学习记忆的增强及遗忘症的治疗的制作方法

专利名称：学习记忆的增强及遗忘症的治疗的制作方法
相关申请本申请要求于2001年9月14日申请的美国临时申请第60/322,389号的优先权。
背景长时程增强(LTP)是突触可塑性的一种长期持久形式，其有助于某些类型的学习记忆。例如参见，Bliss & Collingridge(1993)Nature 36131-39。在海马CA1区中，LTP的诱导与Ca2+进入由N-甲基-D-天冬氨酸受体活动触发的突触后神经元有关。例如参见，Tsien et al.(1996)Cell871327-1338。由于N-甲基-D-天冬氨酸受体与广范围的中枢神经系统疾患有关，所以对它的研究特别令人感兴趣。例如参见，Foster et al.(1987)Nature 329395-396；及Mayer et al.(1990)Trends in Pharmacol.Sci.11254-260。
一氧化氮是一种扩散性分子，其可作为大脑中一种新型的细胞间信使，也可在LTP过程中作为逆行信使。例如参见，Son et al.(1996)Cell871015-1023；及Wilson et al.(1997)Nature 386338。一氧化氮合酶是产生一氧化氮的酶，它的抑制剂可防止LTP的诱导。一氧化氮的下游效应器之一是cGMP，其也与LTP的诱导有关。cGMP是由可溶性鸟苷酸环化酶产生的。可溶性鸟苷酸环化酶的抑制剂可抑制LTP。例如参见，Zhuo etal.(1994)Nature 368635-639；及Boulton et al.(1995)Neuroscience69699-703。此外，cGMP可控制许多蛋白的活性，包括依赖cGMP的蛋白激酶G，其对LTP的诱导起作用。蛋白激酶G的抑制剂可阻断LTP的诱导，蛋白激酶G的活化剂可促进响应较弱强直刺激的LTP诱导。例如参见，Zhuo et al.(1994)Nature 368635-639；Zhuo et al.(1994)Nature 368635-639。综上所述，包括一氧化氮、cGMP和蛋白激酶G的信号通路与LTP的诱导相关。可调节信号通路的化合物的识别能够对学习记忆的增强提供有用的新治疗方法。
概述一方面，本发明提供一种增强学习记忆的方法。该方法包括对需要的受治疗者使用如下通式(I)所示的稠环吡唑基化合物(fused pyrazolylcompound) A是H、R或 (下文中称为“(CH2)nAr3(R5)(R6)”)；Ar1、Ar2和Ar3中的每一个独立地是苯基、噻吩基、呋喃基或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地是H、硝基、卤素、R、OH、OR、C(O)OH、C(O)OR、C(O)SH、C(O)SR、C(O)NH2、C(O)NHR、C(O)NRR’、ROH、ROR’、RSH、RSR’、ROC(O)R’OH、NHR、NRR’、RNHR’或RNR’R”；或者R1和R2同时、R3和R4同时或R5和R6同时是ORO。R、R’和R”中的每一个独立地是C1～C6烷基；及n是1、2或3。为增强学习记忆该化合物以有效量存在。
通式(1)包括吡唑基中心和至少两个芳基，即Ar1和Ar2。通式(I)化合物的一个子集的特征在于A是(CH2)nAr3(R5)(R6)。例如Ar1是苯基，R1和R2分别取代在苯基的4位和5位。Ar2可以是5’-呋喃基，R3和R4中的一个取代在5’-呋喃基的2位，例如1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-吲唑(化合物1)。Ar2也可以是苯基，R3和R4中的一个取代在苯基的4位，例如1-(3-氯-苄基)-3-(4’-甲苯基)-吲唑(化合物9)或1-(4-硝基-苄基)-3-(4’-甲苯基)-吲唑(化合物10)。在某些实施方案中，Ar3是苯基，n是1。
通式(I)化合物的另一个子集的特征在于A是H。例如Ar1是苯基，R1和R2分别取代在苯基的4位和5位。在另一个实施例中，Ar2是5’-呋喃基，R3和R4中的一个取代在5’-呋喃基的2位。
