利用抑制cd21的药剂治疗抗体介导的病变的方法

专利名称：利用抑制cd21的药剂治疗抗体介导的病变的方法
技术领域：
本发明涉及抗体介导的病变(pathology)如自身免疫病领域。更具体地，本发明涉及治疗患有抗体介导的病变如自身免疫病的方法和利用干扰CD21/C3d相互作用的药剂延缓抗体介导的病变的发展的方法。
背景技术：
抗体介导的病变包括多种病症，包括自身免疫病、异种移植排斥、同种移植排斥、移植物抗宿主疾病和对持续施用的治疗性蛋白质的免疫应答。抗体介导的病变的特征为可导致免疫复合体的自身抗体的过度产生。免疫复合体在特定器官或组织部位中的沉积可以引起例如组织损伤、肾衰竭、肾小球性肾炎、脉管炎和伴有心包炎的严重器官累及等病变。抗体介导的自身免疫病变包括原发性抗磷脂综合症(APS)、甲状腺炎、重症肌无力、格雷夫斯病(Graves′disease)、系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬皮病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)和多肌炎。
术语抗磷脂(aPL)抗体一般用于描述与血栓形成、习惯性流产和血小板减少如原发性抗磷脂综合症(APS)以及自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)相关的自身抗体。Harris等人(1983)Lancet 21211-1214；和Lockshin等人(1985)N.Engl.J.Med.313152-156。APS可以原发的或者继发的，这意味着其与其它病症相关，所述病症主要是SLE。“磷脂结合抗体”(Phospholipid-Binding Antibodies)(Harris等人主编，CRC出版社，Boca Raton，FL，1991；McNeil等人“免疫学进展”(Advances inImmunology)，第49卷，193-281页(Austen等人主编，学院出版社，San Diego，CA，1991))。aPL抗体包括所谓的抗心磷脂(aCL)自身抗体，其将在下文中讨论。aPL抗体(包括aCL抗体)在多种病症中均可检测出，但只有与自身免疫病相关的β2-糖蛋白I(β2GPI)依赖型抗磷脂抗体需要磷脂结合血清蛋白质β2GPI的存在。Vaarala等人(1986)临床免疫学免疫病理学(Clin.Immunol.Immunopathol.)418-15。APS的临床表现包括动脉闭塞、肢体坏疽、中风、心肌梗死、其它内脏梗死、静脉闭塞、外周静脉闭塞、内脏静脉闭塞(如巴-希综合症、门静脉闭塞)、习惯性流产、血小板减少症、库姆斯阳性溶血性贫血、网状青斑、神经系统异常(如舞蹈症、短暂性局部缺血发作)、心瓣性心脏病以及突发性多系统动脉闭塞。Scientic American Medicine第15章，第IV节，5页(2001)。
甲状腺炎(或桥本甲状腺炎)和格雷夫斯病是与甲状腺有关的其它自身免疫病，并且被认为由针对促甲状腺激素(TSH)受体的自身抗体引起。甲状腺中的病理学发现包括慢性炎性细胞的过度浸润、滤泡破裂、嗜曙红细胞过多、不同程度的增生和纤维化。慢性甲状腺炎的临床表现多种多样，但其主要的并发症状为无痛甲状腺肿、甲状腺机能减退以及上述两种的联合。Scientific American Medicine第6章，第VI节，6-8页以及第3章，第I节，16页(2001)。
重症肌无力是一种自身免疫病，据认为其由针对乙酰胆碱受体(AchR)的自身抗体引起。AchR的自身抗体可以在患有重症肌无力的患者的血清中检测和测量到。重症肌无力的临床表现包括骨骼肌无力和易疲劳。肌肉无力可以表现为不对称上眼睑下垂和复视，其因提升眼睑和眼外肌移动的能力受损所致。其它身体症状包括颈伸肌无力、头下垂、由于面部肌肉和球肌无力所致的当患者试图微笑时的面部扭曲、鼻的或构音障碍的低音量发音困难、可导致气阻或反胃的吞咽困难，以及可引起行走、爬梯或搬运物体困难的骨骼肌无力。该疾病可以利用患者的致病性IgG传递给实验动物。Scientific American Medicine第6章，第VI节6-8页以及第11章，第III节，12-13页(2001)。
系统性硬皮病是一种罕见的、慢性进行性风湿疾病，据认为其由针对核蛋白质如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70和着丝粒的自身抗体引起。系统性硬皮病可以是扩散性的或者限制性的。系统性硬皮病的限制形式或者CREST(钙质沉着、雷诺氏现象、食道累及、指端硬化以及毛细血管扩张)可以是致命的，但比扩散性硬皮病较少累及内在器官。系统性硬皮病的临床特征包括手指和手掌的肿胀和变厚并可能涉及面部，皮肤的变厚、累及躯干和临近肘部的臂。随着系统性硬皮病的进展，临床特征包括皮肤萎缩并可能脱发、脱皮脂腺和汗腺；皮肤柔韧性丧失；皮包骨，其中皮肤紧绷并紧结合在下面的结构上；以及有限的运动性，尤其是手指。ScientificAmerican Medicine第6章，第VI节6-8页以及第15章，第V节，1-4页(2001)。
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是自身免疫病，其特征为血小板的快速破坏。据认为是由于形成血小板上蛋白质的自身抗体并结合至血小板，从而使血小板随后被网状内皮系统除去。这些自身抗体常常直接针对血小板糖蛋白(GP)IIb-IIIa受体复合物。ITP中自身抗体的另一个靶子为GPIb受体复合物。ITP的一些临床特征包括下肢存在瘀斑，轻微临床出血，包括紫癜、鼻衄、牙龈出血、月经过多，脾不显(unpalpable spleen)，以及在几种血小板减少症中，嘴中血泡。Scientific American Medicine第5章，第XIII节2页(2001)。
多肌炎为风湿性疾病，其涉及主要是骨骼肌无力。据认为多肌炎由核蛋白如Jo-1、组氨酰-tRNA合成酶、苏氨酰-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2的自身抗体引起。多肌炎的临床特征为相邻肌肉无力并且也可包括可能的肺部累及，如吸入性肺炎、间质性肺病；软组织钙化(在儿童中最为常见)；以及与其它风湿性疾病如雷诺氏现象相关。Scientific American Medicine第6章，第VI节6-8页以及第15章第VI节1-4页(2001)。
系统性红斑狼疮(SLE)为自身免疫病，其特征为产生多种核抗原(包括双链DNA，dsDNA)的抗体。另外，抗-β2 GPI抗体也可以在患有SLE的个体中发现。据认为，与DNA反应的自身抗体在SLE的病理学中起作用，并且与狼疮肾炎密切相关。参见例如Morimoto等人(1982)免疫学杂志(J.Immunol.)1391960-1965；Foster等人(1993)Lab.Invest.69494-507；ter Borg等人(1 990)Arthritis Rheum.33634-643；以及Bootsma等人(1995)Lancet 3451595-1599。与SLE相关的其它临床症状包括面颊疹、盘形疹、蝶形疹、光过敏、口腔溃疡、关节炎、浆膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、肾病(例如蛋白尿)、神经系统病症(例如癫痫发作或精神病)、血液病(例如溶血性贫血、白细胞减少症、淋巴细胞减少症、血小板减少症)以及免疫学病症(例如阳性红斑狼疮细胞制备、异常效价的针对天然DNA的抗-DNA抗体、抗-SM核抗原抗体)。Coutran等人，疾病的病理学基础(Pathologic Basis of Disease)第4版(1989)。
现已提出几种可能治疗SLE的方法。一种方法为与无免疫原性载体偶联的dsON的使用，也称为平台疗法。已经证明，合成的dsON与抗-dsDNA抗体有交叉反应(美国专利号5,276,013)。例如，由连接至聚乙二醇效价平台的4个dsON构成的四价偶联物LJP249被用于证实在免疫的小鼠模型系统中的耐受性(Jones等人(1994)，生物偶联物化学(BioconiugateChem.)5390-399)。另一偶联物，LJP394，为由连接至平台的4个dsON构成的四价偶联物，在BXSB实验小鼠狼疮肾炎模型中被证明可以延缓肾病的进展并延长生存(Plmkett等人(1995)狼疮(Lupus)4S99；Coutts等人(1996)狼疮(Lupus)5158-159)。LJP394在患有SLE的人中也被证明可降低抗-dsDNA抗体(Weisman等人(1997)风湿病学杂志(J.rheumatol.)24314-318)。
其它可用于治疗SLE的方法也已经被描述，包括通过诱导B细胞耐受降低循环抗体水平的方法，包括但并不限于，美国专利号5,276,013、5,391,785、5,786,512、5,726,329、5,552,391、5,268,454、5,606,047、5,633,395、5,162,515、6,022,544；美国系列号08/118,055(美国专利号6,060,056)；美国系列号60/088,656和60/103,088(美国系列号09/328,199和PCT申请号PCT/us99/13194)。
尽管SLE被普遍认为是自身免疫病，其病因依然未知。据认为，B细胞表达的人补体受体1和2(hCR1和hCR2)与SLE有一定关系。在患有SLE的患者中，利用hCR1和hCR2的单克隆抗体通过流式细胞术测量可常规观察到hCR1和hCR2(CD21)的异常表达，水平为非SLE患者的约50％。参见例如Wilson，J.G.等人，Arthritis Rheum.(1986)29739；Levy，E.J.免疫学临床实验(Clin.Exp.Immunol.)(1992)90235；以及Marquart，H.V.等人，免疫学临床实验(Clin.Exp.Immunol.)(1995)10160。
人CD21或者补体受体2(CR2)为约145-150kDa的膜糖蛋白，其主要在成熟B淋巴细胞上表达。Tedder，T.F.等人，免疫学杂志(J.Immunol.)(1984)133678。人CD21是补体片断C3d、C3dg和iC3b以及Epstein-Barr病毒(EBV)的受体。Weis，J.J.等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)81881和Fingeroth，J.D.等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)814150。CD21由约15到16个胞外短共有重复(SCR)(每一个有约60到70个氨基酸)、约24个氨基酸的跨膜区和约34个氨基酸的短胞质部分。在小鼠中，CR2和CR1由同一基因经可变剪切产生，而在人中CR2和CR1是不同基因的唯一产物。
CD21与CD81和CD19形成非共价受体复合体，这在B细胞活化中非常重要。在成熟B细胞上，CD21在通过多聚C3d发生交联后传导共刺激信号。Melchers，F.等人，自然(Nature)(1985)317264。据认为，短共有重复1和2(SCR1和/或SCR2)是CD21中特异性识别C3d的部分。据认为，通过提供B细胞抗原受体和它的共受体之间的桥梁，补体片断(例如C3d)结合至CD21在B细胞应答中起着非常重要的作用，这可使B细胞对抗原的敏感性提高100到10,000倍。Janeway和Travers，免疫生物学(Immunobiology)第三版，(1997)843。
已经描述了几种CD21的结合剂的组合物，其涉及补体或者B细胞表面蛋白质。一种组合物涉及设计用于结合补体片断的重组融合蛋白质。参见例如WO91/16437。已经描述的另一组合物涉及内皮细胞上B细胞受体的结合剂。这些B细胞受体包括CD11b、CD11c、CD21、CD23、70到85kDa蛋白质或者115kDa蛋白质。参见例如WO96/12742、WO96/12741或者EP 0788513。另一组合物涉及人CD21的小鼠单克隆抗体。该小鼠单克隆抗体能够抑制Epstein-Barr病毒感染表达CD21的细胞。此外，它也能够干扰C3dg包被的抗原向滤泡树突细胞和B细胞的递送。参见例如Prodinger等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)1614604、美国专利号6,291,239(Prodinger等人)、EP1001021(Prodinger等人)、Guthridge等人(2001)1675758。也参见WO 01/92295(Isenman和Clemenza)、美国专利号5,552,381(Atkinson)和5,719,127(Atkinson等人)、WO00/67796(Curd等人)、WO96/12742(Bonnefoy和LeCoanet-Henchoz)、美国专利号6,238,670(Fearon和Dempsey)、WO 91/16437(Hebell和Fearson)、EP 528926(Hebell和Fearon)。
其它文献描述了在抗体应答中小鼠补体受体的参加。参见例如Wiersma，E.J.等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)(1991)212501-2506和Takahashi，K.等人，免疫学杂志(J.Immunol.)(1997)1591577-1569。其它文献描述了在小鼠SLE模型中可能参予B细胞活化的淋巴细胞表面受体的研究。参见例如Early，G.S.等人，免疫学杂志(J.Immunol.)(1996)1573159-3164；和Mihara，M.等人(2000)(J.Clin.Invest.)10691-101。
尽管这些研究调查了B细胞活化受体CD40和CD152在SLE小鼠模型中的参予情况，但有关CD21在正在进行的免疫应答中的作用的研究依然有限。
目前需要能够抑制不想要的抗体应答的改进方法。也需要治疗自身免疫病(如SLE)患者的改进方法和延缓个体中自身免疫病(如SLE)发展的改进方法。于此提供的本发明满足了这些需要。
于此引用的所有专利、专利申请和出版物特此全部引用作为参考。
