专利名称：dl－THP的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及消旋四氢帕马丁(dl-tetrahydropalmatine，简称dl-THP)的新用途，以及与之有关的化合物，还涉及使用dl-THP治疗相关病人的方法，为治疗有关病人制造dl-THP药剂的方法，以及dl-THP的用法。
背景技术：
dl-THP(也叫做Corydalis B，“延胡索乙素”，全名5，8，18，13a-tetrahydro-2，3，9，10-tetramethoxy-6H-dibenzo[a，q]quinolizine)是一种著名的化合物，在过去已经知道这种化合物有治疗疾病的各种疗效。此处提到的它的各种形式的“疗效”是指任何治愈、减轻、消除或减少人类或动物的症状，或者预防或减少他们患上任何失调或功能障碍的可能性。美国5,242,926号专利中公开了用dl-THP治疗甲状腺机能亢进的治疗方法。美国5,308,619号专利中公开了用从紫堇属植物(Corydalis)和金英花(Eschscholtzia)中抽取有效成份，治疗激动不安和神经机能障碍的治疗方法。美国5,547,956号专利披露了应用dl-THP治疗吸毒者，使之消除毒瘾的治疗方法。dl-THP很容易从传统中药延胡索(Corydalis yanhusuoW.T.Wang)中分离出来，是延胡索中的一种有效成份，可用来增进血液循环、增强生命机能和减轻疼痛。延胡索还可减轻生命机能的停滞或血液的壅塞，否则会导致头痛、胸痛、抑郁性痛、上腹痛、腹痛、背痛、关节痛、经痛或伤痛。已经知道，dl-THP在中央神经系统(CNS)中能降低多巴胺、去甲肾上腺素、和血液中所含的复合胺的水平(Liu GQ等人，Arch Int Pharmacodyn Ther Jul1982；258(1)39-50；PMID6182845)，以及通过在下丘脑中血清素启动的释放作用，降低动脉压力和心跳率(Chueh FY等人，JPN J Pharmacol.Oct 1995；69(2)177-80；PMID8569056)。它也能减少运动行为，预防老鼠中暑(Chang CK等人，Neurosci Lett.May 28，1999；267(2)109-12；PMID10400224)。dl-THP的两种旋光对映异构体(即d和l对映异构体)在中央神经系统中的靶已被识别，而且显示治疗效果，包括有引起镇静—安定效应和抑制电压—依赖的Ca2+离子通道(Vauquelin等人，Neurochemistry International，1989 15(3)321-324)。
dl-THP被广泛地利用，且以草药辅助食品和安眠药丸销售。
对实验室动物作dl-THP的药理研究(Hsu B等人，ArchivesInternationales de Pharmacodynamie 1962；CXXXIX；318-327)显示它有镇痛作用。它有镇静-安静作用，减少安非他明的毒性，防止由酶斯卡灵引起的反常活动，消除回避条件反射和具有明显镇静安宁效应。在医院中的临床试验表明，对许多内脏隐痛病例有显著的镇痛作用，对患有失眠症的病人亦可用作短期代用催眠药。另外的研究包括在Hsu B等人的著作中(International Journalof Neuropharmacology 1964；2283-290)。
先前已经知道dl-THP的镇静作用与阻抗多巴胺受体有关。但是，以前的研究用了动物行为试验的结果去确定dl-THP和它的旋光对映异构体的受体结合特性，而不是进行离体受体竞争性结合分析。因此作为成果，先前的研究只限制在其已阐述的范围内，以及其可提供的对dl-THP的作用的有关理解上。
发明内容
本发明成功识别了以前未提到过的dl-THP的结合伙伴，也就是甲型伽马氨基丁酸受体(GABAA)苯二氮卓(benzodiazepine，‘BDZ’)的结合位点。dl-THP-GABA受体的相互作用竞争性地抑制其它GABA受体-BDZ的相互作用，并提供了对dl-THP疗效的新颖的观察方法。这一dl-THP相互作用的新的理解使利用dl-THP进行以前未提到过的治疗成为可能。
本发明提供了制造用于治疗中枢神经系统(CNS)失调，包括治疗焦虑和惊厥发作的制剂(即药剂)的方法，它含有dl-THP(或者一种或多种与之相关的化合物)的制剂以及在生理上可接受的载体。特别是这种制剂是能抗焦虑或抗惊厥的药物。特殊的应用包括治疗癫痫重积状态和脑瘫痪、惊厥发作和广泛性焦虑失调症(GAD)，亦可用作术前抗惊厥药和麻醉药。这与先前报告过的功效，例如它的镇静作用有差别。
本发明还提供了治疗有上述CNS失调病症的病人的方法，包括给予病人dl-THP有效的治疗剂量。
本发明还提供了为治疗上述CNS失调用的dl-THP制造药剂的方法。