本文所用的术语“芳基”包括苯基、噻吩基、呋喃基或吡咯基，其中的每一个可选择地包括一个或多个取代部分。取代部分可以与R1、R2、R3、R4、R5或R6相同或不同。它们可以是卤素、氨基、羟基、巯基、氰基、硝基、C1～C6烷基、C1～C6烯基、C1～C6烷氧基、芳基、杂芳基、或杂环基，其中烷基、烯基、烷氧基、芳基、杂芳基及杂环基可选择地可被C1～C6烷基、卤素、氨基、羟基、巯基、氰基或硝基取代。术语“烷基”既指直链烷基也指支链烷基。
下面列出的是稠环吡唑基化合物的一些具体实例，其可用来实施本发明的方法化合物1 化合物2
化合物3 化合物4 化合物5 化合物6
化合物7 化合物8 化合物9 化合物10
化合物11 化合物12 化合物13 化合物14
化合物15 化合物16 化合物17 化合物18
如上所述的稠环吡唑基化合物包括化合物本身，及需要时包括其盐和其前体。这种盐例如可通过稠环吡唑基化合物上带负电荷的取代基(例如羧酸根离子)和阳离子间的相互作用而形成。适合的阳离子包括但不限于钠离子、钾离子、镁离子和铵阳离子，如四甲基铵离子。同样，带正电荷取代基(例如氨基)可与电相反电荷的离子形成盐。适合的相反电荷离子包括但不限于氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根离子、硝酸根离子、磷酸根离子或醋酸根离子。前体的例子包括酯和其它药学上可接受的衍生物，经过对受治疗者使用其能够提供如上所述的稠环吡唑基化合物。
本发明也提供一种治疗遗忘症的方法。该方法包括对需要的受治疗者使用有效量的一种或多种如上所述的稠环吡唑基化合物。在本文中遗忘症指记忆缺失，其可起因于神经心理性疾患。“神经心理性疾患”的例子包括但不限于认知、学习及记忆不足，源于神经退化的疾患(例如亨丁顿氏症(Huntington’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)或阿滋海默氏症(Alzheimer’s disease))，情感性疾患(例如双极性疾患、精神抑郁症或季节性感情障碍)，及抑郁症。
另一方面，本发明提供一种包装产品。该包装产品包括容器、在该容器内的一种或多种稠环吡唑基化合物、及与该容器相关并表明用以增强学习记忆或治疗遗忘症的吡唑基化合物使用的说明(例如标签或插入物)。
上述化合物在制备用于增强学习记忆或治疗遗忘症的药物中的用途也在本发明的范围内。
从说明书中和权利要求书中可更清楚本发明的其它特征、目的及优点。
详细说明用于实施本发明方法的稠环吡唑基化合物可通过本领域所属技术人员公知的方法制备(例如参见美国专利第5,574,168号)。这些方法包括下面的合成路线首先通过将芳酰氯与另一种芳基化合物接合而制备芳基芳基酮。每种芳基化合物可选择地可被单取代或多取代。然后，酮与芳基烷基肼反应以形成含有三个芳基的腙，芳基烷基肼的芳基可选择地可被单取代或多取代。腙基通过烯化连接转化成稠环吡唑基中心，另一个芳基在吡唑基中心的4-C和5-C处稠合，第三个芳基直接与吡唑基中心的3-C相连接。通过改变任一个芳基的取代基可得到稠环吡唑基化合物的衍生物。
上述合成路线中所用的化学物质例如可以包括溶剂、反应物、催化剂、保护基试剂及脱保护基试剂。为最终能够合成稠环吡唑基化合物，上述的方法还可在此处明确说明的步骤之前或之后包括其它步骤用以加入或除去适合的保护基团。此外，各种合成步骤可按不同的顺序或次序进行以得到所需要的化合物。对于合成适用的稠环吡唑基化合物有效的合成化学转化及保护基方法(保护和脱保护)在本领域是公知的，例如在R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2d.Ed.，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser，Fieser andFieser’s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wileyand Sons(1995)及其后继版本。
这样合成的稠环吡唑基化合物可通过诸如柱色谱、高压液相色谱或重结晶等方法进一步纯化。