发明概述本发明提供治疗患有抗体介导的病变例如自身免疫病(如系统性红斑狼疮(SLE)、ITP或甲状腺炎)的个体的方法，其包括向该个体施用有效量的干扰C3d结合CD21的药剂，由此缓解抗体介导的病变的症状(即至少一种症状得以缓解和/或延缓)。
另一方面，本发明提供延缓个体中与抗体介导的病变(例如SLE、ITP或甲状腺炎等自身免疫病)相关的症状发展的方法，其包括向该个体施用有效量的干扰C3d结合CD21的药剂，由此延缓抗体介导的病变的症状。
所述症状可以是与抗体介导的病变相关的任何一种或多种症状。
附图简述

图1描绘在致敏后14天和加强及利用PBS(对照动物)或可溶性CD21(sCD21，实验动物)处理后7天小鼠中抗寡核苷酸(ON)IgG水平。
图2描绘在加强免疫及利用PBS(对照动物)或抗-CD21单克隆抗体7G6(mAb；实验动物)处理后14天小鼠中抗寡核苷酸(ON)IgG水平。
图3描绘在对照(PBS)和抗-CD21(mAb 7G6)处理小鼠中抗Galα1-3Gal双糖(即双半乳糖)IgM和IgG的平均水平(±1个标准差或s.d.)。
图4为Kaplan-Meier曲线，该曲线显示出利用环磷酰胺、大鼠抗小鼠7G6或者两者处理的NZB×NZW(F1)小鼠的存活结果。
发明详述利用多种抗体介导的病变的本领域公认模型，我们已经发现，抑制CD21与C3d相互作用可以阻抑抗体的产生。抗体介导的病变包括但并不限于自身免疫病、异种移植和移植物抗宿主疾病。基于实验结果，我们已经发现利用药剂(包括但并不限于抗CD21单克隆抗体)抑制或干扰CD21与C3d的相互作用可以抑制抗体介导的病变中的抗体(例如在自身免疫病如SLE中的抗dsDNA抗体)水平。
因此，本发明提供利用抑制CD21与C3d相互作用的药剂来治疗抗体介导的病变如自身免疫病(如SLE)的方法，据推测，所述抑制可以在抗体介导的病变中阻止非期望的应答。此外，本发明也提供延缓抗体介导的病变(如SLE)发展的方法，其通过向个体施用有效量的一种或多种可抑制CD21与C3d相互作用的药剂而使抗体介导的病变的症状得以缓解，据推测所述抑制可以阻止B细胞产生抗体。
一般技术除非另有指明，本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术范围之内。这些技术在文献中有完整的阐释，例如分子克隆实验室指南(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等人，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait主编，1984)；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.Freshnev主编，1987)；酶学方法(Methods in Enzymology)(学院出版公司)；实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell主编)；哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells)(J.H.Miller和M.P.Calos主编，1987)；当前分子生物学实验方法(Current Protocols in Moleculor Biology)(F.M.Ausubel等人主编，1987)；PCR多聚酶链式反应(PCRThe PolymeraseChain Reaction)(Mullis等人主编，1994)；当前免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)(J.E.Coligan等人主编，1991)以及精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)。
定义“抗体”(可互换地使用复数形式)是能够特异性结合靶(例如碳水化合物、多核苷酸或多肽)的免疫球蛋白分子，所述结合通过位于该免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点完成。正如于此所使用的，该术语不仅包括完整抗体，还包括它的片断(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、突变体、含有抗体部分的融合蛋白质、人源化抗体，以及含有具有所需特异性的抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任何种类的抗体，如IgG、IgA或者IgM，并且抗体不需要属于任何特定种类。
“单克隆抗体”是指同质抗体群，其中单克隆抗体由参与选择性结合抗原的氨基酸(天然存在和非天然存在)组成。单克隆抗体具有针对单个的抗原性位点的高度特异性。术语“单克隆抗体”不仅仅包括完整单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包括它的片断(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、突变体、含有抗体部分的融合蛋白质、人单克隆抗体、嵌合(如人源化)单克隆抗体，以及含有具有所需特异性并能够结合至抗原的抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。上述无意限制抗体的来源和抗体产生的方式(例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等等)。
“人源化”抗体是指具有抗原结合位点(例如互补决定区或CDR)的分子，其基本上来源于非人物种的免疫球蛋白，而该分子的剩余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合至恒定区上的完整可变区或者仅是移植至可变结构域中的适当框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的或者经一个或多个氨基酸替代修饰的，例如修饰以使其与人免疫球蛋白更为相似。一些形式的人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有所有6个来自小鼠抗体的CDR的人源化小鼠抗体)。其它形式的人源化抗体具有一个或多个相对于原初抗体发生改变的CDR。
于此使用的“抗体介导的病变”或“抗体介导的疾病”是指免疫应答病症，其中一种或多种病理(包括症状)与不适当的和/或非期望的抗体产生相关，更具体地由不适当的和/或非期望的抗体产生(直接或间接)引起。因为免疫应答病症是背景依赖性的，对本发明而言，“抗体介导的病变”可以包括自身免疫病，并且也可以包括移植排斥(尤其是异种移植排斥和移植物抗宿主疾病)和妊娠期间的基于Rh的排斥，其中在移植排斥中，对试图维持外源移植组织的努力而言，免疫应答是不适当的。抗体介导的病变也包括在基因疗法中与不恰当的抗体产生相关的病理。抗体介导的病变也包括对治疗剂(例如治疗性蛋白质)的有害的或非期望的免疫应答。这些蛋白质的例子包括干扰素和肝素(其可以导致肝素诱导的血小板减少)。参见例如Perini(2001)Eur.Cytokine Netw.1256-61；Amiral等人(1998)血小板(Platelets)977-91。
于此可互换使用的“抗体介导的自身免疫病变”、“抗体介导的自身免疫病”或者“自身免疫病”是针对自身抗原产生了异常量抗体的免疫应答。抗体介导的自身免疫病变包括但并不限于自身免疫病，例如系统性红斑性狼疮(SLE)、抗体介导的血栓形成、血小板减少症(如ITP)、抗磷脂综合症(APS)、甲状腺炎、系统性硬皮病、多肌炎和重症肌无力。
于此使用的“自身免疫”是指针对自身抗原的免疫应答。
于此使用的“自身抗体”是指针对自身抗原的抗体。自身抗原包括但并不限于核酸(如双链DNA或RNA、单链DNA或RNA，或者它们的任何组合)、核蛋白质(如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70、着丝粒、Jo-1、组氨酰-tRNA合成酶、苏氨酰-tRNA合成酶、PM-1、Mi-2、组蛋白和染色质)、细胞受体(例如乙酰胆碱受体、促甲状腺激素受体)、细胞蛋白质(例如心磷脂或β2 GPI)、RNA蛋白质复合体(例如RNP和Sm)、红细胞和血小板糖蛋白(GP)受体复合体(例如IIb-IIIa和Ib)。
于此使用的术语“药剂”是指生物学或化学化合物，例如简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物或抗体片断。多种化合物可由人工合成，例如寡聚体(例如寡肽和寡核苷酸)和基于多种核心结构的合成有机化合物，这些也包括在术语“药剂”之内。在动物中产生的或者由重组合成的或通过噬菌体展示产生的抗体也包括在术语“药剂”之内。另外，多种天然来源可以提供供筛选的化合物，例如植物或动物提取物等等。化合物可以进行测试和/或单独或彼此联合使用。
“抑制或阻抑CD21/C3d介导的B细胞活化”的药剂是指可以降低CD21/C3d介导的——由与C3d的相互作用介导的——B细胞活化程度的药剂(即与C3d存在而药剂不存在时CD21/C3d介导的B细胞活化程度相比，在药剂和C3d存在的条件下CD21/C3d介导的B细胞活化程度减少)。B细胞活化的抑制可以是B细胞活性的部分减少，例如抗体产生的减少。对CD21/C3d介导的B细胞活化的抑制或阻抑可以是部分或者完全的。指示CD21/C3d介导的B细胞活化的方法为本领域所公知并于此描述。应当理解的是，“B细胞活化”包括静息B细胞的活化、非抗体分泌B细胞的活化和已经活化的B细胞(例如浆细胞)的活化状态的维持和/或增强。可抑制CD21/C3d介导的B细胞活化的药剂的例子包括但并不限于，抑制CD21与C3d相互作用的抗体(可以针对CD21中与C3d天然结合的区域)、竞争性抑制剂(可以结合至C3并竞争对CD21的结合)、可溶性蛋白质、融合蛋白质、重组蛋白质和小分子。对本发明方法而言，于此描述的药剂可以抑制或阻抑CD21/C3d介导的B细胞活化。
“干扰C3d结合至CD21”或“阻抑C3d结合至CD21”的药剂是指与除了不加药剂外的相同条件相比，可以使C3d配体与CD21的相互作用程度减小的药剂。确定C3d与CD21结合的方法在本文中公开。当恰当地施用时，“干扰C3d结合至CD21”的药剂可以降低抗体(如抗dsDNA抗体)的水平。
正如于此所使用的，当术语“抑制”、“阻抑”、“封闭”和“干扰”用于指CD21和C3d之间相互作用的情况时，这些术语意味着由于可以阻碍CD21与C3d之间发生相互作用的药剂的施用，CD21与C3d之间的相互作用从被限制到被完全封闭。“抑制”或“阻抑”CD21/C3d介导的抗体产生是指减少(可包括消除)这种抗体的产生。
“可溶性CD21”或“sCD21”于此可互换地使用，并且是指CD21的可溶(即非膜结合)形式。CD21可以利用重组技术产生或从细胞中分离(如CD21释放)。可溶性CD21也可以以多种长度形式存在，只要能够结合C3d即可，其可以是全长CD21的截短形式或片断。
于此使用的“C3d”是指作为补体途径的一部分生成的补体片断。正如本领域所公知，血浆中存在大量的C3。作为经典补体途径的一部分，C3被C3转化酶转化为C3a和C3b。iC3b是C3b的衍生物并且例如，当作为调理作用的一部分结合至病原时，其可以进一步转变为C3dg。作为补体旁路途径的一部分，C3通过自发裂解(有时称为“空转tickover”)以相当大的速率产生C3b。C3b可以与因子I相互作用，所述因子I为丝氨酸蛋白酶，其以活性形式存在于循环系统中并将C3b首先裂解成iC3b并且随后将其进一步裂解成C3dg。C3dg可以被进一步降解产生C3d。C3d和C3dg都可以结合至CD21。应当理解，在本文中C3d和C3dg可以互换地使用。提及C3d应理解为也包括C3dg和iC3b。iC3b包括C3dg和C3d的氨基酸序列并且以相似的亲合性结合CD21。iC3b经蛋白酶裂解产生C3dg。C3dg在其羧基末端具有几个额外的氨基酸，经细胞蛋白酶裂解后生成C3d。C3d的结构为本领域公知(参见例如，Nagar，B.等人，科学(Science)1998，280，1277-1281)。C3d可以利用重组技术产生(例如利用诸如Genbank等资源中已出版的序列)或者可以从商业来源得到纯化形式(Calbiochem-Novabiochem；San Diego，CA，目录号#204870)。
于此使用的“治疗”是指为获得有益或期望结果而采取的方法，所述结果包括并优选临床结果。对本发明而言，有益或期望的临床结果包括但并不限于下列中的一种或多种降低抗体(如抗-双链DNA抗体)产生水平(包括产生水平和/或循环水平)、缓和以下所列的与抗体介导的病变(例如自身免疫病如SLE、甲状腺炎、异种移植排斥、重症肌无力、APS、系统性硬皮病、ITP和多肌炎)相关的一种或多种症状、减小抗体介导的病变的程度、稳定抗体介导的病理状况(即未恶化)、阻止抗体介导的病变的发生或复发、延缓抗体介导的病变的发展、延缓或减慢抗体介导的病理、改善抗体介导的病变、产生缓解作用(部分或全部)、减少抗体介导的病变和/或与抗体介导的病变相关的症状的发生。
SLE的治疗包括SLE的任何方面，包括但并不限于，免疫学病症(例如阳性红斑狼疮细胞制备、异常效价的针对天然DNA的抗-DNA抗体、抗-SM核抗原抗体、抗-β2GPI抗体)、皮疹、光过敏、口腔溃疡、关节炎、浆膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、肾病(例如蛋白尿)、神经系统病症(例如癫痫发作或精神病)、血液病(例如溶血性贫血、白细胞减少症、淋巴细胞减少症、血小板减少症、继发性血小板减少性紫癜)，或者狼疮性肾炎一这是一种慢性炎性肾脏疾病。当发生狼疮性肾炎时，可能会出现“活动(flare)”。“活动”是指活性的增加，一般指炎性活性。如果活性出现在肾脏内，那么活动称作“肾活动”。“肾活动”可以通过下列评价因素鉴定，其包括但并不限于蛋白尿水平、血尿水平和血清肌酸酐水平。狼疮性肾炎的“治疗”可在狼疮性肾炎的症状未出现时进行，并且这种治疗(正如“治疗”(定义)所指出的)将降低活动的发生率。“狼疮的治疗”或“SLE的治疗”也包括狼疮(例如狼疮性肾炎)任一方面的病理学后果的减轻。