图1表示四氢原小檗碱(tetrahydroprotoberberine)主链的结构。
图2表示dl-THP的结构。
图3a-3c依次表示消旋四氢小檗碱(dl-tetrahydroberberine)、l-scoulerine和α-allocryptopine的结构。
图4表示在给定的五分钟内，小鼠在区域运动试验中的表现。Y-轴表示活动次数。服药1小时后作试验。以水作为口服传递媒介。从左至右，各柱体表示口服不同药剂量的结果，服用量分别是水(对照组)、0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg和100mg/kg dl-THP。结果以活动数的均数±标准差表示。*p＜0.0005，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。**p＜0.0001，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。***p＜0.00005，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。****p＝0，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。
图5表示在给定的五分钟内小鼠在高架迷宫试验中的表现。Y-轴表示进入总数的均数±标准差(黑色带)，进入开臂的百分比(垂直阴影带)，停留在开臂段的时间(秒)百分比(水平阴影带)。服药1小时后作试验。以水作为口服传递媒介。从左至右，服用量分别是水(对照组)、0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和50mg/kg dl-THP。*p＜0.005，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。**p＜0.0000005，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。***p＜0.000000001，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。
图6表示在给定的五分钟内小鼠在四孔板试验中的表现。Y-轴表示与对照组探头次数相比较的百分比±标准差(黑色带)，保持探头的时间(垂直阴影带)，用后脚站起的次数(水平阴影带)和用后脚站起所维持的时间(白色带)。服药1小时后作试验。以水作为口服传递媒介。从左至右，服用量分别是0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和50mg/kg dl-THP。*p＜0.05，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。**p＜0.005，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。***p＜0.0005，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。#p＜0.00005，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。##p＜0.00001，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。###p＜0.000001，显著不同于对照组(用Dunnett t-检验的方差分析)。
图7显示GABA受体竞争性抑制结合实验的分析结果，通过抑制[3H]-flunitrazepam与GABAA受体的BDZ位点结合，证实dl-THP与GABA受体结合，竞争性抑制50％安定结合浓度(IC50值)为836.09μM和竞争性抑制安定结合常数(aKi值)为517.5μM。
具体实施例方式GABA(伽马氨基丁酸)被认为是一种在哺乳动物中枢神经系统(CNS)中起主要抑制作用的神经递质。GABA由谷氨酸，主要激发神经的传导体，通过两种谷氨酸脱羧(GAD)方式之一转化而成。在大脑中大约30％的神经元，特别是小的中间神经元，认为是被GABA激化(含有GAD)，而大多数神经元对GABA的反应则是减少了它们的电冲率。他们尽管不相等地，但却广泛地分布在哺乳动物的脑中。大量的努力已投入在焦虑、惊厥发作、失眠和认识能力的病因学方面，它们都牵连到GABA(Tallman JF等人，“The GABA-ergic systema locus ofbenzodiazepine action.”Annu Rev Neurosci.1985；821-44；PMID2858999)。GABA通过局限于细胞体和神经末端的GABA受体传递它的许多活动。GABA突触后反应的传递是通过在氯离子传导中的变化，它通常引起细胞的超极化。对许多在结构上无关而能够更改GABA突触后反应的化合物，目前的研究已经知道突触后与GABA反应的蛋白质复合体是主要的活性位点。取决于相互作用的模式，这些化合物能够产生一系列的作用，例如镇静、抗焦虑、抗惊厥、或者失眠、惊厥发作和焦虑。
