专利名称：重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗及制备方法
技术领域：
本发明提供一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗(简称乙卡联合苗)，特别提供了重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)与卡介菌(BCG)菌液的配比处方、冷冻干燥工艺，同时还提供了涉及该联合疫苗的保护剂、接种剂量、接种途径，属于疫苗生产制备工艺技术领域。
背景技术：
乙型肝炎和结核病均为传染性疾病，通过接种相应的疫苗，预防乙型肝炎和结核病一直很有成效。根据计划免疫规定，新生儿在出生24小时内必须接种乙型肝炎疫苗和卡介苗。现行使用的卡介苗为冻干制剂，上臂三角肌处皮内接种，现行使用的重组乙型肝炎疫苗为液体疫苗，含铝佐剂和防腐剂，上臂三角肌肌内接种，这两种疫苗均为单价疫苗，需同日分别接种。因为接种途径不同，以及现行的乙型肝炎疫苗含有防腐剂，因此，与卡介苗不能简单地混合使用，必须两针分别接种，这不仅给新生儿带来痛苦，也给接种增加了许多不便。乙型肝炎疫苗与卡介苗合为一针接种的问题成为本发明要实现的目的。
发明内容
本发明提供一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，使新生儿由原来的两针接种简化为一针接种，可达到原来接种两针的预防效果。
本发明还提供一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗的冻干剂型。
本发明进一步提供了一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗生产工艺，适合于工业化生产。
重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，其特征在于每支成品含以下组分及含量乙型肝炎表面抗原 5微克～20微克卡介菌80微克～120微克明胶 0.8～1.2毫克蔗糖 8～12毫克氯化钾0.8～1.2毫克谷氨酸钠 0.8～1.2毫克氯化钠0.8～0.9毫克pH6.0～7.5本发明重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗的具体制备方法，包括以下步骤(1)提供的卡介菌原液每毫升含以下成份及含量卡介菌 800～1200微克明胶8～12毫克蔗糖80～120毫克氯化钾 8～12毫克谷氨酸钠8～12毫克余量为注射用水
(2)提供重组乙型肝炎病毒表面抗原原液每毫升含以下成份及含量重组乙型肝炎病毒表面抗原50～200微克。
氯化钠 8～9毫克余量为注射用水(3)在步骤(1)和步骤(2)中所述两种原液按1∶1比例混合，得到联合疫苗半成品。
(4)在步骤(3)中得到的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品进行分装，每支0.2毫升。
(5)在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为干箱预冻3～4小时，制品冻结7～8小时，逐渐升温真空干燥8～10小时，恒温真空干燥7～8小时，全过程累计25～30小时，制备出重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品。
重组乙型肝炎卡介菌联合疫苗的使用剂量及注射部位小剂量重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面抗原5微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
中剂量重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面抗原10微克和卡介菌8～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
大剂量重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支含乙型肝炎病毒表面抗原20微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗与单价卡介苗免疫效果比较实验组分别接种按本发明方法制备的三种规格乙卡联合苗，对照组接种同批卡介苗，每组接种4只豚鼠。5周时接种结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)，24～72小时判定反应局部硬结直径。重复实验三次。
接种PPD后24小时后判定结果(见表1)，各实验组与同批对照组相比较，结果相近，t检验p＞0.05，无显著性差异。重组HBsAg对卡介苗免疫效果无影响。
表1 PPD皮内试验结果HBsAg组别 疫苗 剂量反应直径(mm)x±s pμg/支实验1-1组 乙卡联合苗5 812148.510.6±2.86p＞0.05实验1-2组 乙卡联合苗10 11.5 9 138.510.5±2.12实验1-3组 乙卡联合苗20 10 1110.5 7 9.6±1.79对照1 卡介苗0 10.5 9.5 9 13 10.5±1.77实验2-1组 乙卡联合苗5 11.5 10129 10.6±1.37p＞0.05实验2-2组 乙卡联合苗10 14 8 128.510.1±2.71实验2-3组 乙卡联合苗20 10.5 14119.511.2±1.93对照2 卡介苗0 14 1210.5 8 11.1±2.52实验3-1组 乙卡联合苗5 98.5 7 10 8.6±1.25 p＞0.05实验3-2组 乙卡联合苗10 6.5 8 129 8.8±2.32实验3-3组 乙卡联合苗20 7.5 8.5 108 8.5±1.08对照3 卡介苗0 7.5 6.51011.5 8.8±2.28重组乙型肝炎卡介菌联合疫苗与单价重组乙型肝炎疫苗免疫效果比较按本发明方法制备的联合疫苗取消了原单价重组乙型肝炎疫苗中铝佐剂及防腐剂，而以卡介苗作为抗原同时又作为HBsAg的佐剂，本研究旨在探讨这种改变对重组乙肝表面抗原免疫原性的影响。