甲状腺炎的治疗包括甲状腺炎的任一方面，其包括但并不限于，慢性炎性细胞的过度浸润、滤泡破裂、嗜曙红细胞过多、不同程度的增生、纤维化、无痛性甲状腺肿和甲状腺机能减退。与异种移植相关的抗体介导的病变的治疗包括异种移植的任何方面，包括但并不限于，外源组织排斥的减少或消除、针对移植组织的抗体效价的降低和移植物抗宿主反应的减少或消除。重症肌无力的治疗包括重症肌无力的任何方面，包括但并不限于，骨骼肌无力、易疲劳、不对称上眼睑下垂、复视、颈伸肌无力、头下垂、由于面部肌肉和球肌无力所致的当患者试图微笑时的面部扭曲、鼻的或构音障碍的低音量发音困难、可导致气阻或反胃的吞咽困难，以及可引起行走、爬梯或搬运物体困难的骨骼肌无力。系统性硬皮病的治疗包括系统性硬皮病的任何方面，其包括但并不限于手指和手掌的肿胀和增厚并可能累及面部，皮肤的增厚，累及躯干和临近肘部的臂，皮肤萎缩并可能脱发、脱皮脂腺和汗腺；皮肤柔韧性丢失；皮包骨，其中皮肤紧绷并紧结合在下面的结构上；以及有限的运动性，尤其是手指。ITP的治疗包括ITP的任何方面，包括但并不限于下肢存在瘀斑、轻微临床出血(包括紫癜、鼻衄、牙龈出血、月经过多)、脾不显以及在几种血小板减少症情况下嘴中血泡。多肌炎的治疗包括多肌炎的任何方面，包括但并不限于，主要骨骼肌无力、相邻肌肉无力、吸入性肺炎、间质性肺病、软组织钙化和雷诺氏现象。APS(也可以包括抗体介导的血栓形成)的治疗包括APS的任何方面，包括但并不限于动脉闭塞、四肢坏疽、中风、心肌梗死、其它内脏梗死、静脉闭塞、外周静脉闭塞、内脏静脉闭塞(如巴-希综合症、门静脉闭塞)、习惯性流产、血小板减少症、库姆斯阳性溶血性贫血、网状青斑、神经系统异常(如舞蹈症、短暂性局部缺血发作)、心瓣性心脏病以及突发性多系统动脉闭塞。
“减轻”抗体介导的病变或者一种或多种抗体介导的病变的症状是指根据本发明利用干扰CD21/C3d相互作用的药剂治疗的个体或个体群在抗体介导的病变的非期望临床表现的程度和/或时程上出现减少。
抗体介导的病变的“症状严重性的降低”或者“症状的改善”是指与未施用干扰CD21/C3d相互作用的药剂时相比，抗体介导的病变的一种或者多种症状得以减轻或者改善。“降低严重性”也包括症状持续时间的缩短或减少。抗体介导的病变如自身免疫病(如SLE)、APS、ITP、甲状腺炎、异种移植排斥、移植物抗宿主疾病、系统性硬皮病、重症肌无力和多肌炎的症状描述如上并可以包括生存期(增加的总生存期作为改善的症状)。
于此使用的对抗体介导的病变发展的“延缓”是指对抗体介导的病变发展的推迟、阻碍、延缓、延迟、稳定和/或延期。依赖于抗体介导的病变的病史和/或接受治疗的个体，这种延缓可以有不同的时间长度。对本领域技术人员显而易见的是，充分的或者显著的延缓实际上包括预防，由此个体不发生抗体介导的病变。一种“延缓”抗体介导的病变发展的方法为当与未利用该方法相比时，在给定的期限内降低与抗体介导的病变相关的病理或症状的发展可能性和/或在给定期限内降低疾病程度。这些比较通常(但不是必须)基于临床研究，利用具统计意义的大量受试者进行。例如，基于这种治疗可以降低个体出现一种或多种抗体介导的病变症状的危险的观点(无论有无临床研究的基础)，临床医师可以决定对“危险”个体使用本发明方法。
抗体介导的病变的“发展”是指个体中抗体介导的病变(如自身免疫病)的发作和/或进展。抗体介导的病变(包括自身免疫病)的发展可以利用于此所述的标准临床技术检测。然而，发展也指最初可能不能检测的疾病进展。对本发明而言，进展是指疾病状态的生物学过程，包括例如抗体(包括自身抗体)的形成。“发展”包括发生、复发和发作。于此使用的抗体介导的病变的“发作”或“发生”包括最初的发作和/或复发。
于此使用的“危险”个体是指被认为更可能发展抗体介导的病变的个体。“危险”个体可以具有或者不具有可检测疾病，并且在利用于此描述的方法治疗之前可以展示或者不展示可检测的病症。“危险”表示个体具有一种或者多种的所谓的危险因素。具有一种或者多种的这些危险因素的个体比无这些危险因素的个体有更高可能性发展出一种或者多种自身免疫病。这些危险因素可以包括但并不限于，发展一种或者多种抗体介导的病变的家族史、既往病史、年龄、性别、种族、饮食、前病症的存在、基因(即遗传)因素、所处环境、对SLE而言发生面颊疹和蝶形疹的病史，或者对APS而言习惯性流产的病史。另一个“危险”个体的例子是正在或者将要接受可以引起非希望抗体应答的治疗剂或疗法的人体。“危险”个体是适宜接受本发明方法的个体的例子。
“表位”为本领域所熟知的术语，并且是指展示出可与抗体特异性结合的任何化学部分。“表位”也可以包括抗原，即含有表位并且同样也可特异性结合至抗体的部分或分子。
“双链DNA表位”或者“dsDNA表位”是展示出可与抗-双链DNA抗体特异结合的任何化学部分，并且同样包括含有这些表位的分子。
“特异性结合”至抗体的表位是本领域所熟知的术语，并且确定这种特异性结合的方法为本领域所公知。如果与另外的细胞或者物质相比，分子能够更频繁、更快速、更持久地和/或以更大的亲和力与特定细胞或者物质反应或者结合，那么该分子被认为展示出“特异性结合”。如果与抗体结合至其它物质相比，抗体与靶的结合具有更大的亲和力、亲合性、更容易和/或更持久，那么抗体“特异性结合”至靶。正如本领域所公知，检测特异性结合的一种方法是竞争测定，见于此所述。
于此可互换地使用的“抗-双链DNA抗体”或“抗-dsDNA抗体”或“双链DNA抗体”是指特异性结合至双链DNA(dsDNA)的任何抗体。类似地，于此可互换地使用的“抗-乙酰胆碱受体抗体”或“抗-AchR抗体”是指特异性结合乙酰胆碱受体的任何抗体。于此可互换地使用的“抗-促甲状腺激素受体抗体”或“抗-TSH受体抗体”是指特异性结合促甲状腺激素受体的任何抗体。“抗-Gal α1-3 Gal抗体”为在异种移植排斥中与α-半乳糖部分结合的任何抗体。应当理解，核蛋白质(如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70、着丝粒、组蛋白、染色质、Jo-1、组氨酰-tRNA合成酶、苏氨酰-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2)或细胞受体(如乙酰胆碱受体、促甲状腺激素受体)或者细胞蛋白质(如心磷脂)可以成为抗体的“靶”并于此将此抗体称为“抗‘靶’抗体”。另外，针对基因疗法载体(如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒等等)的抗体也包括在“抗‘靶’抗体”中。
正如在此处提供的“抗体”定义中所清楚地指明的，“抗-双链DNA抗体”或于此所描述的任何抗体包括可以展示出该必要功能性质(即特异性结合至dsDNA)的任何片断，例如包含可变区的片断，如Fab片断，并且这一原则适用于此处描述的所有抗体。正如如下所讨论的，应当理解，对任何抗双链DNA抗体(或功能性片断)的特异结合是充分的。
术语“循环抗体”是指未与生物学样品之上和/或之中它的关联表位相结合的抗体，即游离抗体。例如，术语“循环自身免疫抗体”是指未与生物学样品上和/或中它的关联表位相结合的自身免疫抗体，即游离抗体。在另一例子中，术语“循环抗-双链(ds)DNA抗体”是指未与生物学样品上和/或中的双链DNA表位结合的抗双链DNA抗体，即游离抗体。
于此使用的术语“免疫原”是指当注射至动物体内时引起体液免疫应答的化学实体。免疫原具有B细胞表位和T细胞表位。
“T细胞表位”是指这样的组分或其一部分，T细胞对其具有抗原特异性结合位点，其与该位点的结合将导致T细胞活化。当本发明实施方案被描述为“缺少”T细胞表位时，这表示利用本领域标准测定方法不能检测到T细胞表位。对本发明而言，“缺少”T细胞表位的表位是指该表位缺少在待治疗个体(即接受呈递表位的效价平台分子的个体)中引起T细胞活化的T细胞表位。例如，一个表位可能对某一或者某群个体而言缺少T细胞表位，而对其它个体而言可能具有T细胞表位。检测T细胞表位存在的方法为本领域所公知并包括检测T细胞增殖(如胸苷掺入)的试验。不能统计学显著地诱导大于本底的胸苷掺入(即利用标准的统计方法，一般p小于0.05)的免疫原一般被认为缺少T细胞表位，但应当明了，所确定的胸苷掺入量可随所测试的免疫原的不同而不同。通常，刺激参数小于约2-3，更优选小于约1表示缺少T细胞表位。T细胞表位的存在也可以通过利用标准方法测量T细胞来源的淋巴因子的分泌来确定。T细胞表位的定位和含量(如果存在)可以通过经验确定。应当理解，随着时间的推移会发展出更为敏感的测定试验来检测T细胞表位的存在，并且对T细胞表位缺少的限定取决于所用检测系统的类型。
于此可互换地使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸)的多聚体形式。这些术语包括单-、双-或者三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或者其它天然的、化学、生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的多聚体。应当理解，于此描述的双链多核苷酸序列也包括于此描述的修饰物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基团(正如一般在RNA或DNA中所发现的)，或者修饰或取代的糖或磷酸基团。另外，多核苷酸的骨架可以包含合成亚单位如氨基磷酸酯的多聚体，并且因此可以形成寡聚脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混和的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚体。硫代磷酸酯连接可以代替磷酸二酯连接。另外，双链多核苷酸还可以通过如下方式获得自化学合成的单链多核苷酸产物，所述方式为合成互补链并在适当条件下退火，或者利用适当的引物、使用DNA聚合酶从头合成互补链。以下所列为多核苷酸的非限制性例子基因或基因片断、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具任何序列的分离的DNA、具任何序列的分离的RNA、核酸探针以及引物。
正如于此所使用，“DNA”不仅仅包括A、T、C和G，也包括任何它们的类似物或这些碱基的修饰形式，例如甲基化核苷酸、核苷酸间修饰例如不带电荷的连接和硫代酯(thioate)、糖类似物的使用以及修饰的和/或其它的骨架结构，如聚酰胺。
“基本同源”是指序列同源，其中利用下述的一个序列比较算法或通过肉眼观察，在比较和比对达到最大对应性时，至少50％的序列相同，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，并且更优选至少90％的核苷酸或者氨基酸残基相同。可以比较两个序列(氨基酸或核苷酸)的全长(例如，如果它们实质上长度不同，全长是指两者之间较短者的长度)。对序列比较而言，一般一个序列作为参考序列，测试序列与其相比较。当利用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列座标(如果需要)，并设定序列算法的程度参数。随后序列比较算法基于设定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。序列比较中的最佳比对可以通过例如Smith和Waterman，高级应用数学(Adv.Appl.Math.)2482(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48443(1970)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444(1988)的相似性检索方法，通过这些算则的计算机化执行工具(威斯康星基因软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，基因计算机组，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者通过肉眼观察(一般参见Ausubel等人，当前分子生物学实验方法汇编(Current Protocols InMolecular Biology)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，纽约，同上)进行。当利用任何上述的算法时，针对视窗长度、空位罚分等等使用默认参数。两个核酸序列或者多肽基本相同的另一个指针是第一多肽(例如第一核酸编码的多肽)与第二多肽(例如第二核酸编码的多肽)具有免疫学交叉反应性。因此，例如当两条多肽仅仅由于保守性替代而不同时，那么第一多肽一般基本上与第二多肽相同。
“天然存在”是指内源的化学部分，诸如碳水化合物、多核苷酸或者多肽序列，即天然所发现的物质。对天然存在的部分的加工可以在一步或者多步骤中进行，并且这些术语包括加工的所有阶段。相反地，“非天然存在”的部分是指所有其它部分，例如天然不存在的物质，例如重组多核苷酸序列和非天然存在的碳水化合物。
当多核苷酸，在其原初状态或者在利用本领域技术人员公知的方法操作后，可以转录和/或翻译产生多肽或其片断，那么称该多核苷酸“编码”多肽。对本发明而言，并且为避免繁琐地提及互补链，这些多核苷酸的反义(或互补)链也被认为编码该序列；即，“编码”多肽的多核苷酸序列包括常规的编码链和互补序列(或链)。
“融合蛋白质”是指包含处于非天然位置的多个区域的多肽。这些区域可能正常存在于分开的蛋白质中而在融合多肽中被放置在一起，或者它们可能正常存在于同一蛋白质中但在融合多肽中被置于新的排列位置上。融合多肽也可以来自多聚体形式，无论是线性或是分支结构的，例如可以将抗-CD21单克隆抗体的可变区融合至用于筛选、纯化或者观测用途的标记上。
“宿主细胞”包括可以或者已经接受载体或者掺入多核苷酸和/或蛋白质的个体细胞或者细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然、随机或者有意突变，该后代可以不必与原初亲本细胞完全相同(在形态上或者在整套基因组DNA上)。宿主细胞包括体内转染了本发明多核苷酸的细胞。