GABAA受体有许多功能性的结构域(Smith GB，Olsen RW，Trends PharmacolSci.1995 May；16(5)162-8；PMID7624971)并且在它们的氯离子通道内或附近，有大量苯二氮卓、巴比妥酸盬和木防己苦毒素的结合位点以及麻醉类固醇的结合位点。特别是伽马亚基很可能是苯二氮卓类药物修饰GABA反应的结构基础(Pritchett DB等人，Nature，April 13，1989；338(6216)582-5；PMID2538761)。
苯二氮卓(BDZ)的种类包括苯甲二氮(diazepam，俗称安定)、三唑仑(trizolam)和氟硝西泮(flunitrazepam，俗称FM2)。在动物中传统的苯二氮卓的主要行为作用是四重的释放焦虑、抗惊厥作用、镇静和肌肉松弛。不管处方治疗的主症是什么，所有苯二氮卓完全促效剂都有这些性质。例如，三唑仑在处方中作为催眠药，在动物试验中，也是有效的抗焦虑药和抗惊厥药，反之，苯甲二氮主要是作为抗焦虑药，在动物中也是强有力的催眠药。可以认为，从其它化学物质系列得来的所有完全促效剂具有相当的行为效应。所有这些效应可由苯二氮卓的拮抗剂所阻断，显示出它们确与GABAA受体作用相关。
药物结合在GABAA的BDZ位点以发挥它们的药理学活性，这与它们改变GABA作用的能力有关。那些结合到受体而具有类似于BDZ的活动的化合物叫做促效剂。那些结合到受体而具有相反于BDZ的活动的化合物叫做反促效剂，而那些同时阻碍两种活动的叫做拮抗剂。
当GABA结合到GABAA受体，通过信号信道的氯离子流增加。这引起膜的超极化，从而导致神经元启动能力降低。结果，GABAA成为各种药理学和临床学上重要药物的分子靶标，例如抗焦虑药、抗惊厥药、镇静-催眠的苯二氮卓(BDZ)、一些引起焦虑的、引起惊厥的β-咔啉，以及荷包牡丹碱或者木防己苦毒素惊厥剂。此外，在多种GABAA受体亚型的三级结构中存在的已知的多个位点具有与不同的配体相互作用的能力。
这样，在目前的实践中显示，dl-THP的应用引致GABAA受体的反应。特别是，dl-THP可用来治疗中枢神经系统失调，包括治疗焦虑和惊厥发作。发明者进行过的实验已表明dl-THP是GABAA受体的BDZ结合位点的促效剂，且具有抗焦虑、镇静和催眠的特性。dl-THP的镇静/催眠的性质先前已经透露过。dl-THP作为抗焦虑药的性质则先前没有提出过。独特的新颖的应用包括治疗癫痫重积状态和脑瘫痪，惊厥发作和广泛性焦虑(例如在一篇文章“TheGABAA/Benzodiazepine receptor as a target for psycoactive drugs”，Springer，NewYork，1995229-264；ISBN0412100916中定义过)，以及作为术前抗惊厥药和麻醉药。
当与其它苯二氮卓药物比较时，dl-THP有许多优越性。特别是其毒性低微一它的LD50对小鼠(口服)、大鼠(口服)和小鼠(皮下注射)分别是1160mg/kg、930mg/kg和670mg/kg。此外，它容易从许多传统中药，例如延胡索中通过已为人熟知的标准技术提取(例如可参考Matsuda H.等人的著作，“Inhibitory effects ofmethanolic extract from corydalis tuber against types I-IV allergic models.”，BiolPharm Bull.July 1995；18(7)963-7；PMID7581251)。亦可通过标准技术合成(Narasimhan NS等人，“A novel synthesis of tetrahydropalmatine”，Chem Ind.May10，1969；19621-2；PMID5781510)。
实验下面的试验表示dl-THP有抗焦虑效应(也就是在解除或减少焦虑、激动和/或紧张)方面有治疗效果。还表示有镇静作用，也就是在处理惊厥发作上有治疗效用。特别是它的抗焦虑和镇静作用对治疗癫痫重积状态和脑瘫痪，惊厥发作和广泛性焦虑(GAD)有用。