本发明一个方面是增强学习记忆或治疗源于神经心理性疾患的遗忘症的方法。该方法包括对需要的受治疗者使用有效量的一种或多种稠环吡唑基化合物及药学上可接受的载体。本文中所用的术语“记忆”指头脑储存意识过程并在后来以某种程度的真实度再现此过程的能力。作为一种心理过程，记忆包括保持力、再现及识别。记忆的理论模型包括知觉感应、短期记忆、工作记忆及长期记忆(包括语义记忆、程序记忆及事件记忆)。其它的概念化记忆包括听觉记忆、视觉记忆、动作记忆及识别记忆。术语“治疗”指对患有源于神经心理性疾患的遗忘症、有遗忘症的症状或者是具有易患遗忘症体质的受治疗者应用或使用含有稠环吡唑基化合物的组合物，用以治疗、治愈、缓和、减轻、改变、矫正、改善、改进或影响遗忘症、遗忘症的症状或者是易患遗忘症的体质。“有效量”是指对需要的受治疗者使用的稠环吡唑基化合物的量可对该受治疗者提供治疗作用。稠环吡唑基化合物的有效量可以是约0.01mg/kg～300mg/kg。本领域所属技术人员公知有效的剂量可以随使用的方案、所用的赋形剂及与其它用以增强学习记忆的药剂或其它用以治疗遗忘症的药剂一起使用的可能性而改变。
为实施本发明的方法，稠环吡唑基化合物可口服使用、肠胃外使用、吸入喷雾使用或通过灌输贮藏器使用。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、疾病部位及颅内注射或灌输技术。
用于口服使用的组合物可以是任何口服可接受的剂量形式，包括但不限于胶囊、片剂、乳状液及水性悬浮液、分散液和溶液。在口服片剂情况下，通常所用的载体包括乳糖及玉米淀粉。一般也可加入润滑剂如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服使用，有效的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服使用水性悬浮液或乳状液时，活性成分可以悬浮或溶解在与乳化剂或悬浮剂结合的油相中。如果需要，可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。根据药物制剂领域中公知的技术也可制备吸入组合物，也可制成盐溶液，并应用用以提高生物适用性的苄醇或其它适合的防腐剂、吸收促进剂，碳氟化合物和/或本领域公知的其它增溶剂或分散剂。
无菌注射组合物，例如无菌注射水性或油性悬浮液，可使用适合的分散剂或润湿剂(例如Tween 80)和悬浮剂并根据本领域公知的技术制成。无菌注射制剂也可以是在非毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂是甘露醇、水、Ringer’s溶液和等渗压氯化钠溶液。此外，常规用作溶剂或悬浮介质的是无菌固定油(例如合成的单或二甘油酯)。在注射剂的制备中可以使用诸如油酸等脂肪酸及其甘油酯衍生物，这是因为它们通常是药物可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或相似的分散剂。
药物组合物中的载体必须是“可接受的”，是指其可与制剂的活性成分相容(优选能够溶解它)并且对欲治疗的受治疗者无害。例如，增溶剂或者一种或多种增溶剂可用作传输稠环吡唑基化合物的药物赋形剂，其中如环糊精可与稠环吡唑基化合物形成特效更可溶的配合物。其它载体的例子包括胶体二氧化硅、硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠及D & C Yellow#10。
适当的体外分析可用来初步评估稠环吡唑基化合物提高长时程增强诱导的能力。通过本领域公知的后续过程也可进行体内筛选。参见下面具体的实施例。
尽管没有进一步详细说明，但可以认为上面的说明足以实现本发明。因此，下面的具体实施方案仅用于解释性的而不以任何方式限制本说明书的其余部分。本文中所引用的所有出版物以其全部内容引为参考。
1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-吲唑(化合物1)的合成首先通过在无水THF(20mL)中搅拌无水氯化钙(88.8mg，0.8mmole)和硼氢化钠(60mg，1.6mmole)4小时制备硼氢化钙。然后在30±2℃下将含有88.0mg 1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-吲唑(0.27mmole)的30mL THF溶液滴加到硼氢化钙溶液中。混合物加热回流6小时，冷却，用碎冰猝灭反应，减压下除去THF，过滤得固体产品。固体用二氯甲烷萃取，萃取物浓缩到50mL，加入石油醚后沉淀出固体。收集沉淀，用柱色谱(硅胶-苯)纯化，得到70.0mg 1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-吲唑，产率87％。