“转化”或者“转染”是指外源多核苷酸插入宿主细胞中，这与插入所使用的方法无关，所述方法例如脂转染、转导、感染或者电穿孔。外源多核苷酸可以以非整合载体(例如质粒)形式维持，或者可以整合进入宿主细胞基因组。
“有效量”(对于抗体介导的病变，如自身免疫病的情况)是指足以实现有益或者期望结果(包括临床结果或延缓疾病发作)的量。有效量可以以一次或者多次施用形式施用。对本发明而言，于此描述的药剂(或者包含药剂的组合物)的有效量通常但不是必需为足以降低具有非期望水平的抗体(例如抗-双链DNA抗体，循环抗体或者作为免疫复合体沉积的抗体)的水平的量。对治疗而言，于此描述的药剂(或者包含药剂的组合物)的“有效量”为足以减轻、改善、稳定、逆转、减慢或者延缓抗体介导的疾病的进展或者预防该疾病的量，所述抗体介导的疾病为如自身免疫病(如系统性红斑狼疮(SLE))，包括由SLE导致的进行性炎性肾变性(即狼疮性肾炎)。对其它抗体介导的疾病例如ITP、甲状腺炎、重症肌无力、系统性硬皮病、多肌炎和APS的治疗而言，于此所述的药剂的“有效量”是指足以减轻、改善、稳定、逆转、减慢或者延缓这些抗体介导的疾病的一种或多种症状的进展或者预防该疾病症状的量，所述症状包括但并不限于，血小板减少、血泡、慢性炎性细胞的过度浸润、移植物抗宿主型外源组织排斥、异种移植排斥、滤泡破裂、嗜曙红细胞过多、不同程度的增生、纤维化、无痛性甲状腺肿、甲状腺机能减退、骨骼肌无力、易疲劳、不对称上眼睑下垂、复视、颈伸肌无力、头下垂、由于面部肌肉和球肌无力所致的当患者试图微笑时的面部扭曲、鼻的或构音障碍的低音量发音困难、可导致气阻或反胃的吞咽困难，以及可引起行走、爬梯或搬运物体困难的骨骼肌无力、手指和手掌的肿胀和增厚伴随面部的可能累及，皮肤的增厚、累及躯干和临近肘部的臂、皮肤萎缩及可能的脱发、脱皮脂腺和汗腺；皮肤柔韧性丧失；皮包骨，其中皮肤紧绷并紧结合在下面的结构上；有限的运动性，尤其是手指；主要骨骼肌无力、相邻肌肉无力、吸入性肺炎、间质性肺病、软组织钙化、雷诺氏现象的出现、动脉闭塞、四肢坏疽、中风、心肌梗死、其它内脏梗死、静脉闭塞、外周静脉闭塞、内脏静脉闭塞(如巴-希综合症、门静脉闭塞)、习惯性流产、血小板减少症、库姆斯阳性溶血性贫血、网状青斑、神经系统异常(如舞蹈症、短暂性局部缺血发作)、心瓣性心脏病以及突发性多系统动脉闭塞。症状也可以包括存活。
“分离的”或者“纯化的”多肽或多核苷酸是指其基本上不含有与其天然相关的物质。所谓基本上不合有是指至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％不含有与其天然相关的物质。
“生物学样品”包括多种获得自个体的样品，其可以用于诊断或监测测定。该定义包括血液和其它生物学来源的流体样品、实体组织样品例如活检样本或者组织培养物或者来自上述来源的细胞，以及它们的后代。该定义也包括在获得后经过任何方式操作的样品，所述操作如用药剂处理、溶解或者富集某一组分(如蛋白质或多核苷酸)。术语“生物学样品”包括临床样品，并且也包括培养的细胞、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物学流体和组织样品。
“联合”是指除施用一种治疗模式外还施用另一种治疗模式，例如向同一个体施用于此描述的药剂及另一种药剂(例如CD40、CTLA-4)。在另一例子中，一种抗-CD21单克隆抗体与另一具有不同序列但针对相同表位(例如SCR1和/或SCR2)的抗-CD21单克隆抗体一起施用。如上所述，“联合”是指在一种治疗模式施用于个体之前、之中或之后向该个体施用另一种治疗模式。
“接受治疗”包括初始治疗和/或继续治疗。
“个体”为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但并不限于农畜、运动动物、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。
“包含”是指包括。
除非另外指明，于此使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数意义。例如，抗体包括一种或多种抗体，而“症状”是指一种或多种症状。
发明方法对于此描述的所有方法而言，所涉及的组合物例如抑制CD21与C3d相互作用的药剂也包括含有这些物质中的一种或多种的组合物。这些组合物还可以含有适当的赋形剂，例如药学可接受的赋形剂(包括缓冲液)，这为本领域所公知。
通过抑制CD21/C3d介导的B细胞活化治疗抗体介导的病变的方法本发明提供以产生抗体为特征的抗体介导的病变(例如自身免疫病)的治疗方法。该方法涉及抑制或者阻抑CD21/C3d的相互作用，这可以干扰CD21介导的B细胞活化，特别是，可以干扰能导致抗体产生的CD21/C3d介导的活化，所述抗体产生包括抗体产生和自身抗体产生。
本发明方法涉及施用抑制CD21/C3d相互作用的药剂。将表达CD21的淋巴细胞(一般为B细胞)暴露于可抑制CD21/C3d相互作用的药剂，由此可以抑制CD21介导的B细胞活化和抗体产生。在一些实施方案中，可以使用天然存在的CD21表达细胞(例如B细胞)。在一些实施方案中，将抑制CD21/C3d相互作用的药剂以足够的量施用至个体以抑制CD21/C3d介导的B细胞活化以及随后的抗体产生，通常由此可使一种或多种症状得以减轻和/或使疾病的发展被延缓。
可以通过干扰CD21/C3d相互作用抑制CD21的活化作用并由此抑制CD21/C3d介导的B细胞活化和随后的抗体产生的任何药剂都是适宜的。可以抑制CD21/C3d相互作用并因此降低抗体产生水平(与未使用这些药剂的抗体产生水平相比)的药剂也是适宜的。在另一实施方案中，任何可以抑制CD21/C3d相互作用并由此延缓表达CD21的B细胞发育成分泌抗体的浆细胞的药剂也是合适的。适用于抑制CD21/C3d相互作用的药剂包括但并不限于抗-CD21抗体、它的衍生物或片断，以及细胞CD21的竞争剂(例如可以结合C3d的可溶性CD21)。在一个实施方案中，该抗体针对CD21的SCR1和/或SCR2区域。适宜的药剂及制备这些药剂的方法的描述在文本中公开。在另一实施方案中，该药剂为可溶性CD21分子，其可以结合至C3d并与细胞CD21竞争结合尚未结合的C3d。
应当理解，虽然推测地抗体介导的病变的症状发展的改善和/或延缓是由于抑制B细胞活化和/或抗体产生所致，而这种药剂的施用可以导致抗体产生的减少，但精确的机制并不需要明了。任何药剂只要可以干扰CD21/C3d相互作用并由此可以通过施用而有助于和/或导致这种疾病发展的改善和/或延缓，则对本发明而言都是适宜的。
CD21/C3d介导的B细胞活化可以通过本领域技术人员所公知的任何方法检测。一种可以使用的方法是利用PCR和凝胶电泳检测VDJ重组。另一种可以用于检测B细胞活化的方法是利用流式细胞术和B细胞活化的指示性标志，其包括但并不限于CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD39、CD69、CD72、CD75、CD76、CD86、CD97、CD125、CD126、CD130和CD153。
本发明使用可以抑制CD21/C3d相互作用的药剂。对这种相互作用的抑制可以阻止B细胞活化和/或阻抑抗体产生。优选地，抗体产生被抑制、阻抑或者降低。因此，在接受治疗的个体中抗体的水平可以被降低。这种方法可以用于治疗个体的抗体介导的病变，例如自身免疫病(例如SLE)，其通过向个体施用抑制CD21与C3d相互作用的药剂来进行。本方法也可用于延缓个体中抗体介导的病变例如自身免疫病(例如SLE、ITP或者甲状腺炎)的发展。在没有任何自身抗体出现的情况下皮疹(如蝶形疹)、易疲劳、习惯性流产、言语或微笑困难的发生可能是随后而来的自身抗体发生的征兆。可以在自身抗体出现之前将于此描述的药剂施用给具有皮疹或其它与SLE相关的初期症状的个体。于此提供的方法也可以用于阻止SLE的复发或者长期延缓与SLE相关的症状。
可以使用几种方法来评价对CD21/C3d相互作用的抑制。这些方法适用于多种可抑制CD21/C3d相互作用的药剂(例如抗-CD21抗体或可溶性CD21)。一种评价对CD21/C3d相互作用的抑制的方法是确定抗-CD21单克隆抗体与B细胞或其它表达CD21的细胞(例如来自接受该抗体治疗的个体)的结合。抗体与细胞上CD21的结合可以利用结合至抗-CD21的第二抗体直接确定。第二抗体可以偶联酶(如辣根过氧化物酶)或荧光染料例如荧光素。应当理解，第二抗体应该针对抗-CD21抗体的动物种类。例如，如果药剂为小鼠抗-CD21单克隆抗体，那么与观察标志物偶联的第二抗小鼠IgG可以用于评价这种结合。或者，可以通过利用偶联了酶或荧光染料的无关抗-CD21抗体测量CD21的表达来确定来自接受治疗的个体的B细胞或其它表达CD21的细胞上CD21的水平。
另一种可用于评价对CD21/C3d相互作用的抑制的方法是使用包被了C3d的ELISA培养板，将ELISA培养板接触生物学样品(例如B细胞或者其它表达CD21的细胞)并计数结合至ELISA培养板上的细胞的数目。在另一备选方法中，在ELISA培养板上通过比色测定(例如MTT染色)来评价活细胞表达的酶。
另一种可以使用的方法为利用抗红细胞抗体和补体通过经典补体活化途径利用补体片断包被红细胞(例如绵羊红细胞，SRBC)。补体装饰的SRBC可以从National Jewish Hospital的补体实验室(Denver，CO)获得。在不存在抗-CD21抗体的条件下混和补体包被的SRBC和表达CD21的细胞，形成“玫瑰花结”。相反，在存在抗-CD21抗体的条件下混和补体包被的SRBC和表达CD21的细胞不形成“玫瑰花结”，因为抗-CD21抗体与CD21的结合抑制了CD21结合至SRBC。这种玫瑰花结技术也可以用于评价可溶性CD21抑制CD21/C3d相互作用的能力。另一种可以使用的方法是通过补体旁路途径的活化，使用在血清中孵育的酵母颗粒来固定补体。随后酵母颗粒可以与表达CD21的细胞接触并监测玫瑰花结的形成。另一种可以使用的方法是通过旁路途径的活化或者通过与纯化的补体片断直接偶联，用补体片段包被荧光乳胶小珠(Molecular Probes，Eagene，Oregon)。小珠与表达CD21的细胞的结合可以通过显微镜或者通过流式细胞术确定。
另一种可用于评价对CD21/C3d相互作用的抑制的方法是从每一个体(在不同增加剂量)获得生物学样品(例如血液)，并且如果需要，通过将全血倒入绵羊红细胞(SRBC)中从B细胞中分离出T细胞。T细胞会优先结合至SRBC上，并且T细胞-SRBC群体具有比B细胞更大的密度。利用密度离心可以从B细胞中分离T细胞-SRBC群体。随后可以在标准ELISA中将B细胞与C3d包被的培养板接触，如果抗-CD21抗体(或者备选地，可溶性CD21)的水平足够封闭B细胞上的所有C3d结合区域，那么将几乎没有或者完全没有B细胞会结合至C3d包被的培养板上。
另一种可以用于评价对CD21/C3d相互作用的抑制的方法是利用偶联有可检测标志(例如FITC)的抗-CD21抗体。可以从接受了偶联有可检测标志的抗CD21抗体的个体中获得生物学样品。利用流式细胞术通过在适当通道(例如对FITC而言FL1)中监测所述可检测标志物，并联合第二抗体以确认抗-CD21抗体已经结合至B细胞上来观察与B细胞的结合。一旦确认B细胞具有结合至其上的抗-CD21抗体，它们就可以与补体包被的SRBC混和并监测如上所述的“玫瑰花结”的出现。
另一种用于评价可以抑制CD21/C3d相互作用的药剂(例如可溶性CD21或者抗-CD21抗体)对CD21/C3d相互作用的抑制的方法是竞争测定(例如Farr测定)。其它用于评价可以抑制CD21/C3d相互作用的药剂(例如可溶性CD21或者抗-CD21抗体)对CD21/C3d相互作用的抑制的方法也可以使用并且它们为本领域普通技术人员所公知。
抗体介导的病变例如自身免疫病(例如SLE)的几种小鼠模型可以用于测试可以抑制CD21/C3d相互作用从而在抗体介导的病变中阻抑抗体应答的药剂(例如抗-CD21抗体或sCD21)。一种模型为自发狼疮模型，其利用雌性新西兰黑×新西兰白(NZB×NZW)F1小鼠。另一可以使用的模型为MRL lpr/lpr自发狼疮模型。MRL lpr/Ipr小鼠发展出与SLE人类患者相似的症状。这些症状包括但并不限于高效价的抗-dsDNA抗体、低补体血症、淋巴结病和致命的免疫复合体介导的肾小球肾炎。
另一个可以用于评价治疗效果的动物模型是抗-DNA抗体产生的诱导模型。在这一模型中，将寡核苷酸-匙孔血蓝蛋白(ON-KLH)以有效量施用至小鼠以诱导抗-dsDNA抗体的形成。实施例1公开了在小鼠模型中如何使用ON-KLH诱导抗-ON抗体。ON-KLH通过将KLH偶联至由(CA)10-(TG)10组成的20-mer双链寡核苷酸上而制成，并可以通过上述任何方法施用。施用方法包括但并不限于注射(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌内等等)。随后可以允许小鼠产生抗-ds ON抗体，然后将一种或多种抑制CD21与C3d相互作用的药剂(例如抗-CD21抗体或可溶性CD21蛋白质)施用给小鼠。抗-ds DNA抗体的水平可以在实验进程的任何时间监测，其包括但并不限于在施用一种或多种抑制CD21与C3d相互作用的药剂之前的一个或多个时间点，以及在施用一种或多种抑制CD21与C3d相互作用的药剂之后的一个或多个时间点。
评价治疗效果的其它方法也在此进行了描述。对于各种抗体介导的病变，其它本领域公认的适宜小鼠模型在实施例中描述。
抑制CD21与C3d相互作用的药剂本发明方法涉及与CD21相互作用的药剂的使用，所述相互作用可以抑制CD21与补体片断iC3b、C3d和C3dg的相互作用。应当理解，在本文本中C3d和C3dg可以互换地使用。提及C3d应理解为也包括C3dg和iC3b。iC3b包括C3dg和C3d的氨基酸序列并以相似的亲和力结合至CD21。iC3b被蛋白酶裂解后产生C3dg。C3dg在羧基末端具有几个额外的氨基酸，这些氨基酸被细胞蛋白酶切除后产生C3d。
因此，本发明所期望的药剂包括但并不限于抗-CD21抗体、融合蛋白质、可溶性蛋白质(如可溶性CD21)和重组蛋白质。