对照组按0、1、2程序接种重组乙型肝炎疫苗，按10μg/只剂量，腹腔接种豚鼠。
每次实验组设三组，初免时分别皮内接种含HBsAg 2.5μg(5μg/支规格)、5μg(10μg/支规格)、10μg(20μg/支规格)三种剂量的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗；对照组初免时，腹腔接种单价重组乙型肝炎疫苗10μg/只。第二针、第三针的加强免疫，各组相同，都是采用单价重组乙型肝炎疫苗10μg/只，。每次免疫后1个月采血，ELISA方法检测血清抗体滴度。结果见表1、2、3。
表2实验组(2.5μg)与对照组(10μg)免疫效果比较血清抗体几何平均滴度(GMT±S)组别 S1 S2 S3试验组 66±0.13(n＝9) 9164±0.47(n＝10)17811±0.33(n＝9)对照组 151±0.25(n＝8) 5596±0.43(n＝10)11271±0.23(n＝11)t＝3.14 t＝1.05 t＝1.28p＜0.01 p＞0.05 p＞0.05*S1、S2、S3分别为第一针、第二针、第三针免疫后抗体几何平均值表3实验组(5μg)与对照组(10μg)免疫效果比较血清抗体几何平均滴度(GMT±S)组别 S1 S2 S3试验组 74±0.22(n＝8) 10950±0.38(n＝9)16882±0.42(n＝8)对照组 151±0.25(n＝8)5596±0.43(n＝10)11271±0.23(n＝11)t＝2.72t＝1.56 t＝1.31P＜0.05P＞0.05 P＞0.05
表4实验组(10μg)与对照组(10μg)免疫效果比较血清抗体几何平均滴度(GMT±S)组别 S1 S2 S3试验组 85±0.32(n＝9) 12561±0.59(n＝10) 18756±0.43(n＝9)对照组 151±0.25(n＝8) 5596±0.43(n＝10) 11271±0.23(n＝11)t＝2.43 t＝1.82t＝1.56P＜0.05 P＞0.05P＞0.05从表2、表3、表4结果可见，2.5μg、5μg、10μg三种接种剂量的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗第一针免疫结果，其抗体几何平均滴度均低于单价10μg乙型肝炎疫苗腹腔免疫对照组，但第二针、第三针加强免疫后，实验组(联合疫苗组)抗体滴度迅速上升，而且高于对照组，其结果证明，卡介苗对乙型肝炎疫苗的全程免疫效果不仅无不良影响，而且，还有增强免疫效果的作用。
不同剂量重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗对乙型肝炎病毒表面抗原免疫效果的影响按本发明方法制备三种规格的该联合疫苗，分别含重组乙型肝炎病毒表面抗原为5μg/支、10μg/支、20μg/支，含卡介苗均为80～120μg/支。三种规格的联合疫苗用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升皮内注射，接种“PPD皮内试验”阴性的豚鼠，并按10μg/只剂量腹腔接种重组乙型肝炎疫苗进行加强免疫，ELISA方法检测血清抗体滴度。结果从表5可见，三种接种剂量的联合疫苗其免疫效果相近，不论初免，还是加强免疫，各组抗体几何平均滴度均无显著性差异。
表5重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗三种接种剂量免疫效果比较血清抗体几何平均滴度(GMT±S)接种剂量 S1 S2S310μg85±0.32(n＝9) 12561±0.59(n＝10)18756±0.43(n＝9)5μg 74±0.22(n＝8) 10950±0.38(n＝9) 16882±0.42(n＝8)2.5μg 66±0.13(n＝90)9164±0.47(n＝10) 17811±0.33(n＝9)t＝0.68t＝1.04 t＝1.31P＞0.05P＞0.05 P＞0.05重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗安全试验取该联合疫苗及同批原液的卡介苗，注射用水溶解，选用“PPD皮内试验阴性”、体重300～400g的同性豚鼠，试验组皮下接种50人份联合疫苗，对照组皮下接种50人份卡介苗，每两周称重一次，观察6周后，解剖检查。
三批联合疫苗试验结果，豚鼠体重增加，解剖观察肝、脾、肺、肾、大网膜、肠系膜等脏器与卡介菌组无区别，均无结核病变。
本发明的积极效果在于，制备的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，使新生儿接种一针疫苗，可预防乙型肝炎、结核病两种疾病，达到接种两针原有单价疫苗的效果。
本发明的积极效果还在于，本发明在制备重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗过程中，不是简单地将两种疫苗混合，而是将重组乙型肝炎病毒表面抗原蛋白与卡介苗菌体两者自然联合，去除了现行使用的乙型肝炎疫苗中铝佐剂、甲醛和硫柳汞等不良成分，提高安全性；在该联合疫苗中，兼用卡介苗的强免疫佐剂作用，既增强体液免疫，又增强细胞免疫，使其效果优于单价乙型肝炎疫苗。同时由于卡介菌的特殊性，必须皮内接种，这也成为该联合疫苗唯一的接种途径，而皮内接种一般为刺激机体免疫反应的最有效途径，它以低剂量接种达到相同或超过其它途径高剂量接种的效果。
本发明的积极效果还在于该联合疫苗改变了现行使用的乙型肝炎疫苗的液体剂型为冻干剂型，提高了乙型肝炎表面抗原的热稳定性，液体乙型肝炎疫苗通常在37℃15天，效力就显著下降，甚至降为原始效力的一半。由于该联合疫苗含有冻干保护剂，使乙型肝炎病毒表面抗原热稳定性得到提高，37℃30天，ELISA检测未见下降，结果见表6。