mp108-109℃MS(％)，m/z304(M+)IR(KBr)υmax3350cm-1(-OH)1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)，5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz，H-4’)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3’)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45(1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H，dd，J＝8.2，1.0Hz，C4-H)。
电生理学测试斩首后快速摘除成年(150-250mg，用于长时程增强的诱导)或年轻(2-3周龄，用于长过程抑郁的诱导)Wistar大鼠的大脑，并解剖出海马。横向海马切片(450μm厚)立即置于冰冷碎块缓冲液中，缓冲液中含有124mM NaCl，3mM KCl，1.0mM Na2HPO4，25mM NaHCO3，0.5mM CaCl2，5.0mM MgSO4，10mM葡萄糖，并用95％ O2和5％CO2饱和。然后切片在室温下保持在界面室中，并以1-2mL/min的流速用人工脑脊液(ACSF)灌流。ACSF组合物含有124mM NaCl，4.4mM KCl，1.0mM Na2HPO4，25mM NaHCO3，2.0mM或2.5mM CaCl2，1.0mM MgSO4，10mM葡萄糖，并充入95％O2和5％CO2。通过置于Schaffer侧枝/连合处通路上的双极刺激电极产生的测试脉冲激发场兴奋性突触后电位(fePSP)，并使用装有2M NaCl的玻璃微电极(5-10MΩ)从CA1的放射状层开始记录。测试脉冲持续时间为100μsec，在0.02Hz时得出测试响应。为在皮质扁桃体通路中记录场电位，刺激电极放置在外包中，其包含从听皮层到侧扁桃体的纤维。当记录扁桃体的fEPSP时，在灌流溶液中含有荷包牡丹碱(10μM)。为提高通过灌流系统应用的稠环吡唑基化合物的效力，记录室中的ACSF水平需足够高以覆盖海马切片但不使它们漂浮。所有的稠环吡唑基化合物在ACSF中灌流。
记录激发的fEPSP，并分析数据。计算fEPSP的初始斜率，数据表示成fEPSP基线斜率的平均百分比。
由化合物1增强的长时程增强(LTP)LTP是最主要的学习记忆神经心理模型。在大鼠海马切片的Schaffer侧枝-CA1通路中的LTP由较强的强直刺激诱导，其由2串频率为100Hz、串长为1秒、间隔为20秒的串组成。较强的强直刺激可诱导LTP，强直刺激后50分钟时fEPSP的斜率为163.4±7.0％(n＝6)。通过用化合物1(1.6μM)灌流6分钟(强直刺激之前3分钟和强直刺激之后3分钟)LTP明显增强。强直刺激后50分钟时fEPSP的斜率为404.7±34.9％(n＝5)。
较弱的强直刺激不能诱导LTP，其由频率为20Hz、串长为0.5秒的串组成。出乎意料的是，通过用化合物1(1.6μM)灌流6分钟(强直刺激之前3分钟和强直刺激之后3分钟)可诱导LTP。在1小时时fEPSP的斜率为172.9±10.7％(n＝7)。3个刺激串(100Hz，1秒，间隔3分钟)可诱导暂时的增强，这种增强在扁桃体中在30分钟内降低到基线。然而，同样的刺激串在化合物1(n＝4)的存在下可诱导持久的LTP，其可稳定地持续至少1小时。
化合物1对LTP增强的机理研究一氧化氮的作用。将化合物1和NG-硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME，从RBI购得)(300μM)同时灌流，后者是一氧化氮合酶抑制剂，由化合物1诱导的LTP明显减弱。另一方面，血红素加氧酶抑制剂锌原卟啉(1μM)没有影响由化合物1诱导的LTP。此结果表明一氧化氮而不是一氧化碳与由化合物1增强的LTP诱导有关。