因此，一个可以利用的干扰CD21/C3d相互作用的药剂的例子为可溶性CD21(sCD21)蛋白质，其结合至C3d配体并与细胞CD21竞争结合尚未发生结合的C3d。优选大多数C3d被sCD21结合，由此使细胞CD21(即结合在例如B细胞和T细胞等细胞的表面的CD21)与未结合的C3d间的相互作用被抑制或者阻抑，并且使抗体产生减少或者受到抑制。sCD21可以通过公开在Hebell等人(1991)科学(Science)254102或者WO91/16437上的方法获取，这些方法在下文描述。
在一些实施方案中，药剂可以是抗-CD21抗体，例如人或者人源化抗体。一个可以使用的抗-CD21抗体的例子是结合至CD21中与C3d天然结合的区域的抗体。短共有区域1和2为这种区域的例子。在一个实施方案中，药剂为结合至人CD21的短共有区域1(SCR1)和SCR2的小鼠抗-人抗体。在另一实施方案中，药剂为结合至人CD21的短共有区域1(SCR1)和短共有区域2(SCR2)的人源化抗体。在另一实施方案中，药剂为结合至人CD21的短共有区域1(SCR1)和SCR2的人抗体。在再一实施方案中，药剂为结合至SCR1或其部分的抗体。在另一实施方案中，药剂为结合至SCR2或其部分的抗体。
抗体可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片断(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等等)、嵌合抗体、单链(ScFv)、它们的突变体、含有抗体部分的融合蛋白质、人源化抗体，以及任何其它修饰构型的含有具所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子。抗体可以是小鼠、大鼠、人或者任何其它来源的。对本发明而言，抗体以抑制人CD21与C3d相互作用并且可以阻抑CD21/C3d介导的B细胞活化和随后的抗体产生的方式与人CD21反应。在一个实施方案中，抗体为识别人CD21上可与C3d结合的一个或多个表位的小鼠或者大鼠抗体。表位可以是连续或者不连续的。抗体可以针对的表位的例子包括但并不限于短共有区域1和2(SCR1和/或SCR2)。如果需要，结合至SCR1和/或SCR2的抗体(例如大鼠单克隆抗体7G6，其针对小鼠CD21)可以按照Kinoshita等人(1988)免疫学杂志(J.Immunol.)1403066方法获取，并且可以在适当的、本领域公认的小鼠疾病模型中使用。在另一方面，抑制CD21与C3d相互作用(例如对CD21的SCR1和/或SCR2表位具特异性)的抗体(例如人、人源化、小鼠、嵌合的)可以通过利用表达CD21的免疫原制备。一个免疫原的例子为具有高的CD21表达的细胞，例如Raji细胞，其可以从ATCC获取(登录号#CCL-86)。另一个可以使用的免疫原的例子为含有CD21的SCR1和/或SCR2部分的可溶性CD21融合蛋白质。CD21的SCR1和/或SCR2部分可以与重链IgG相融合，例如象公开在WO 91/16437中的那样。Raji细胞或者CD21融合蛋白质可以单独使用或者彼此联合使用作为免疫原。
在另一方面，可以使用的结合至人CD21(具体地，结合至SCR1和/或SCR2)的抗体为小鼠抗-人单克隆抗体(mAb)2B12。mAb 2B12按照实施例6-11的描述生成并鉴定。已经证明mAb 2B12可以破坏CD21和C3d之间的相互作用(实施例7)。按照布达佩斯条约，产生mAb 2B12的杂交瘤已经在2002年5月15日被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas VA 20110-2209)，保藏号为——。本发明提供这一杂交瘤或者它的任何子代(其可能与保藏的杂交瘤相同或者不相同)。
因此，本发明提供下述的任何一项(或者含有下述任何一项的组合物，包括药物组合物)(a)抗体2B12；(b)由上述杂交瘤产生的抗体；(c)抗体2B12的人源化形式；(d)由上述杂交瘤产生的抗体的人源化形式；(e)包含抗体2B12轻链和/或重链可变区的抗体；(f)包含由上述杂交瘤产生的抗体的轻链和/或重链可变区的抗体；(g)包含2B12的轻链和/或重链CDR的抗体；(h)包含由上述杂交瘤产生的抗体的轻链和/或重链CDR的抗体。抗体的人源化形式可以具有或不具有与2B12或者与上述杂交瘤产生的抗体相同的CDR。CDR区域的确定为本领域技术人员所公知。在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个CDR的抗体，所述CDR与2B12或者由上述杂交瘤产生的抗体的至少一个CDR、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个CDR基本同源(或者，在一些实施方案中与2B12的所有6个CDR基本同源)。其它实施方案包括具有至少2个、3个、4个、5个或者6个CDR的抗体，所述CDR与2B12或者由上述杂交瘤产生的抗体的至少2个、3个、4个、5个或6个CDR基本同源。应当理解，对本发明而言，结合特异性和/或总体活性(可以就抗体产生的阻抑和/或一种或多种症状的改善而言)通常会得以保持，但与2B12相比活性程度可能不同(可能更大或者更小)。本发明也提供制备这些抗体的方法。制备抗体的方法为本领域公知并将在本文中描述。
免疫宿主动物的途径和时间表一般与已建立的用于抗体刺激和产生的常规技术相一致。
根据预期，任何哺乳动物对象(包括人)或者由其来源的产生抗体的细胞都可以通过操作而作为哺乳动物(包括人)杂交瘤细胞系产生的基础。一般地，给宿主动物腹膜内接种足以引起免疫原应答的量的免疫原，例如Raji细胞或者SCR1/SCR2融合蛋白质，并且随后利用相似量的免疫原加强免疫。在最后一次加强后收集宿主的淋巴样细胞(优选脾淋巴样细胞)并且利用其制备细胞悬液用于融合。
杂交瘤可以利用通常的体细胞杂交技术从淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备，所述体细胞杂交技术为Kohler，B.和Milstein，C.(1975)自然(Nature)256495-497公开或者如Buck，D.W等人(1982)体外(InVitro)18377-381所改良。可以在杂交中使用现有的骨髓瘤细胞系，包括但并不限于X63-Ag8.653以及那些来自Salk Institute，Cell DistributionCenter，San Diego，Calif.，USA的细胞系。通常，该技术涉及利用融合剂例如聚乙二醇，或者利用本领域技术人员已知的与电有关的方法融合骨髓瘤细胞和淋巴细胞。经融合后，将细胞从融合培养基上分离，并在选择生长培养基(例如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基)上生长以淘汰未杂交的亲本细胞。于此描述的培养基(无论其补充血清与否)都可以用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一替代方法，EBV永生化B细胞可以用于产生本发明的抗-CD21单克隆抗体。将杂交瘤扩大并，如果需要，亚克隆，之后利用常规的免疫测定方法测定上清中的抗-免疫原活性，所述方法例如放射免疫测定、酶免疫测定或者荧光免疫测定。
可以作为抗体源使用的杂交瘤包括亲本杂交瘤的所有衍生物、子代细胞，它们将产生抗原特异性单克隆抗体，这些抗体具有用于免疫的细胞类型的特征。
产生这些抗体的杂交瘤可以利用已知的方法在体外或者体内生长。如果需要，单克隆抗体可以从培养基或者体液中分离，分离手段可以为常规的免疫球蛋白纯化方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析和超滤。如果存在非期望的活性，那么可以通过例如将制备物过由连接至固相上的免疫原制成的吸附剂并从免疫原上洗脱或者释放所需抗体而除去这些活性。利用Raji细胞或者SCR1/SCR2融合蛋白质免疫宿主动物可以产生抗体(例如单克隆抗体)群。
如果需要，可以测序目的抗-CD21抗体(单克隆或多克隆)，并且可以随后将该多核苷酸序列克隆入载体用于表达或者扩增。编码目的抗体的序列可以在宿主细胞的载体中保持，并且随后宿主细胞可以进行扩大培养并冻存以备将来使用。在备选方案中，多核苷酸序列可以用于基因操作以使抗体“人源化”或者改善抗体的亲和力或者其它特性。例如，如果抗体用于临床试验和人的治疗，则可以改造恒定区域使其与人恒定区域更相似以避免免疫应答。可能期望通过基因操作抗体序列获得对SCR1和/或SCR2的更大亲和力。对本领域技术人员显而易见的是，可以对抗-CD21抗体进行-个以上的多核苷酸改变，而仍使其保维持对SCR1/或SCR2区域或者CD21的表位的结合能力。
单克隆抗体的人源化有4个一般步骤。它们是(1)确定起始抗体轻链和重链可变区的核苷酸和推测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪一抗体框架区域；(3)实际的人源化方法学/技术，以及(4)人源化抗体的转染和表达。参见例如美国专利号4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
现已描述了多种含有来自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子，包括具有与人恒定区融合的啮齿类或修饰的啮齿类V区和它们的相关互补性决定区(CDR)的嵌合抗体。参见例如Winter等人，自然(Nature)349293-299(1991)，Lobuglio等人，美国国家科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)864220-4224(1989)，Shaw等人，免疫学杂志(J.Immunol.)1384534-4538(1987)以及Brown等人，癌症研究(Cancer Res.)473577-3583(1987)。其它参考文献描述了在与适当的人抗体恒定区融合之前嫁接至人支持构架区(FR)上的啮齿类CDR。参见例如Riechmann等人，自然(Nature)332323-327(1988)，Verhoeyen等人，科学(Science)2391534-1536(1998)，以及Jones等人，自然(Nature)321522-525(1986)。另一参考文献描述了被重组镶饰的啮齿类构架区所支持的啮齿类CDR。参见例如欧洲专利出版号519,596。
这些“人源化”分子设计以最小化针对啮齿类抗-人抗体分子的非期望免疫学应答，所述应答将限制这些部分在人类受者中的治疗应用持续时间和效力。其它也可以使用的人源化抗体的方法公开在Daugherty等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，192471-2476(1991)和美国专利号6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。
另一方面，完全人抗体可以通过利用已被改造表达特异人免疫球蛋白的商业化小鼠获得。设计以产生更合乎期望的(例如完全人抗体)或者更强的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化或者人抗体。这种技术的例子有Abgenix公司(Fremont，CA)的XenomouseTM和Medarex公司(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse和TC MouserM。
或者，抗体可以利用本领域任何已知的方法通过重组技术制备和表达。抗体的重组制备方法为首先分离宿主动物产生的抗体，获得它的基因序列，并利用此基因序列在宿主细胞(例如CHO细胞)中重组表达抗体。可供使用的另一方法为在植物(例如烟草)或者转基因奶中表达抗体序列。在植物或者转基因奶中表达抗体序列的方法已经公开。参见例如Peeters等人(2001)疫苗(Vaccine)192756；Lonberg，N.和D.Huszar(1995)国际免疫学评论(Int.Rev.Immunol.)1365；和Pollock等人(1999)免疫学方法杂志(J Immunol Methods)231147。制备抗体衍生物(例如人源化、单链等等)的方法为本领域技术人员所公知。另外，抗体可以通过噬菌体展示技术重组制备。参见例如美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter等人免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)(1994)12433-455。
通过免疫宿主动物或者重组技术制备的抗体应展现下列的所有特征(a)结合CD21；(b)结合CD21中可与C3d结合的一个或多个表位；(c)结合CD21以抑制CD21/C3d介导的B细胞活化；(d)结合CD21以抑制CD21/C3d介导的B细胞活化并降低抗体产生的水平。
也可以使用免疫测定和流式细胞分选技术例如荧光激活细胞分选术(FACS)来分离对CD21特异且更优选对CD21的SCR1和/或SCR2表位特异的抗体。例如，可以使用C3d包被的和可溶性CD21包被的培养板进行ELISA来确定对CD21的C3d结合部分(即SCR1和/或SCR2)具特异性的抗体。流式细胞术可以用于评价抗体与CD21表达细胞或细胞系的结合程度，上述CD21表达细胞包括但并不限于B细胞，所述细胞系例如Raji。或者，抗体可以通过与B细胞群相混和并随后将B细胞暴露于分离形式(例如C3d包被的培养板)或者天然形式(例如，存在血清中)的C3d源而筛选。流式细胞术和B细胞活化指示性标志可以用于检测抗-CD21抗体抑制B细胞活化的情况，所述B细胞活化指示性标志包括但并不限于CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD39、CD69、CD72、CD75、CD76、CD86、CD97、CD125、CD126、CD130和CD153。