受体竞争结合测定在dl-THP受体结合方面的研究先前已做过，并显示在老鼠大脑皮层中与α-1和α-2肾上腺素受体的结合分别具有4.70μM和4.97μM的Ki值。氟硝西泮(Fluzitrazepam)是一种已知的BDZ，它的受体亲和力已由例如Viola H等人研究过(Biochem Biophys Res Commun.Sep 7，1999；262(3)643-6PMID10471378)，Villar HO等人(Mol Pharmacol.October 198936(4)589-6000，PMID2554113)和Lelas S等人(Behav Pharmacol.February 199910(1)39-50；PMID10780301)。
应用标准的受体竞争结合的定量分析(见图7)，找出dl-THP以836.09μM的IC50值和517.58μM的Ki值抑制[3H]-flunitrazepam结合到GABAA受体的BDZ结合位点。
对于dl-THP这种对GABAA受体的BDZ结合位点的亲合力先前没有人提议过或表示过。
动物用美国癌症研究所(ICR)雌、雄小鼠，重14-17克。分笼饲养，每笼4-5只，自主摄食饮水，维持11小时光和13小时黑昼夜周期。每实验组12只小鼠。
药物dl-THP溶解在重蒸馏水中，于行为实验前一小时口服，剂量详见下文。对照组则服用重蒸馏水。
试验条件全部程序在安静和有空调的实验室内从上午8点到下午1点进行，环境温度摄氏20-22度。每次做完试验后，清除所有在地面上的剩余物，并用70％的乙醇擦拭干净。
区域运动试验用北京医科院药物所制作的ZIL-2仪器(60×60×12厘米)进行测试。它由四个直径为25厘米的圆形塑料盒组成，每盒有六个均布的红外光电管。在五分钟的时间间隔内自动计数区域运动次数。光转变数目的减少反应区域运动的减少。
四孔板试验孔板仪器是一有墙围绕的试室(60×60×30厘米)，室内地板上有四个直径3厘米相互等距离的孔。小鼠放在室的中央。在五分钟的时间间隔内记录向孔探头的次数和探头所维持的时间，用后脚站起(竖身)的次数和所维持的时间(File SE等人，“The effects of trizolobenzodiazepines in two animal tests of anxietyand in the holeboard”，British Journal of Pharmacology November 1985；86(3)729-735；PMID2866006)。每次试验后，用纸巾擦净仪器，清除先前的脚印痕。与对照组比较，上述四个参数减少的量显示镇静行为表现的强弱。
高架迷宫试验高架迷宫是由木制成的水平十字架，有两条无栏栅的悬臂(25×5厘米)(简称开臂)和两条墙高20厘米的相对着的悬臂(25×5厘米)(简称闭臂)。悬臂从中央平台(5×5厘米)伸展出来。高架迷宫离地40厘米，放在30×30×50厘米的盒子内。小鼠在进行四孔板试验后，马上被放在中央平台上，面对着封闭的悬臂。在五分钟的时间间隔内记录进入悬臂的次数和在开臂和闭臂停留的时间(Pellow S等人，“Anxiolytic and anxiogenic drug effects on exploratory activity inan elevated plus-mazea novel test of anxiety in the rat”，Pharmacology，Biochemistry and Behavior March 1986；24(3)525-529；PMID2871560)。四只脚都在悬臂上才算进入。进入总数是量度一般的活动行为。小鼠选择增加进入开臂的次数及时间则显示抗焦虑效应。
水平金属线试验握住小鼠的尾巴举起小鼠，让它用前脚抓住水平伸展的金属线(直径1毫米，15厘米长，离桌面20厘米)然后放开它(Bonetti EP等，Psychopharmacology(Berl.).1982；78(1)8-18；PMID6292984)。记下在十次中小鼠不能用前脚抓住金属线或者在3秒内不能有效地最少用一只后爪抓住金属线的次数。
统计分析区域运动试验和高架迷宫试验以均数±标准差表示。四孔板试验以百分比±标准差与对照值相比较。所有数据用标准均方差来分析。用Dunnett的t-检验来对不同处方和对照组之间在区域运动试验、四孔板试验和高架迷宫试验方面进行Post hoc比较。显著性水平取为p＜0.05。
结果图4表示由于dl-THP的作用使区域运动减少的典型的药理图表。1毫克/千克和10毫克/千克的剂量减少区域运动33％(依次为F1，22＝20.29，p＜0.0005和F1，22＝25.09，p＜0.0001)。30毫克/千克的剂量减少区域运动36％(F1，22＝22.62，p＜0.00001)。