化合物1与1H-[1，2，4]二唑[4，3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ，从TOCRIS购得)一起灌流，后者是可溶性鸟苷酸环化酶的特效抑制剂。没有ODQ时，较弱强直刺激(50Hz/0.5s)时化合物1可诱导LTP。有ODQ(5μM)时，化合物1不能诱导LTP。fEPSP的斜率为107.8±3.9％(n＝5)。此结果表明可溶性鸟苷酸环化酶与由化合物1增强的LTP诱导有关。
化合物1与KT5823(从Calbiochem购得)一起灌流，后者是蛋白激酶G的特效抑制剂。没有KT5823时，较弱强直刺激(50Hz/0.5s)时化合物1可诱导LTP。有KT5823(2μM)时，化合物1诱导的LTP受到抑制。fEPSP的斜率为112.9±5.4％(n＝4)。此结果表明一氧化氮-cGMP-蛋白激酶G-信号通路与由化合物1增强的LTP诱导有关。
化合物1还与2-氨基-5-膦酰基戊酸(phosphonopentanoic acid)(AP5，从RBI购得)一起灌流，后者是N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂。没有AP5时，较弱强直刺激(50Hz/0.5s)时化合物1可诱导LTP。有AP5(100μM)时，化合物1诱导的LTP延迟。fEPSP的斜率为142.1±13.5％(n＝5)。此结果表明从N-甲基-D-天冬氨酸受体流入的Ca2+与由化合物1增强的LTP诱导有关。
此外，化合物1与MCPG((±)-α-甲基-(4-羧苯基)甘氨酸；从Sigma/RBI购得)一起灌流，后者是代谢型受体。有MCPG(100μM)时，化合物1诱导的LTP下降。同时应用AP-5和MCGP可抑制化合物1诱导的LTP。fEPSP的斜率为111.5±12.3％(n＝3)。
当化合物1加到ACSF(1.6μM)中时2串较强的强直刺激(100Hz/1秒)10分钟后，化合物1没有进一步增强LTP，表明在高频刺激时一氧化氮被释放出，化合物1增强的LTP诱导仅在强直刺激后的几分钟内发生。
化合物1 对低频刺激(LFS)诱导的可塑性LFS(900脉冲，1Hz)被传输到从年轻大鼠(7-14天)得到的海马切片以诱导长时期抑郁(LTD)。以1Hz刺激海马切片3分钟没有产生突触传递的LTD。然而，在化合物1(83.4±10.9％，n＝3)存在时，这种短期LFS可明显地诱导LTD。在LFS过程中用化合物1(1.6μM)灌流15分钟可将LTD可塑性逆转成LTP。在一氧化氮供体硝普盐(300μM)和化合物1(1.6μM)存在下传输0.02Hz的较弱电刺激。同时灌流一氧化氮供体硝普盐(30μM)和化合物1(1.6μM)可诱导LTD。此数据表明在化合物1存在下一氧化氮供体能够模拟强直刺激活动。单独的化合物1或硝普盐在0.02Hz的刺激时没有增强fEPSP。
吡唑基化合物对LTP的增强测试化合物1-8在海马切片中的LTP诱导。结果如表1所示，表明强直刺激(50Hz，0.5s)60分钟后的fEPSP斜率。每种化合物(1.6μM)在较弱的强直刺激之前3分钟和较弱的强直刺激之后3分钟灌流。
表1吡唑基化合物对LTP诱导增强的作用
动作任务测试Morris水迷宫在位于具有区别性视觉提示的房间内的圆形水池(直径为224cm，高度为46cm)中进行Morris水迷宫测试。加水至水深为36cm，在确定的象限中心设置透明的塑料平台(25×25cm，高度为32cm)。在测试环境中训练大鼠两天在没有透明塑料平台的水池中自由游泳。每次训练期是2分钟，并由实验者将大鼠从水池中取回。然后，在随后的六天内每天大鼠接受四次连续的训练测试。在每次训练测试中，每只大鼠从一个象限中随机放入水中。大鼠必须游泳直到其爬到浸在水面下的塑料平台上为止。记录从被放入水中到爬上塑料平台的时间，并定义成为逃避潜伏期。如果大鼠在120秒后不能找到塑料平台，那么就由实验者将其抓住并放到塑料平台上。每只大鼠在平台上停留60秒，这也是测试的时间间隔。每天在第一次训练测试前10分钟将化合物1(1mg/kg)或载体注射进每只大鼠。在每天最后的训练测试后，每只大鼠用毛巾擦干，并将电加热器放进它的栖息笼中。