抗体可以结合至许多不同的载体上。载体可以为活性的和/或者惰性的。为人所熟知的载体的例子包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、玻璃、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。对本发明而言，载体的性质可以为可溶或不溶的。本领域技术人员知道或能利用常规试验确定用于结合抗体的其它适宜载体。
抗体也可以偶联至可检测试剂上。复合体可以用于检测样品中与抗体特异结合的抗原，这可以利用如Harlow和Lane(1988)(上述引文)所描述的标准免疫化学技术，例如流式细胞术或者免疫组化进行。可检测标志也可以用于确定对细胞类型(例如B细胞)的结合特异性，方法是利用可检测标志与另一明确的B细胞标志(例如CD19、CD20、CD22等)并通过FACS分析染色模式。多种不同的标记物和标记方法为本领域技术人员所公知。可以在本发明中使用的标记物类型的例子包括放射性同位素、酶、胶体金属、荧光化合物(例如FITC、PE、PECy5、APC等)、生物发光化合物和化学发光化合物等等。本领域技术人员将知道或者能够利用常规试验确定用于结合抗体的其它适宜标记物。此外，这些标记物与本发明抗体的结合可以利用对本领域普通技术人员而言一般的标准技术完成。
药剂的施用可以使用药剂(例如抗体或其片断)的各种制剂形式来给药。在一些实施方案中，药剂(例如抗-CD21抗体或其片断)可以单独施用。在一些实施方案中，药剂含有抗-CD21抗体或其片断和药学可接受的赋形剂，并且可以为各种制剂形式。药学可接受赋形剂为本领域所公知，并为有利于药理有效物质施用的相对惰性物质。例如，赋形剂可以赋予形状或者稠度，或者作为稀释剂使用。合适的赋形剂包括但并不限于稳定剂、湿润和乳化剂、针对不同摩尔渗透压浓度的盐、包囊剂、缓冲液和皮肤穿透增强剂。赋形剂以及用于肠胃外和非肠胃外药物递送的制剂在<<Remington，Science and Practice of pharmacy，第20版，Mack出版公司(2000)中列出。
通常，这些药剂配制用于注射施用(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌内等等)。因此，这些药剂优选与药学可接受载体如盐、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液等等混和使用。具体给药方案(即剂量、时机和重复)将依赖于特定个体和该个体的病史。经验考虑因素(例如半衰期)通常将有助于剂量的确定。施用频度可随治疗进程确定和调整，并且一般(但不是必须)基于对抗体产生减少的维持和/或对一种或者多种症状的阻抑/改善/延缓。其它适当的给药时间表可以为每天连续输注或者每周3次给药，或者每周一次给药，或者每2到4周一次给药，或者每月一次给药或者更小的频度，这取决于接受治疗的个体或者抗体介导的疾病的状况。可能需要重复施用来获得和/或维持对CD21/C3d相互作用的阻抑状态从而治疗抗体介导的病变例如自身免疫病(例如SLE)，其中重复给药的时间安排通常基于B细胞周转速率来确定。或者，药剂的持继缓释制剂可能是适宜的。用于获得缓释的多种制剂和装置为本领域公知。
备选地，可以对具有抗体介导的病变如自身免疫病(例如SLE)家族史的个体，相应地调整给药方案以延缓抗体介导的病变的发展。在这种情况下，应当考虑平衡有效剂量和由可能毒性所致的副作用。
在一个实施方案中，对已经接受过一次或者多次抑制CD21/C3d相互作用的药剂施用以治疗抗体介导的病变如自身免疫病(例如SLE)的个体而言，药剂的剂量可以由经验确定。可以给予个体增加的药剂剂量，所述药剂抑制CD21/C3d相互作用，例如抗-CD21抗体。从施以不同增加剂量的每一个体中获得生物学样品(例如血液)并且(如果需要)通过将全血加入到绵羊红细胞(SRBC)中将T细胞从B细胞中分离。T细胞优先结合SRBC并且T细胞-SRBC群比B细胞具有更大的密度。利用密度离心可以从B细胞中分离T细胞-SRBC群。随后可以在标准ELISA中将B细胞与C3d包被的培养板接触，如果抗-CD21抗体的水平足够封闭B细胞上的所有C3d区域，那么将几乎没有或者完全没有B细胞结合至C3d包被的培养板上。或者，可以将补体包被的SRBC用在如上所公开的玫瑰花结测定中。在另一替代方案中，也可以通过例如FACS监测接受治疗的个体的细胞表面上CD21的丧失。CD21的丧失可因施用一种或者多种本文公开药剂进行治疗后细胞表面上CD21的下调引起或者因CD21的脱落而发生。参见例如Fremeaux-Bacchi等人(1999)免疫药理学(Immunopharmacology)4231。
对本领域技术人员显而易见的是，剂量可以随个体、抗体介导的病变的阶段和个体内B细胞组成的不同而不同。此外，按占整体淋巴细胞的百分数计具有较多B细胞组成的个体比具有低比例B细胞的个体可能需要更高的剂量。出现SLE症状(例如抗-dsDNA抗体或者抗β2GPI抗体(它们也在具有APS或者抗体介导的血栓形成的个体中出现))的个体与具有低或者无抗-dsDNA抗体水平的个体相比可能需要更高剂量的抑制CD21/C3d相互作用的药剂。
其它制剂包括本领域公知的适当的递送形式，其包括但并不限于载体，例如脂质体。Mahato等人(1997)药理学研究(Pharm.Res.)14853-859。脂质体制剂包括但并不限于细胞转染剂、多层脂质体和单层脂质体。
在一些实施方案中，存在一种以上的药剂，例如抗体。这些药剂可以彼此相同或者不相同。这些药剂可以含有至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的抗体。抗-CD21抗体可以与一种或者多种针对B细胞表面蛋白质具反应性的抗体混和，所述表面蛋白质包括但并不限于CD19、CD20、CD23、CD28、CD38、CD40、CD45、CD45R或CD81。在一个实施方案中，B细胞表面蛋白质为B细胞活化或者B细胞成熟中涉及的蛋白质。B细胞的成熟可以指B细胞发育的任何阶段。在一个实施方案中，抗体为针对活化途径(例如CD19和CD81)的抗体的混合物。在另外的实施方案中，抗体为针对发育过程中的特异B细胞群(例如未成熟B细胞、成熟的幼稚B细胞、淋巴母细胞、记忆B细胞或者浆细胞)的抗体的混合物。在另一实施方案中，抗-CD21抗体与可以和T淋巴细胞表面蛋白质反应的抗体混和，所述表面蛋白质参与辅助B细胞活化和/或成熟。这些蛋白质的例子包括但并不限于CD40配体，CD152(CTLA4)和CD28。正如在本领域中常常指出的，抗体的混合物可能对于治疗更广范围的个体群是尤其有用的。应当理解，个体中任何B细胞群体都含有处于不同发育时期的未成熟、部分成熟和成熟B细胞的混合物。与使用仅仅一种(或者比“鸡尾酒”中含有的种类少)抗体相比，抗-CD21抗体与其它抗淋巴细胞蛋白质的联合也可能更为有效。
在一些实施方案中，该方法涉及施用药剂(其可以是抗体)并与另一治疗方法或者治疗模式相联合。在一些实施方案中，所述其它疗法不同于基于CD21的疗法(即此额外的疗法不影响CD21/C3d相互作用)。因此，本发明提供了这样的方法，该方法还包括施用另一或额外治疗(或治疗剂)，该额外治疗(式治疗剂)可以包括一种或多种额外治疗(治疗剂)。额外治疗(或治疗剂)可以是任何可用于治疗抗体介导的病变的形式(包括药剂或者其它治疗，例如放疗)。例如，可以向同一个体施用一种或者多种免疫抑制剂以及适用于狼疮的药剂，所述免疫抑制剂为例如皮质类固醇环磷酰胺免疫抑制剂。例如对免疫抑制疗法而言，可以施用一种或者多种额外的治疗剂，并且这些联合疗法为本领域公知。环磷酰胺(以及其它免疫抑制剂)的施用(包括制剂、给药等等)为本领域公知。这种联合可以降低对往往具有不良副作用的其它治疗剂的需要(例如更少的施用和/或给药频率)。相反，由于基于CD21的疗法的保护作用，这些联合疗法也可以允许更高的剂量。
评价疗效的方法疗效的评价可以在几种不同的水平进行。评价可以通过监测临床病征(例如与抗体介导的病变(如SLE、ITP或甲状腺炎)相关的症状)、细胞应答(例如抗体分泌)或者一种或多种细胞内的分子变化(例如B细胞活化标志)进行。对抗体介导的病变的治疗的各种测量的例子已经在上文中进行了讨论。
对抗体介导的病变例如自身免疫病的治疗疗效的检测与测量通常基于对自身抗原引起的自身免疫应答水平和/或其它与自身免疫疾病相关的症状的检测与测量。自身免疫应答水平可以由针对自身抗原的抗体效价来反映。优选地，与利用本发明一种或多种药剂治疗前相比，利用本发明一种或多种药剂治疗后针对自身抗原的抗体效价降低。在SLE的情况中，对抗-双链DNA(抗-dsDNA)抗体、抗-SM核抗原抗体、抗-β2GPI抗体(其也出现在具有APS或者抗体介导的血栓症的个体中)和/或SLE相关临床症状的测量(上述为本领域所公知)可以用作疗效的测量。抗-dsDNA抗体水平的测量可以通过在临床情况下常规使用的测试(例如Farr测试或ELISA)来完成。其它SLE相关症状的例子包括但并不限于面颊疹、盘状疹、蝶形疹、光敏感口腔溃疡、关节炎、浆膜炎(胸膜炎和/或心包炎)、肾病(例如蛋白尿)、神经系统病症(例如癫痫发作或精神病)、血液病(例如溶血性贫血、白细胞减少症、淋巴细胞减少症、血小板减少症)和狼疮性肾炎。狼疮性肾炎(肾小球性肾炎或者肾发炎)以肾功能的进行性丧失并最后导致肾衰竭为特征。狼疮性肾炎的特征为血尿、尿量减少、血尿氮水平升高、血清肌酸酐水平升高、高血压和蛋白尿。因此，这些参数可以作为监测肾变性的手段。
对甲状腺炎而言，疗效的确定可以包括但并不限于测量针对促甲状腺激素受体的抗体效价水平和甲状腺炎相关症状的改善或者减轻，上述症状包括但并不限于慢性炎性细胞的过度浸润、滤泡破裂、嗜曙红细胞过多、不同程度的增生、纤维化、无痛性甲状腺肿和甲状腺机能减退。
对ITP而言，疗效的确定可以包括但并不限于测量血小板水平、临床出血(例如紫癜、鼻血丑、齿龈出血或者月经过多)的改善、血泡和下肢瘀斑的消散。
对异种移植而言，疗效的确定可以包括但并不限于测量针对移植(即异种)组织的抗体效价水平、移植物抗宿主应答的减少或消失，和移植组织排斥的排斥减轻(例如坏死组织的减少或者消失)，这可由本领域技术人员确定。
对APS(也可以包括抗体介导的血栓症)而言，疗效的确定可以包括但并不限于测量针对抗磷脂、心磷脂或者β2-GPI抗体效价的水平。另外，与APS相关的非限制性症状包括动脉闭塞、四肢坏疽、中风、心肌梗死、其它内脏梗死、静脉闭塞、外周静脉闭塞、内脏静脉闭塞(如巴-希综合症、门静脉闭塞)、习惯性流产、血小板减少症、库姆斯阳性溶血性贫血、网状青斑、神经系统异常(如舞蹈症、短暂性局部缺血发作)、心瓣性心脏病以及突发性多系统动脉闭塞。
对重症肌无力而言，疗效的确定可以包括但并不限于测量针对乙酰胆碱受体的抗体效价水平和与重症肌无力相关的症状的改善或减轻，所述症状包括但并不限于可引起行走、爬梯或搬运物体困难的骨骼肌无力、易疲劳、不对称上眼睑下垂、复视、颈伸肌无力、头下垂、由于面部肌肉和球肌无力所致的当患者试图微笑时的面部扭曲、鼻的或构音障碍的低音量发音困难、可导致气阻或反胃的吞咽困难。
对系统性硬皮病而言，疗效的确定可以包括但并不限于测量针对核蛋白质如SS-A(Ro)、SS-B(La)、Scl-70和着丝粒的抗体效价水平。另外，与系统性硬皮病相关的症状包括但并不限于手指和手掌的肿胀和增厚并可能累及面部，皮肤的增厚、累及躯干和临近肘部的臂。皮肤萎缩并可能脱发、脱皮脂腺和汗腺；皮肤柔韧性丧失；皮包骨，其中皮肤紧绷并紧结合在下面的结构上；以及有限的运动性，尤其是手指。
对多肌炎而言，疗效的确定可以包括但并不限于测量针对核蛋白质如Jo-1、组氨酰RNA合成酶、苏氨酰-tRNA合成酶、PM-1和Mi-2的抗体的效价水平。另外，与多肌炎相关的症状包括但并不限于主要骨骼肌无力、相邻肌肉无力、吸入性肺炎、间质性肺病、软组织钙化和雷诺氏现象。
一般地，测量适当的抗体效价(依赖于疾病种类)对监测疾病状况以及合适的剂量是合适的。对本发明而言，一种或者多种症状得以改善(如果适当，包括疾病事件的发生和频度)和/或延缓。
药剂盒本发明提供实现本发明方法的药剂盒。因此，本发明提供适当包装的多种药剂盒。药剂盒可以用于于此描述的任何一种或者多种用途，并且相应地可以含有用于任何一种或多种下列用途的说明书，所述用途为治疗抗体介导的病变；延缓抗体介导的病变的发展。
本发明药剂盒包含一个或多个容器，容器中含有于此描述的任何一种药剂，例如抗体。每一组分(如果存在一种以上组分的话)可以分别包装在不同容器中，或者在交叉反应性和保存期所允许的情况下，一些组分可在一个容器中混和。
本发明药剂盒可以任选地包括一套与本发明方法中各组分的使用相关的说明书，尽管含有说明书的电子存贮介质(例如磁盘或光盘)是可以接受的，但一般包括书写的说明书。包含在药剂盒中的说明书一般包括有关组分以及将它们施用给个体的信息。
提供下述实施例用于阐释而并不是限制本发明。
实施例实施例1 使用sCD21降低抗-dsDNA抗体的水平利用模式T细胞依赖型抗原致敏C57/B6小鼠，上述模式T细胞依赖型抗原为以3.8摩尔寡核苷酸/摩尔KLH的比例偶联至由(CA)10-(TG)10组成的20-mer双链寡核苷酸上的匙孔血蓝蛋白(KLH)(ON-KLH)。
将小鼠取血并随后腹膜内施用50μg明矾沉淀的ON-KLH连同作为另外佐剂的2×109个处死的百日咳博德特氏杆菌(B.Pertussis)生物体进行免疫。14天后，腹膜内施用10μg ON-KLH对小鼠加强免疫。在加强免疫时，小鼠静脉内接受300μg可溶性CD21(sCD21；Hebell等人(1991)科学(Science)254102)并腹膜内接受300μg的sCD21。对照小鼠接受PBS。随后的3天，小鼠每天静脉内接受300μg的sCD21或PBS。
在加强免疫后7天将小鼠取血并利用偶联至牛血清白蛋白的ON通过ELISA测量血清中对ON特异的IgG水平。通过与标准的免疫小鼠血清库比较以适宜单位确定针对ON的抗体浓度。如表1和图1所示，利用sCD21处理显著减少抗ON的IgG水平(p＝0.02，Mann-Whitney U检验)。
表1致敏后(u/ml，前)和加强免疫加利用PBS或sCD21处理后7天(u/ml，后)小鼠中抗-ON的IgG水平。

与PBS处理组相比，sCD21处理组中抗体平均水平下降64％。
实施例2 使用抗-CD21抗体降低抗-dsDNA抗体的水平利用模式T细胞依赖型抗原致敏BALB/c小鼠，上述模式T细胞依赖型抗原为以3.8摩尔寡核苷酸/摩尔KLH的比例偶联至由(CA)10-(TG)10组成的20-mer双链寡核苷酸上的匙孔血蓝蛋白(KLH)(ON-KLH)。
