组；R8选自由羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；R9和R10独立地选自由氢、烷基、氰基烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，或者R9和R10联合形成杂环氨基；R12和R13独立地选自由氢、烷基、羟基烷基和芳基组成的组，或者R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R17选自由羟基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的化合物，其中R1选自由氢、卤素、烷基、环烷基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13组成的组；R2选自由氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基)组成的组；R3、R4和R5独立地是氢或烷基；Z是芳基、杂芳基、杂环或-NR15R16，其中R15和R16独立地是氢或烷基，或者R15和R16与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R6选自由氢或烷基组成的组；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组；R8选自由羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；R9和R10独立地选自由氢、烷基、氰基烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，或者R9和R10联合形成杂环基；R12和R13独立地选自由氢、烷基和芳基组成的组，或者R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成杂环；R17选自由羟基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或其药学上可接受的盐。
3.权利要求1的化合物或盐，其中该化合物选自下组化合物号结构名称 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羟基-丙基)-酰胺 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-酰胺 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基1-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-酰胺 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢亚吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3 ]三唑-1-基-丙基)-酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢亚吲哚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-(2-羟基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]-4-(4-氟苯基)-2-甲基-5-{[5-(吗啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-(2-羟基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[3-(4-氰基苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N，N-二甲基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 4-(4-氰基苯基)-N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]-2-甲基-5-{[5-(吗啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-{3-[2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-{3-[2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-{3-[2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-2，4-二甲基-5-{[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-5-[(2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-5-[(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3 ]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺 5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺 2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧-苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺
4.权利要求3的化合物或盐，其中该化合物选自下组化合物号 结构 名称 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-(3Z)-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基-2-羟基丙基)-酰胺 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-酰胺 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-酰胺 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-酰胺 2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基丙基)-酰胺 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基丙基)-酰胺 5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3 ]三唑-1-基丙基)-酰胺 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基丙基)-酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-3-苯基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-(2-羟基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]-4-(4-氟苯基)-2-甲基-5-{(Z)-[5-(吗啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-3-(2，4-二氟苯基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-(2-羟基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[3-(4-氰基苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N，N-二甲基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 4-(4-氰基苯基)-N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]-2-甲基-5-{(Z)-[5-(吗啉-4-基羰基)-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 (3Z)-3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基)-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-氧代-N-苯基-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 (3Z)-3-{[3-(4-氯苯基)-4-({[3-(二乙氨基1-2-羟基丙基]氨基}羰基)-5-甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-异丙基-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羟基-3-(2H-四唑-2-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[2-羟基-3-(1H-四唑-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-{3-[(2R，6S)-2，6-二甲基吗啉-4-基]-2-羟基丙基}-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氧-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[(2R)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-5-{(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基)-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基]甲基}-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-(3-甲基-2，5-二氧代咪唑烷-1-基)丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-(2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-1H-吡咯-3-甲酰胺 N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[3-(1，1-二氧硫代吗啉-4-基)-2-羟基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-吗啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-([(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-吗啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2R)-2-羟基-3-吗啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-亚吲哚-3-基)甲基]-N-[(2S)-2-羟基-3-吗啉-4-基丙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺 5-(5-(Z)-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 5-(5-(Z)-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 2，4-(Z)-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-([1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶-3-基氧基)-丙基]-酰胺 5-(5-(Z)-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺； 5-(5-(Z)-氯-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺；和 2，4-(Z)-二甲基-5-(2-氧代-5-三氟甲氧基-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸[2-羟基-3-(3-氧-苯并三唑-1-基)-丙基]-酰胺
5.式(Ia)化合物 其中R1、R3、R4和R5是氢；R2是氟，并且位于二氢吲哚酮环的5位；和Z是吗啉-4-基；R6和R7是甲基，和*C的立体化学是(S)。
6.式(II)化合物 其中R是氢或烷基；R1选自由氢、卤素、烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂脂环基、羟基、烷氧基、-C(O)R8、-NR9R10和-C(O)NR12R13组成的组；R2选自由氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR9R10、-NR9C(O)R10、-C(O)R8、-S(O)2NR9R10和-SO2R14(其中R14是烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基)组成的组；R3、R4和R5独立地是氢或烷基；Z是芳基、杂芳基、杂环或-NR15R16，其中R15和R16独立地是氢或烷基，或者R15和R16与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R6选自由氢或烷基组成的组；R7选自由氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组；R8选自由羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；R9和R10独立地选自由氢、烷基、氰基烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，或者R9和R10联合形成杂环氨基；R12和R13独立地选自由氢、烷基、羟基烷基和芳基组成的组，或者R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成杂环氨基；R17选自由羟基、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或其药学上可接受的盐。
7.权利要求6的化合物或盐，其中该化合物选自下组化合物号 结构名称 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-羟基-3-吗啉-4-基丙基)-甲基-酰胺； 5-((Z)-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸((S)-2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺；和 5-((Z)-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-亚吲哚-3-基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸((R)-2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-甲基-酰胺
8.药物组合物，包含权利要求1、2、3、4、5、6或7的化合物或盐和药学上可接受的载体或赋形剂。
9.药物组合物，包含权利要求5的化合物或盐和药学上可接受的载体或赋形剂。
10.蛋白激酶催化活性的调制方法，包含使所述蛋白激酶与权利要求1、3或6任意一项的化合物或盐接触。
11.权利要求10的方法，其中所述蛋白激酶选自由受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶组成的组。
12.治疗或预防生物体蛋白激酶相关性功能障碍的方法，包含对所述生物体给以治疗有效量的药物组合物，该组合物包含权利要求1、3或6任意一项的化合物或盐和药学上可接受的载体或赋形剂。
13.权利要求12的方法，其中所述蛋白激酶相关性功能障碍选自由受体酪氨酸激酶相关性功能障碍、非受体酪氨酸激酶相关性功能障碍和丝氨酸-苏氨酸激酶相关性功能障碍组成的组。
14.权利要求12的方法，其中所述蛋白激酶相关性功能障碍选自由EGFR相关性功能障碍、PDGFR相关性功能障碍、IGFR相关性功能障碍和flk相关性功能障碍组成的组。
15.权利要求12的方法，其中所述蛋白激酶相关性功能障碍是一种癌症，选自由鳞状上皮细胞癌、星形细胞瘤、卡波济氏肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、泌尿生殖癌和胃肠癌组成的组。
16.权利要求12的方法，其中所述蛋白激酶相关性功能障碍选自由糖尿病、自体免疫疾病、过度增殖症、再狭窄、纤维变性、牛皮癣、林-希氏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、血管生成、炎症、免疫功能障碍和心血管功能障碍组成的组。
17.权利要求12的方法，其中所述生物体是人。
全文摘要
本发明涉及吡咯取代的2－二氢吲哚酮化合物和它们的药学上可接受的盐，它们调制蛋白激酶的活性，因此预期可用于蛋白激酶相关性细胞功能障碍的预防和治疗，例如癌症。
文档编号A61P35/00GK1529704SQ02806680
公开日2004年9月15日 申请日期2002年2月15日 优先权日2001年2月15日
发明者H·关, H 关, C·梁, 唐, L·孙, 魏, P·C·唐, 马拉吉斯, C·C·魏, 朔蛩够, M·A·马拉吉斯, 赫林顿, T·沃克夫斯基, Q·金, P·M·赫林顿 申请人:苏根公司, 法玛西雅厄普约翰美国公司