有充分证据表明海马与空间信息的捕获和保持有关。例如参见，Ohonet al.(1979)Behav.Brain Sci.2316-365；及Barnes(1988)Trend Neurosci.11163-169。测试化合物1对Morris水迷宫中空间记忆捕获的作用。大鼠每天接受连续的训练测试。每天在第一次训练测试前10分钟注射化合物1(1mg/kg)。数据表明化合物1可缩短训练第一天内第2～4次的逃避潜伏期，这表明化合物1可促进短期记忆。对照组的第2～4次逃避潜伏期分别为93.8±8.7s、79.3±12.3s、57.6±12.5s，化合物1组(n＝10)的第2～4次逃避潜伏期分别为50.4±10.2s、47.3±6.8s、30.3±10.3s。化合物1组随后3天训练中的第一次测试的逃避潜伏期也明显缩短，对照组的逃避潜伏期分别为91.1±9.8s、47.1±3.9s、35.3±6.1s，化合物1组(n＝10)的逃避潜伏期分别为55.4±12.8s、15.3±2.1s、13.4±1.7s。这些结果表明化合物1也可增强长期记忆。尽管化合物1在4天内仅使用1次，但是在全部21天的实验时间内化合物组1的逃避潜伏期均较短。在第21天时对照组和化合物1组的平均逃避潜伏期分别是13.5±1.8s和6.0±0.5s(每组n＝10)。上述结果表明化合物1对于提高学习记忆是有前景的药物。将化合物1与1.25％的羧甲基纤维素(CMC)混合并在连续6天的第一次测试前30分钟直接口服输送到胃(10mg/kg)。与注射使用相似，口服化合物1也可促进短期记忆和长期记忆。
由于L-NAME可对抗海马切片中化合物1诱导的LTP增强，所以进行体内实验以测试L-NAME对由化合物1引起的改进的学习记忆的作用。在这些实验中，对大鼠慢慢地植入插管，并在每天的第一次测试前10分钟通过脑室内(intracerebroventrically)注射L-NAME(1mmole/10mL)或盐水，同时经i.p.(腹腔)注射化合物1(1mg/kg)。数据表明L-NAME可引起深度的遗忘症并明显阻断由化合物1诱导的增强的学习记忆。KT 5823的脑室内使用也会削弱化合物1诱导的增强。
被动回避和主动回避测试用Liang et al.(1998，Chin.J.Physiol.4133-44)中所述的过程训练大鼠，并进行单次被动抑制性回避测试。简言之，将槽形通道的装置用滑动门分成照明良好的安全室和黑暗震动室。将大鼠置于远离门的明亮侧并面对门。当大鼠转向时，打开门。大鼠进入暗室后，通过定时器控制的恒电流震动器(Lafayette Instruments，Model80240和Model 58010，Indiana，USA)使其受到不可避免的震动。经过震动后，从通道中取出大鼠并放回它的栖息笼中。保持测试24小时或10天后，将大鼠再次放入通道中，其全部四只脚进入震动室的潜伏期用作保持力分值。如果在5分钟或10分钟内大鼠没有进入，那么终止测试实验，最高分值是300s或600s。
扁桃体也与学习记忆有关。研究表明大脑结构尤其与情感信息的处理有关。例如参见，Cahill and McGaugh(1990)Behav.Neurosci.104532-543；及Gilbert et al.(1991)Behav.Neurosci.105533-561。据报道一氧化氮也与依赖活动性的突触可塑性及扁桃体核中的被动回避学习有关。例如参见，Bernabeu et al.(1995)Neuro Report 61498-1500；Watanabeet al.(1995)Brain Res.688233-236；及Teledgy and Kokavszky(1997)Neuropharmacology 361583-1587。研究化合物1对被动回避学习的作用。在震动训练前10分钟注射化合物1(i.p.，1mg/kg)。结果表明化合物1可明显延长亮室内的保持力潜伏期。这种记忆可持续几天。即使在第10天测试，保持力分值也非常高。在第1天和第10天时测试的化合物1处理的大鼠中，多数大鼠的保持力潜伏期大于5分钟(对照组中15只大鼠有2只达到，化合物1处理组中12只大鼠中有11只达到)。当将化合物1与1.25％CMC混合并在震动前直接输送到胃(10mg/kg)时，分别进行1天和随后10天的保持力测试。化合物1大大地提高了被动回避学习能力(表2)。如表3所示，化合物1(i.p.，1mg/kg)可促进老年大鼠的学习行为，尽管这种作用明显低于较年轻的大鼠。选择1岁的大鼠进行这种实验。在震动前10分钟经i.p.注射化合物1(1mg/kg)。分别进行1天和随后10天的保持力测试。