将小鼠取血并随后腹膜内施用50μg 明矾沉淀的ON-KLH连同作为另外佐剂的2×109个处死的B.Pertussis生物体进行免疫。10周后，将小鼠取血并利用PBS或者200μg大鼠单克隆抗体7G6静脉内处理。大鼠单克隆抗体7G6(IgG2b抗-小鼠CD21抗体)描述在Kinoshita等人(1988)免疫学杂志(J.Immunol.)1403066中。24小时后，腹膜内施用10μgON-KLH对小鼠加强免疫。ON特异性IgG抗体的测量在加强免疫后14天利用针对ON的ELISA进行。在这一实验中，在加强免疫前小鼠具有显著的IgG抗-ON抗体水平，因此处理效果通过比较加强前后IgG抗-ON抗体比例确定。利用单克隆抗体处理显著减少IgG抗-ON抗体水平(p＝0.03，Mann-Whitney U检验)。数据显示在表2并在图2中绘出。

与PBS处理组相比，抗体处理组中后/前抗体水平比率下降45％。实施例3A使用抗-CD21抗体降低狼疮自发模型中抗-dsDNA抗体的水平NZB/WF1(H-2d/z)小鼠株系提供了研究控制狼疮自身免疫发作的复杂机制的自身免疫模型。该动物为NZB/B1NJ雌性和NZW/LacJ雄性小鼠的F1杂交后代，并且它们获得自Jackson实验室(Bar Harbor，Maine)。该小鼠发展出一种未知来源的慢性炎性疾病，其可以被遗传因子强烈的影响。自身免疫反映在高水平的循环抗-核抗体(包括抗双链DNA抗体)；针对RNA-蛋白质复合体(例如RNP和Sm)、ssDNA、组蛋白、染色质、红细胞和心磷脂的自身抗体；免疫复合体形成并在肾中沉积导致蛋白尿；以及进行性肾小球性肾炎。
由于雌性小鼠比雄性小鼠具有高得多的疾病发生率和严重性，因此本研究利用雌性动物进行(对雌性而言平均生命期为约35周，而雄性为约1年，根据Jackson实验室)。
每一研究由处于疾病不同阶段的动物组组成(详见下述)，并包括(1)未接受处理(盐水)的对照组，(2)接受同种型对照抗体的对照组，和(3)接受测试药剂(单独或彼此联合)的测试组。
在4至6月龄之间时，根据蛋白尿监测确定的疾病阶段将小鼠分为4个研究组。这些疾病阶段如下所述·疾病发作前＝无·1+＜30mg/dl(轻微)·2+＜100mg/dl(严重)·3+＞100mg/dl(后期)利用大鼠IgG2b抗-小鼠CD21抗体(7G6)或者大鼠IgG2b同种型对照(Kinoshita等人(1990)Int.Immunol.2651-659)处理动物。或者，使用可溶性CD21-Ig融合蛋白质或者小鼠IgG1对照(Hebell，T.等人(1991)科学(Science)254102-105)。环磷酰胺也用于一般的免疫抑制并测试与这些抗体的协同作用。
每一组(每组最少10只小鼠)中，小鼠利用下述方案之一处理1.通过尾静脉每周2次(第3和第7天)施用抗-CD21 500μg。
2.通过尾静脉每周2次(第3和第7天)施用CD21-Ig 500μg。
3.每周(第7天)腹膜内施用环磷酰胺1mg。
4.通过尾静脉每周2次(第3和第7天)施用大鼠IgG2b 500μg。
5.通过尾静脉每周2次(第3和第7天)施用小鼠IgG1 500ug。
6.通过尾静脉每周2次(第3和第7天)施用盐水。
7.联合1和3。
8.联合2和3。
经处理后，每周对小鼠取血用于确定抗-dsDNA和抗-β2 GPI抗体效价以及针对RNA-蛋白质复合体(例如RNP和Sm)、ssDNA、组蛋白、染色质、红细胞和心磷脂的自身抗体的效价。此外每周评估蛋白尿的水平以监测自身免疫病的进展。
可以使用几种测定方法确定自身免疫病的发作或进展。以下为所使用的测定法1)抗-dsDNA ELISA。动物血清中抗-双链DNA抗体的效价利用固相ELISA确定。
2)抗-RNP、抗-Sm、抗-ssDNA、抗-组蛋白、抗-染色质、抗-红细胞和抗-心磷质抗体的效价利用ELISA确定。
3)肾病。蛋白尿通过利用商业化的量杆(Ames Uristix；BayerDiagnostics，目录号2184，Tarrytown，NY)测量。
4)抗-β2糖蛋白I(β2GPI)ELISA。针对β2GPI的抗体的效价利用固相ELISA确定。
5)存活。监测实验动物的存活率。
实施例3B 利用抗-CD21抗体的动物研究在18周龄时对60只雌性(NZB)×(NZW)F1小鼠取血，并且利用标准ELISA测定法测量针对双链(ds)DNA的血清抗体效价，所述测定使用鲑鱼精子DNA(Calbiochem，San Diego，CA)作为底物。将小鼠随机分成4组，每组13到15只，由此每一组包含具有类似血清抗-DNA抗体水平的小鼠。随后使动物开始接受下述4种处理方案之一A)无处理B)每周以40mg/kg的剂量单次腹膜内注射施用溶于无菌磷酸缓冲盐水中的环磷酰胺(第3天)。
C)每周单次腹膜内注射施用溶于无菌磷酸缓冲盐水中的250μg大鼠IgG2b κ抗-小鼠CD21 mAb 7G6(第7天)。
D)腹膜内注射上述剂量的环磷酰胺(第3天)和7G6(第7天)。
处理仅仅在18到36周龄之间进行。在这期间，对小鼠每2周分析一次来确定体重、蛋白尿水平、血细胞比容和血清抗-dsDNA抗体浓度。另外，每天监测动物的痛苦迹象并对垂死的动物实施安乐死。
每一处理对存活的影响显示在Kaplan-Meier曲线中(图4)。与未处理相比，单独注射抗-CD21 mAb并不延长存活，而单独注射免疫抑制剂环磷酰胺却能延长。在同时接受环磷酰胺和mAb 7G6的动物组中观察到对延长存活最显著的影响。
与对照小鼠(未处理)或者单独利用环磷酰胺处理的小鼠相比，抗-CD21(7G6)处理对总抗-dsDNA抗体浓度无影响(无论是单独施用还是与环磷酰胺联合施用)。
实施例4 利用单克隆抗-CD21抗体7G6对α1，3-半乳糖基转移酶敲除小鼠中gal α1-3gal的抗体的抑制α1，3-半乳糖基转移酶敲除小鼠(Thall等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1995)27021437-21440)(GalT KO)不能合成Gal α1-3 Gal双糖(双半乳糖)，并且这与人、猿、旧大陆猴相似，因为它们自发形成识别末端Gal α1-3 Gal表位的抗体。人中的天然抗Gal α1-3 Gal抗体是异种移植的明显的障碍，其引起超急性异种移植排斥。因此，GalT KO小鼠模型是测试用于减少天然抗Gal α1-3 Gal抗体的潜在方法的一个非常有用的系统(Yang等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)(1998)1871335-1342)。
本实验的目的是确定利用CD21特异性单克隆抗体7G6处理GalT KO小鼠能否阻止响应兔红细胞(Gal α1-3 Gal二糖的来源)免疫引起的抗Gal α1-3 Gal抗体诱导。
GalT KO小鼠获得自John Lowe(密歇根大学)。利用600μg溶于磷酸缓冲盐水(PBS)的7G6或者单纯PBS腹膜内施用处理小鼠(11周龄，每组10只)。一天后利用1×109兔红细胞腹膜内施用免疫这些小鼠。8天后对这些动物取血并利用ELISA测定血清样品中的抗-双半乳糖抗体。利用溶于磷酸缓冲盐水(PBS)的5μg/ml共100μl/孔双半乳糖牛血清白蛋白(BSA-双半乳糖)4℃过夜包被免疫测定滴定板(Costar#3590)。利用PBS洗涤滴定板并利用250μl/孔溶于PBS的5％脱脂奶粉4℃过夜封闭剩余的蛋白质结合位点。将血清样品在含有0.5％BSA的Hanks平衡盐溶液(HBSS)(HBSA)中稀释。封闭的滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗涤并加入50μl的血清样品稀释物。将滴定板在室温下孵育1小时。滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗涤。加入碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG或IgM(Jackson#115-055-146或者115-055-075，利用HBSA稀释1000倍)(100μl/孔)并将滴定板在室温下孵育1小时。滴定板利用PBS-0.1％Tween 20洗涤。加入酚酞单磷酸(在蒸馏水中1∶26稀释，100μl每孔)并将滴定板在室温下孵育。10和30分钟孵育后在PowerWave340微量滴定板分光光度计上读出550nm的光密度。
通过与标准曲线比较以适宜单位/ml确定抗-双半乳糖抗体的血清水平，所述标准曲线利用取自兔红细胞免疫的GalT KO小鼠的血清库生成。
血清抗双半乳糖抗体水平利用Statview通过Students t检验来分析。与安慰剂处理的动物相比较，7G6处理的动物中IgM和IgG抗-双半乳糖抗体显著减少(IgM，p＝0.0085，IgG，p＝0.0146，Mann-Whitney U检验)。利用7G6的处理阻断了由RRBC免疫刺激的抗-双半乳糖抗体增加。这些实验的结果总结在表3和图3中。
表3对照和抗-CD21处理小鼠中抗-双半乳糖IgM和IgG水平

与PBS处理组相比，抗体处理组中IgM抗双半乳糖抗体水平降低65％。与PBS处理组相比，抗体处理组中IgG抗半乳糖抗体水平降低69％。
实施例5 在自身免疫性甲状腺炎自发模型中抗-CD21抗体的使用NOD.H-2h4株系小鼠从饮用水中接受碘化钠后发展出自发自身免疫性甲状腺炎。自身免疫性甲状腺炎的发展伴随着针对小鼠甲状腺球蛋白的抗体水平的增加(Braley-Mullen，H.和Yu，S.(2000)免疫学杂志(J.Immunol.)1657265-7269)。
通过在饮用水中引入碘化钠诱发动物出现甲状腺炎并随后利用7G6大鼠IgG2b抗-小鼠CD21抗体或者大鼠IgG2b同种型对照(Kinoshita等人，1990，Int.Immunol.，2651-659)处理。
处理方案每一研究由如下的动物组组成(a)未接受处理(盐水)的对照组。
(b)接受同种型对照抗体的对照组。
(c)接受7G6抗-CD21的测试组。
在8周龄时，小鼠在它们的饮用水中接受0.05％碘化钠以诱发甲状腺炎。在最初的实验中，小鼠的处理从8周龄开始(即在疾病发作之前)。处理方案如下所详述。在16周龄时收集血液样品并对甲状腺球蛋白抗体进行测定。在向饮用水中引入碘化钠后8周，将小鼠处死并收集甲状腺组织用于组织学评价。NOD.H-2h4小鼠的甲状腺损伤在饮用水中引入碘化钠后7-9周最为严重。
在随后的实验中，对小鼠的处理在16周龄以后进行，即在疾病发作之后。利用下述的方案对小鼠处理4周。随后收集血液样品以确定抗甲状腺球蛋白抗体的水平。将小鼠处死并收集甲状腺组织用于组织学评价。
对每一组而言，利用下述方案之一处理小鼠1.通过尾静脉每周2次(第3和第7天)施用抗-CD21抗体500μg。
2.通过尾静脉每周2次(第3和第7天)施用大鼠IgG2b抗体500μg。
3.通过尾静脉每周2次(第3和第7天)施用盐水。
每组评价最少10只小鼠。下述测定用于跟踪甲状腺炎的发展1.抗甲状腺球蛋白ELISA。动物血清中抗甲状腺球蛋白抗体的效价利用固相ELISA确定。
2.甲状腺病理由组织学确定。对甲状腺滤泡的损伤通过测量单核细胞渗浸润程度来定量。
实施例6 单克隆抗体2B12的生成利用10μg溶于Immuneasy佐剂(Qiagen，Valencia，CA)的可溶性人CD21(结构域1-2)-Ig融合蛋白质(Hebell，T等人(1991)科学(Science)254102-105)肌内(i.m.)致敏Balb/cJ雌性小鼠。两周之后，利用同一抗原和佐剂的混合物加强免疫该小鼠。6周后，利用溶于无菌PBS的50μgsCD21(1-2)-Ig静脉内(i.v.)加强免疫该小鼠。3天后将小鼠处死并通过标准方法将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合。经2周的选择后，首先利用sCD21(1-2)-Ig通过直接ELISA筛选杂交瘤的上清，并且随后利用实施例7-11描述的方法筛选。
实施例7mAb 2B12对CD21/C3d相互作用的破坏BSA-或C3d-微球体的包被将1μm羧酸酯修饰的荧光微球体(#F8823，Molecular Probes，Eugene，OR)的悬液(体积相当于约1.5×1010个微球体)利用5000×g离心沉淀5分钟，并在1ml 50mM MES，pH7.0(2-[N-吗啉代]乙磺酸)中洗涤一次，并在0.5ml 50mM MES中重悬。向此悬液中加入各2mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl，Pierce#22980)和磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺，Pierce#24510)，并随后将样品在室温下暗处旋转20分钟。将活化的微球体悬液在5000×g离心5分钟并在1ml 50mM MES，pH7.0中洗涤3次。随后将1体积的活化微球体悬液加至2倍体积的溶于PBS的1mg/ml C3d或者BSA蛋白中，并在室温下暗处旋转2小时。再将微球体离心并在50mM MES，pH7.0中洗涤3次。C3d-或者BSA包被的微球体最终以4×109/ml重悬于含有1％BSA和0.01％NaN3的50mM HEPES，pH7.4中，并贮存于4℃。
Raji细胞-C3d微球体结合测定将CD21+人Burkitt氏淋巴瘤细胞系Raji(ATCC#CCL86)细胞从培养中收获并在PFN(含有1％(V/V)胎牛血清(FBSGibco BRL，Gaithersburg，MD)和0.01％(V/V)的叠氮化钠的PBS，以防止CD21的表面调节)中洗涤。将细胞在PFN中以106/ml重悬并以200μl/样品小份加入至FACS管中。在50μL PFN中加入小鼠抗人CD21 mAb 2B12(在预实验中确定为30-50ng)。对照管不合抗体或者含有30-50ng的小鼠抗-人CD21 mAb HB5(BD Pharmingen，La Jolla，CA)，该mAb识别CD21的3-4结构域上的表位，并对C3d结合具有极小的影响。将小管在4℃下孵育15分钟。随后将BSA-或者C3d-包被的1μm荧光微球体加至细胞中，终比例为每个Raji细胞25、50或者100个微球体。加入的微球体的总体积为20μL。将小管短暂涡旋并在室温下孵育20分钟。加入PFN至终体积500μL，并随后将样品涡旋并在室温下在FACSC Calibur流式细胞仪上分析。Raji-微球体偶联物在FL3中鉴定为一系列峰，这些峰代表与不同数目的微球体结合的细胞。为定量分析结果，在直方图中设定标志由此将第一个峰从分析中排除。