表6联合疫苗37℃30天ELISA检测结果样品组规格HBsAg量原始结果 37℃30天结果ug/支1 5 6.72 6.322 10 10.8311.513 20 19.6521.3具体实施方式
实施例1重组乙型肝炎病毒表面抗原原液的制备按《中国生物制品规程》2000版“重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗制检规程”进行。将适宜代数的含乙型肝炎病毒表面抗原基因的工程细胞CHO-C28扩增、传代，接种15L转瓶或生物反应器，37℃培养，收获培养液，纯化HBsAg，其纯度达95％以上，除菌过滤，用生理盐水稀释至50～200μg/ml。
实施例2
卡介苗原液的制备按《中国生物制品规程》2000版“皮内注射用卡介苗制检规程”进行，菌种在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基以及液体苏通培养基上传代、培养。收集菌膜压干，低温下研磨，加入保护剂稀释成0.8～1.2mg/m1浓度。
实施例3重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗冷冻干燥保护剂的制备按下列配方配置冷冻干燥保护剂成分 含量(％)明胶 0.8～1.0蔗糖 8～12氯化钾 0.8～1.2谷氨酸钠 0.8～1.2余量为注射用水pH 6.0～7.5实施例4重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品的制备其半成品组份及每毫升含量乙型肝炎表面抗原 25微克～100微克卡介菌400微克～600微克明胶 4～6毫克蔗糖 40～60毫克氯化钾 4～6毫克谷氨酸钠 4～6毫克余量为注射用水pH 6.0～7.5实施例5重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品的制备首先干箱预冻-40℃3～4小时，再将重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品分装0.2毫升/支，-40℃冷冻7～8小时，逐渐升温真空干燥8～10小时，30～35℃恒温真空干燥7～8小时，全过程累计25～30小时，即得冷冻干燥的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品。冻干后成品为白色疏松体，水份≤3％(g/g)。
权利要求
1.一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，其特征在于由以下组分组成乙型肝炎表面抗原 5微克/支～20微克/支卡介菌 80微克/支～120微克/支冻干保护剂
2.一种用于重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗的冻干保护剂，其特征在于由以下物质按重量份数比制成明胶0.8～1.2％蔗糖8～12％氯化钾 0.8～1.2％谷氨酸钠0.8～1.2％余量为注射用水pH 6.0～7.5
3.权利要求1所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)权利要求2所述的联合疫苗冻干保护剂稀释卡介菌，提供卡介菌原液每毫升含以下成份及含量卡介菌 800～1200微克明胶 8～12毫克蔗糖 80～120毫克氯化钾 8～12毫克谷氨酸钠8～12毫克余量为注射用水pH 6.0～7.5。(2)提供重组乙型肝炎病毒表面抗原原液每毫升含以下成份及含量重组乙型肝炎病毒表面抗原50～200微克氯化钠 8～9毫克余量为注射用水pH 6.0～7.5。(3)在步骤(1)和步骤(2)中所述两种原液按1∶1比例混合，得到联合疫苗半成品。(4)在步骤(3)中得到的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品进行分装，每支0.2毫升。(5)在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为干箱预冻3～4小时，制品冻结7～8小时，逐渐升温真空干燥8～10小时，恒温真空干燥7～8小时，全过程累计25～30小时，制备出冻干剂型的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品。
4.权利要求1所述的联合疫苗为冻干剂型。
5.一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，其特征在于皮内接种，用于预防乙型肝炎和结核病。
全文摘要
本发明提供了一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，特别提供了重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)与卡介苗(BCG)菌液的配比处方、冷冻干燥工艺，同时还提供了涉及该联合疫苗的保护剂、接种剂量、接种途径，属于疫苗生产制备工艺技术领域。该联合疫苗使新生儿接种一针疫苗，可预防乙型肝炎、结核病两种疾病。该联合疫苗含有冻干保护剂，使乙型肝炎病毒表面抗原稳定性提高；并去除单价乙型肝炎疫苗中的铝佐剂、甲醛和硫柳汞等不良成分，安全性提高；兼用卡介苗的强免疫佐剂作用，既增强体液免疫，又增强细胞免疫，使其效果优于单价乙型肝炎疫苗的效果。该联合疫苗采用皮内接种，以低剂量达到相同或超过其它途径高剂量接种的效果。
文档编号A61P31/00GK1460521SQ0312706
公开日2003年12月10日 申请日期2003年6月6日 优先权日2003年6月6日
发明者金立杰, 杨丽华, 陈万革, 王志, 赵小琳, 郑晓丽, 王洪飞, 于爱东, 孙俊业, 邹福学, 刘延明, 王玉武, 周长军, 李德娟, 杨彤, 乔宏雷, 刘艾红, 于漫轮, 罗璇, 蔡岩, 李利, 袁丽 申请人:长春生物制品研究所