表2口服化合物1对被动回避保持力的增强
表3在老年大鼠中注射化合物1对被动回避保持力的增强
上述结果表明，化合物1可提高年轻大鼠和老年大鼠的被动回避学习。在这些测试中，化合物1优先影响新形成记忆的捕获，这是一种被认为与LTP诱导态相关的过程。对大鼠而言震动被认为是很大的刺激。在这种情况下假设释放出一氧化氮并很快的产生新陈代谢变化。当震动30分钟后注射化合物1时，化合物1对大鼠没有任何作用。这些结果表明化合物1仅在记忆测试之前或过程中被使用时才可提高记忆行为。
这些数据也表明当震动30分钟后注射时，化合物1对大鼠回避行为没有任何作用。此外，由化合物1诱导的增强作用明显受L-NAME和KT5823(i.c.v.，分别为1mmole和0.2nmole)的抵抗。这些结果表明化合物1仅在记忆测试之前或过程中被使用时才可提高记忆行为。此外，在相关训练前10分钟使用化合物1而不使用震动，可延长被动抑制性回避，这表明化合物1可增强没有震动的环境因素的记忆捕获。
为测试主动回避，将大鼠置于暗室内，并面对门。门是半开的，大鼠有10秒钟的时间穿过门进入亮室。对于这次实验没有选择可在10秒内穿过安全侧的大鼠。10秒钟后开始震动，大鼠逃进安全室，关上门。48小时后，测定在黑暗震动室内的保持力时间。淘汰在相关训练中可于10秒内进入亮室的大鼠。第1天在放进暗室的10秒后使用震动。第2天测定记忆保持力。在震动前10分钟注射化合物1可引起记忆保持力的明显提高，并降低从震动室到安全室的逃避潜伏期。此外，由化合物1诱导的记忆增强作用明显受L-NAME和KT5823(i.c.v.，分别为1mmole和0.2nmole)的抑制。这样，化合物1通过NO-cGMP-PKG通路可明显提高大鼠被动回避和主动回避的记忆行为。
转棒测试(Rotorod Test)用小鼠(雄性，20-25gm)进行这种实验。转棒是塑料圆柱棒(3cm直径×13cm高度)。棒支撑于两面墙壁的末端，距墙壁地基25cm。棒末端的墙壁足够高，从而小鼠不能爬过棒。每次实验进行3次测试。在第一次训练测试之前20分钟经i.p.注射化合物1(1mg/kg)或载体。对于每次转棒测试，将小鼠置于棒上并计时，直到它们从棒上跌落。计时最长达3分钟，时间间隔是10分钟，以28rpm的转速用电动发动机旋转棒。
据报道小脑一氧化氮也与LTD和动作学习有关。例如参见，Li et al.(1995)J.Neurophysiol.74489-494。研究化合物1对动作学习的提高。选择小鼠进行这种实验。化合物1(i.p.，1mg/kg)明显可提高小鼠在旋转的转棒(28rpm)上的动作协调性。随着测试次数的增加对照小鼠的能力得到了提高，且在第三次测试时有较好的提高。然而，用化合物1处理的小鼠即使在第一次测试时在棒上也表现出较好的平衡，并且在第二次测试时有非常好的动作协调性。显然化合物1通过作用于小脑可提高动作学习。
其它实施方案说明书中公开的所有特征可以以任何方式组合。说明书中公开的每个特征可用变化的起同样、等价或相似作用的特征来代替。由此，除非另有明确说明，公开的每个特征仅是等价或相似特征群的一个实例。
本领域所属技术人员可从上述说明书很容易地确定本发明的实质特征，而不会脱离本发明的精神和范围，本领域所属技术人员也可对本发明作出各种变化和修改以使其适于各种应用和条件。例如，稠环吡唑基化合物结构上的相似化合物也可用于实施本发明。这样，其它实施方案也包含在权利要求书之内。
权利要求
1.一种增强学习记忆或治疗遗忘症的方法，所述方法包括对需要的受治疗者使用有效量的如下通式所示的化合物 其中A是H、R或 Ar1、Ar2和Ar3中的每一个独立地是苯基、噻吩基、呋喃基或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5和R6中的每一个独立地是H、硝基、卤素、R、OH、OR、C(O)OH、C(O)OR、C(O)SH、C(O)SR、C(O)NH2、C(O)NHR、C(O)NRR’、ROH、ROR’、RSH、RSR’、ROC(O)R’OH、NHR、NRR’、RNHR’或RNR’R”；或者R1和R2同时、R3和R4同时或R5和R6同时是ORO；其中R、R’和R”中的每一个独立地是C1～C6烷基；及n是1、2或3。