在高架迷宫试验中(图5)，在三种不同剂量(F3，44＝0.56)下，dl-THP没有明显改变进入悬臂的总数。口服1、10和30毫克/千克时依剂量显著地增加了进入开臂的百分比(F3，44＝17.70，p＜0.0000005)和停留在开臂的时间(F3，44＝23.32，p＜0.000000005)；Dunnett的t-检验显示，在小鼠服用1毫克/千克的dl-THP后，其行为与对照组的小鼠显著不同。这证实dl-THP有抗焦虑作用(亦即它是有效的抗焦虑药)。
在四孔板试验(图6)中，dl-THP对探头次数和保持探头的时间均有显著影响(分别为F3，44＝4.95，p＜0.01；F3，44＝3.33，p＜0.05)。分析表明，当剂量为30毫克/千克时，dl-THP显著减少探头次数及所维持的时间(分别为F1，22＝16.83，p＜0.0005及F1，22＝11.72，p＜0.005)。Dunnett的t-检验亦表明剂量10毫克/千克显著减少探头次数。这些效果表明，大剂量的dl-THP起镇静作用，即在治疗惊厥发作时有用。水平金属线试验显示，dl-THP口服剂量高至30毫克/千克不影响试验结果，这说明在此剂量或更低的剂量下，dl-THP不引起小鼠肌肉松弛。
结论实验的主要发现是dl-THP在高架迷宫试验中有抗焦虑作用和在四孔板试验中有镇静作用，而不会引致肌肉松弛(图5和图6)。
用来治疗焦虑和多种发作，特别是治疗癫痫重积状态和脑瘫痪、惊厥发作和广泛性焦虑以及作为抗惊厥药和术前麻醉药，在治疗上有效的抗焦虑药和镇静药的制剂是由生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂与dl-THP配方而成(Remington’s Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia，1984，MackPublishing Company，Easton，Pa.，USA；United States Pharmacopoeia，ISBN1889788031)。此处提到的生理上可接受的载体在适当的地方也就是指生理上可接受的稀释剂和赋形剂。
有特定治疗效果的精确剂量依赖于一系列的因素，特别是服药病人的年龄、体重和性别。有既定治疗效果的最佳剂量用简单的剂量一反应定量分析来确定。
口服的典型制剂是由2800μg的dl-THP和生理上可接受的载体组成。
上面的实验显示对小鼠在治疗上有效的服用量。容易看到对其他哺乳动物亦有同样的医疗效果，特别是对人类，犬和猫科动物以及其它家畜例如牛马等。
此处讨论的每一参考数据的内容，包括其引用的数据，在此处全面地由引用合并。
“PMID”是给予出版物的参考号数，是由美国国家医药图书馆配给的医药出版物识别号，由此可得出版物全面的著作目录信息和摘要，其互联网址是www.ncbi.nlm.nih.gov。可提供直接取得出版物的电子副本，特别是例如PNAS和JBC的出版物。
权利要求
1.一种治疗中枢神经系统(CNS)失调的方法，其特征在于，病人是由有焦虑和惊厥发作组成的组别中挑选出来，包含该病人服用在医疗上有效的dl-THP(消旋四氢帕马丁)的剂量。
2.如权利要求1所述的治疗CNS失调的方法，其特征在于，这种方法不会引起该病人的肌肉松驰。
3.如权利要求1所述的治疗CNS失调的方法，其特征在于，这种CNS失调是由癫痫重积状态、脑瘫痪、癫痫发作和广泛性焦虑(GAD)组成的组别中挑选出来。
4.一种成功抗惊厥或对病人有术前麻醉效果的方法，其特征在于，它包含该病人服用在医疗上有效的dl-THP(消旋四氢帕马丁)的剂量。
5.如权利要求1至4中任何一项权利要求所述的方法，其特征在于，上述患者是哺乳动物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该患者是从人、犬和猫组成的组别中挑选出来。
7.一种制造治疗CNS失调的制剂的方法，其特征在于，病人是由有焦虑和惊厥发作组成的组别中挑选出来，此制剂含有dl-THP(消旋四氢帕马丁)和生理上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的制造治疗CNS失调的制剂的方法，其特征在于，病人是由癫痫重积状态、脑瘫痪、癫痫发作和广泛性焦虑(GAD)组成的组别中挑选出来。
9.一种制造制剂的方法，其特征在于，此制剂用于抗惊厥或术前麻醉准备，它含有dl-THP(消旋四氢帕马丁)和生理上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及一种新的，使用dl－THP(消旋四氢帕马丁)治疗包括焦虑症、惊厥发作和癫痫重积状态在内的病症的用途。
文档编号A61P25/00GK1627943SQ02828977
公开日2005年6月15日 申请日期2002年6月10日 优先权日2001年3月28日
发明者薛红, 罗锡麟 申请人:薛红, 罗锡麟