下表显示的典型数据为在mAb 2B12存在或者不存在时，以不同微球体细胞比率，与C3d-或者BSA-包被的小珠结合的Raji细胞的百分数。
可以看出mAb 2B12的加入完全抑制了对Raji细胞的C3d特异性结合。利用mAb HB5观察到很小程度的抑制作用，尤其在较低的微球体细胞比率时。

*结合细胞％为标志M1内的细胞％。
**抑制作用％＝100×[(无Ab时M1内的细胞％)-(Ab存在时M1内的细胞％)/无Ab时M1内的细胞％]实施例8 利用直接ELISA检测2812对可溶性重组人CD21蛋白质结构域的结合用5μg/ml的重组可溶性CD21(1-2)-Ig融合蛋白质(Hebell，同上引文)或重组可溶性CD21(1-4)-his 4℃过夜包被微量滴定板孔。
重组可溶性CD21(1-4)-his按照下述制备利用标准方法，从人脾总RNA(Clontech，Palo Alto，CA)中通过PCR扩增含有cDNA的片断，所述cDNA编码人CD21的信号肽和氨基末端前四个蛋白质结构域。扩增引物为5’CGCGAGCTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAATTTCTTCACA-3’(反向)(SEQ ID NO1)和5’-GATCTTATAAATATGGGCGCCGCGGGCCTG-3’(正向)(SEQ ID NO2)。反向引物编码(His)6纯化标签并跟着终止密码子和Sac I限制性位点。正向引物编码Bgl II限制性位点。将扩增片断按照生产厂家说明书(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆至pCR2.1-TOPO质粒中。克隆片断(SEQ ID NO3)的核酸序列通过利用Retrogen引物延伸测序服务(San Diego，CA)确证。CD21编码序列以小写字母表示；扩增引物序列以大写字母表示；Bgl II和Sac I限制性位点以下划线标出。
5’-AGATCTTATAAATatgggcg ccgcgggcct gctcgqggtt ttcttggctc tcgtcgcacc gggggtcctcgggatttctt gtggctctcc tccgcctatc ctaaatggcc ggattagtta ttattctacc cccattgctg ttggtaccgtgataaggtac agttgttcag gtaccttccg cctcattgga gaaaaaagtc tattatgcat aactaaagac aaagtggatggaacctggga taaacctgct cctaaatgtg aatatttcaa taaatattct tcttgccctg agcccatagt accaggaggatacaaaatta gaggctctac accctacaga catggtgatt ctgtgacatt tgcctgtaaa accaacttct ccatgaacggaaacaagtct gtttggtgtc aagcaaataa tatgtggggg ccgacacgac taccaacctg tgtaagtgtt ttccctctcgagtgtccagc acttcctatg atccacaatg gacatcacac aagtgagaat gttggctcca ttgctccagg attgtctgtgacttacagct gtgaatctgg ttacttgctt gttggagaaa agatcattaa ctgtttgtct tcgggaaaat ggagtgctgtcccccccaca tgtgaagagg cacgctgtaa atctctagga cgatttccca atgggaaggt aaaggagcct ccaattctccgggttggtgt aactgcaaac tttttctgtg atgaagggta tcgactgcaa ggcccacctt ctagtcggtg tgtaattgctggacagggag ttgcttggaccaaaatgcca gtatgtgaag aaattCACCA CCACCACCAC CACTAAGAGC TC-3’(SEQ IDNO3)克隆的核酸序列(SEQ ID NO4)含有编码CD21序列的开放阅读框，见下述。推定的信号肽和(His)6纯化标签以下划线标出。
MGAAGLLGVFLALVAPGVLGISCGSPPPILNGRISYYSTPIAVGTVIRYSCSGTFRLIGEKSLLCITKDKVDGTWDKPAPKCEYFNKYSSCPEPIVPGGYKIRGSTPYRHGDSVTFACKTNFSMNGNXSVWCQANNMWGPTRLPTCVSVFPLECPALPMIHNGHHTSENVGSLAPGLSVTYSCESYLVGEKIINCLSSGKWSAVPPTCEEARCKSLGRFPNGKVKEPPILRVGVTANFFCDEGYRLQGPPSSRCVLAGQGVAWTKMPVCEEIHHHHHH(SEQ ID NO4)利用Bgl II和Sac I限制性内切酶将SEQ ID NO3中的限制性片断从pC R2.1-TOPO上释放，并利用标准技术将其亚克隆至表达载体pBacPAK8(Clontech，Palo Alto，CA)中，pBacPAK8已经利用相同的限制性内切酶线性化。产生的表达载体上的CD21片断的核酸序列(CD21SCR1-4)通过利用Retrogen引物延伸测序服务(San Diego，CA)确认。
按照生产厂家的说明书，利用BaculoPlatinumTM共转染载体(Orbigen，San Diego，CA)将CD21SCR1-4转染至Sf9昆虫细胞中。收集病毒颗粒并按照标准方法利用Sf9细胞的再感染产生高滴度的原种。重组蛋白质SCD21(1-4)-组氨酸通过用高滴度病毒感染TN5昆虫细胞，并孵育约50小时而产生。重组sCD21(1-4)-his蛋白质按照生产厂家的说明书利用在Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN，Valencia，CA)上的镍螯合层析收集。进一步的细节见于Prodinger WM等人，Immunopharmacology(1997)39141-8。
相应的对照为用小鼠IgGλ(Ig融合部分的同种型)或者用其它含组氨酸标签的重组蛋白质包被的孔。在将孔用1％BSA/PBS溶液封闭1小时后，将孔洗涤，随后加入测试抗体(两个重复)并将滴定板在室温下孵育1小时。将滴定板洗涤并向孔中加入第二山羊抗-小鼠Igκ-碱性磷酸酶抗体，室温下30分钟。将滴定板洗涤并加入酚酞单磷酸底物(PPMP)显色。
典型的OD结果为
sCD21包被孔 MoIg包被孔正常小鼠血清1∶2500 0.055 0.061OKB7(小鼠抗-人CD21)1∶2500 0.44 0.0962B12培养物上清 0.65 0.045对照培养基 0.041 0.041实施例9 通过细胞ELISA检测2B12对Raji细胞的结合将Raji细胞在HFN(含有1％v/v FBS和0.05％ w/v NaN3的Hanks平衡盐溶液(HBSS))中洗涤一次并等分加入微量滴定板的孔中。所有步骤均在4℃下进行。将微量滴定板离心并移去上清。向孔中加入测试抗体，将微量滴定板振荡并孵育30分钟。随后通过4个循环的加入HFN然后离心并移去上清洗涤来洗涤细胞。加入HFN中的第二碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，将微量滴定板振荡并孵育30分钟。将细胞如上所述再次洗涤。加入PPMP底物溶液并孵育30分钟，之后将微量滴定板在550nm读数确定OD。
典型的OD结果为加入OD 550nm对照培养物上清0.0922B12上清 2.451小鼠IgG 0.072抗-人CD21 mAb BE-50.546抗-人CD21 mAb Bly-4 1.171实施例10 通过流式细胞术检测2B12对Raji细胞的结合将Raji细胞在冷的PFN(含有1％FBS和O.1％NaN3的PBS)中洗涤并以2×105/样品分成小份加入FACS小管。将测试样品加至细胞(例如杂交瘤上清，纯化的mAb)，混和并在4℃下孵育20分钟。将细胞在PFN中洗涤并加入第二荧光素偶联Ab(例如山羊抗小鼠IgG(H+L)-FITC，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。将细胞再次在4℃下孵育20分钟并随后洗涤。通过加入碘化丙锭至终浓度为PFN中的2μg/ml从流式细胞分析中排除死细胞。随后在FACSCCalibur上分析细胞，并利用MFI测量染色的强度。典型的结果显示如下条件 平均荧光指数(MFI)单独的Raji 5+对照培养基4+2B12培养物上清165+OKB7*123+BE-5**85+HB5***117*OKB7来自Ortho Diagnostics(Raritan，NJ)**BE-5来自BioSource International(Camarillo，CA)***HB5来自BD Pharmingen(La Jolla，CA)实施例11 2B12对Raji细胞CD21的免疫沉淀将人B类淋巴母细胞系Raji细胞进行表面生物素化并溶于含有去污剂的缓冲液中。将细胞裂解物与来自骨髓瘤细胞系SP2/0(阴性对照)，或来自杂交瘤HB5(小鼠抗人CD21结构域3-4)，或来自测试杂交瘤2B12的培养上清一起孵育。随后，将裂解物与兔抗小鼠多克隆抗体孵育，接着与含有杀死的金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)生物体的蛋白质-A(PansorbinTM)孵育，由此收集免疫复合体。从这些初级免疫沉淀得到的沉淀物通过SDS-PAGE分离并转膜，利用过氧化物酶偶联的链亲合素显象并随后通过化学发光法显示。
为证明已知的抗-CD21 mAb和测试2B12抗体识别相同的分子，将每一来自初级免疫沉淀的上清分成3部分，并利用相同的抗体进行第二轮的免疫沉淀。
本实验的结果毫无疑义地证明，mAb 2B12与mAb HB5识别同一分子。首先，它们都直接免疫沉淀相同大小约140kD的分子。其次，利用mAb HB5去除了CD21的上清也去除了被mAb 2B12识别的分子。相反地，去除了被2B12识别的分子的上清也去除了被HB5免疫沉淀的CD21。因此，mAb HB5和2B12都免疫沉淀来自Raji细胞的CD21。
尽管为清楚和易于理解起见，前述发明已经通过说明和实例被详细地描述，但对本领域技术人员显而易见的是，可以进行某些改变和修饰。因此，本描述和实例不应理解为限制本发明的范围，所述本发明范围通过附加的权利要求描绘。
权利要求
1.治疗患有抗体介导的病变的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的干扰C3d结合至CD21的药剂，由此改善此抗体介导的病变的症状。
2.根据权利要求1所述的方法，其中抗体介导的病变为自身免疫病。
3.根据权利要求2所述的方法，其中自身免疫病为系统性红斑狼疮。
4.根据权利要求1所述的方法，其中抗体介导的病变为异种移植排斥。
5.根据权利要求1所述的方法，其中抗体介导的病变为甲状腺炎。
6.根据权利要求1所述的方法，其中药剂为特异性结合至CD21的与C3d结合的区域的抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述区域包含短共有区域1和短共有区域2。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述区域包含短共有区域1或者它的一部分。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述区域包含短共有区域2或者它的一部分。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂为抗体。
11.延缓个体中与抗体介导的病变相关的症状发展的方法，其包括向所述个体施用有效量的干扰C3d结合至CD21的药剂，由此延缓抗体介导的病变的症状发展。
12.根据权利要求11所述的方法，其中抗体介导的病变为自身免疫病。
13.根据权利要求12所述的方法，其中自身免疫病为系统性红斑狼疮。
14.根据权利要求11所述的方法，其中抗体介导的病变为异种移植排斥。
15.根据权利要求11所述的方法，其中抗体介导的病变为甲状腺炎。
16.根据权利要求11所述的方法，其中药剂为特异性结合至CD21的与C3d结合的区域的抗体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述区域包含短共有区域1和短共有区域2。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述区域包含短共有区域1或者它的一部分。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述区域包含短共有区域2或者它的一部分。
20.根据权利要求11所述的方法，其中所述药剂为抗体。
全文摘要
本发明提供利用抑制CD21/C3d相互作用的药剂改善抗体介导的病变的一种或多种症状而治疗抗体介导的病变，诸如自身免疫病(例如SLE、ITP和甲状腺炎)的方法。本发明也提供利用抑制CD21/C3d相互作用的药剂延缓抗体介导的病变发展的方法。
文档编号A61P37/06GK1511041SQ02810098
公开日2004年7月7日 申请日期2002年5月17日 优先权日2001年5月17日
发明者M·D·林尼克, M－A·坎贝尔, M D 林尼克, 脖炊 申请人:拉乔拉制药公司