2.如权利要求1所述的方法，其中A是
3.如权利要求2所述的方法，其中Ar1是苯基。
4.如权利要求3所述的方法，其中R1和R2分别取代在苯基的4位和5位。
5.如权利要求2所述的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
6.如权利要求5所述的方法，其中R3和R4中的一个取代在呋喃基的2位。
7.如权利要求2所述的方法，其中Ar3是苯基。
8.如权利要求7所述的方法，其中n是1。
9.如权利要求8所述的方法，其中Ar1是苯基。
10.如权利要求9所述的方法，其中R1和R2分别取代在苯基的4位和5位。
11.如权利要求10所述的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
12.如权利要求11所述的方法，其中R5和R6中的每一个都是H，R3和R4中的一个取代在呋喃基的2位。
13.如权利要求12所述的方法，其中R1和R2中的每一个都是H。
14.如权利要求13所述的方法，其中R3和R4中的一个是H，另一个是CH2NCH3。
15.如权利要求13所述的方法，其中R3和R4中的一个是H，另一个是CH2OH。
16.如权利要求13所述的方法，其中R3和R4中的一个是H，另一个是CH2OCH3。
17.如权利要求13所述的方法，其中R3和R4中的一个是H，另一个是COOCH3。
18.如权利要求12所述的方法，其中R3和R4中的一个是H，另一个是CH2OH。
19.如权利要求18所述的方法，其中R1和R2中的每一个都是H。
20.如权利要求18所述的方法，其中R1是H，R2是F。
21.如权利要求18所述的方法，其中R1是H，R2是OCH3。
22.如权利要求18所述的方法，其中R1和R2同时是OCH2O。
23.如权利要求2所述的方法，其中Ar1是噻吩基。
24.如权利要求3所述的方法，其中Ar2是苯基。
25.如权利要求24所述的方法，其中R3和R4中的一个取代在苯基的4位。
26.如权利要求25所述的方法，其中R3和R4中的一个是H，另一个是CH3。
27.如权利要求24所述的方法，其中Ar3是苯基。
28.如权利要求27所述的方法，其中n是1。
29.如权利要求28所述的方法，其中R3和R4中的一个取代在苯基的4位。
30.如权利要求29所述的方法，其中R3和R4中的一个是H，另一个是CH3。
31.如权利要求30所述的方法，其中R1和R2中的每一个都是H，R5和R6中的一个是H，另一个是取代在苯基3位的Cl。
32.如权利要求30所述的方法，其中R1和R2中的每一个都是H，R5和R6中的一个是H，另一个是取代在苯基4位的NO2。
33.如权利要求1所述的方法，其中A是H。
34.如权利要求33所述的方法，其中Ar1是苯基。
35.如权利要求34所述的方法，其中R1和R2分别取代在苯基的4位和5位。
36.如权利要求35所述的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
37.如权利要求36所述的方法，其中R3和R4中的一个取代在呋喃基的2位。
38.如权利要求37所述的方法，其中R1和R2中的每一个都是H。
39.如权利要求38所述的方法，其中R3和R4中的一个是H，另一个是COOCH3。
40.如权利要求33所述的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
41.如权利要求40所述的方法，其中R3和R4中的一个取代在呋喃基的2位。
全文摘要
本发明提供一种增强学习记忆或治疗遗忘症的方法。该方法包括对需要的受治疗者使用如通式(I)所示的化合物，A是H、R或a；Ar
文档编号A61K31/415GK1585637SQ02822278
公开日2005年2月23日 申请日期2002年9月16日 优先权日2001年9月14日
发明者符文美, 梁庚辰, 钱韦伶, 郭盛助, 李芳裕, 邓哲明 申请人:卡尔斯拜德技术公司