肺病的治疗与预防的制作方法

专利名称：肺病的治疗与预防的制作方法
技术领域：
本发明涉及在肺部炎症之前或期间预防破坏肺组织的药用组合物以及制备和使用这种组合物的方法。
背景技术：
内源降解酶例如脂酶和蛋白酶起破坏侵入生物、抗原-抗体复合物以及某些对该生物不再必需或有用的脂类和蛋白质的作用。在正常活动的生物中，以有限的量产生这样的酶，且通过抑制剂的合成来部分调节这样的酶。
酶和其抑制剂之间平衡的破坏可导致酶介导的组织破坏。在包括炎症、肺气肿、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节炎、肾小球肾炎、牙周炎、肌营养不良、肿瘤侵袭以及其他不同病理学疾病的种种疾病中，可发生这样的破坏。在某些情况下，例如严重的病理学过程例如败血症或急性白血病，由于从分泌细胞释放出酶，因而游离存在的蛋白酶量增加。在存在这样异常情况的生物中，如果不采取措施来控制降解酶的作用，则可发生对该生物的严重损害。
人的肺构成哺乳动物身体体积的6％，且由许多的小气囊——肺泡组成。肺的主要作用是促进体循环的气体交换。因此，肺泡是被丰富的毛细血管网充满的，该毛细血管网即促使混合的静脉血穿过肺上皮和内皮屏障与肺泡新鲜气体进行气体交换的毛细血管网。肺泡膜具有大于100m2的表面总面积，且厚度小于1μm。引起肺泡膜屏障破坏的疾病或病症可导致液体漏到肺泡中，结果是肺功能的丧失。
例如，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是用来表示不同病因学的、与气体交换严重紊乱(尤其是动脉低氧血)有关的许多急性弥散性浸润肺损害的描述性表达方式。ARDS常常与一种“漏性”毛细管反应有关。因为与婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)共有的许多临床特征和病理学特征，所以使用表达方式“急性呼吸窘迫综合征”。虽然IRDS与肺表面活性物质的缺少有关，但ARDS却与肺表面活性物质的功能障碍有关。50-60％的死亡率(综述于Schuster Chest 1995，1071721-26)，ARDS患者的预后是令人不快的。
为了预防或治疗肺病，可通过支气管肺泡灌洗步骤、通过经由气管的液体快速浓注给药或用气雾剂药物溶液(例如通过用一个喷雾器)及后来吸入含有该药物的气雾剂小滴，将药物直接递送到生病的组织。然而，即使在操作员把药物溶液送到肺之处，对于该药物或其给予将是如何有效，也有相当大的不确定性。例如，药物可以以高浓度存在于某些区域而其他区域几乎不接受到药或没有药；由于破坏或吸收到血管系统中，药物在肺里的半存留期可能是相对短的。也有药物气雾剂化的效果问题。经由喷雾器的喷雾作用可使药物降解；或由于氧化而可使药物失活。关于保持有效剂量达一段延续时期而对宿主之肺或其他器官没有有害影响的能力，也有不确定性。是否以干粉形式为递送而配制的蛋白将保持其生物学活性，也是不可预言的。
已通过肺给药来递送包含某些低分子量药物的药用组合物，最值得注意的是用β-雄激素拮抗剂来治疗哮喘。其它非蛋白质的低分子量化合物，包括皮质类固醇和色甘酸钠，已通过肺吸收而被全身地给予。然而，不是所有的低分子量药物都能通过肺而被有效地给予。例如，对于全身作用的氨基糖苷抗生素、抗病毒药物以及抗癌药物的肺给予，已获得各式各样的成功。在某些情况下，发现药物是刺激性的和支气管收缩性的。因此，即使用低分子量的物质，也根本不可预言这样化合物的肺递送将是一种有效的给药方式。通常参见Peptide and Protein Drug Delivery，ed.V.Lee，Marcel Dekker，N.Y.，1990，1-11页。药物它本身的各种内在因素、药用组合物、递送装置、且尤其肺、或这些因素的组合，可影响肺给药的成功。
因此，为了治疗肺病，目前现有组合物和方法的改进是必需的。
发明概述本发明总体上涉及治疗肺病的组合物和方法。所述组合物包含至少一种肺表面活性物质性多肽以及至少一种在炎症期间有活性的组织破坏介质的抑制剂。炎症期间有活性的破坏组织的介质包括由哺乳动物身体产生的作为炎性反应一部分且能损害或破坏哺乳动物组织的任何化合物、酶或其他因子。这样的破坏组织之介质的实例包括蛋白酶、脂酶、氧化剂等。这样介质的抑制剂可例如是蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、脂酶抑制剂或磷脂酶抑制剂。
在一个方面，本发明包括一种包含肺表面活性物质性多肽和至少一种蛋白酶抑制剂的组合物。在该组合物中，也可包括脂酶抑制剂、磷脂酶抑制剂和/或抗氧化剂。可通过支气管肺泡灌洗、高浓度液体滴注(bolus liquid drip)或吸入等，把这组合物直接给予肺。
在另一个方面，本发明包括一种通过吸入而递送活性剂给患者的气雾剂化组合物。该组合物可包括含至少一种表面活性物质性多肽和至少一种蛋白酶抑制剂的气雾剂颗粒。在该组合物中也可包括脂酶抑制剂、磷脂酶抑制剂和/或抗氧化剂。
用于本发明组合物和方法中的蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂、磷脂酶抑制剂和抗氧化剂可以是本领域技术人员可得到的这样的任何抑制剂或任何抗氧化剂。
在某些实施方案中，该蛋白酶抑制剂是Kunitz抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂。例如，该蛋白酶抑制剂可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、凝血因子XIa、凝血因子IXa、胶原酶、组织蛋白酶G、人白细胞弹性蛋白酶或人分泌性白细胞蛋白酶。蛋白酶抑制剂可例如是人白细胞弹性蛋白酶抑制剂、α1-蛋白酶抑制剂、人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、胶原酶抑制剂、组织蛋白酶G抑制剂、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、C-反应蛋白、快反应型弹性蛋白酶抑制肽或其组合。在某些实施方案中，该蛋白酶抑制剂包括含SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21或SEQ ID NO22的多肽。
在某些实施方案中，所述脂酶抑制剂是磷脂酶A2的抑制剂。该脂酶抑制剂也可例如是对溴苯甲酰甲基溴、thielocin A1β、脂皮质蛋白、膜联蛋白I或响尾蛇(Crotalus)磷脂酶A2的抑制剂。
抗氧化剂可例如是过氧化氢酶、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、丙环司坦或α-生育酚。示范性的抗氧化剂也包括EUK134。
正如上面所描述的，用于肺给药的组合物包含肺表面活性物质性多肽。所述肺表面活性物质性多肽可以有由式(ZaUb)cZd表示的、具有交替性疏水氨基酸残基和亲水氨基酸残基区之氨基酸序列的大约10个至大约60个氨基酸残基，式(ZaUb)cZd中，Z是亲水氨基酸残基，U是疏水氨基酸残基，“a”是约1-5的整数，“b”是约3-20的整数，“c”是约1-10的整数且“d”是约0-3的整数。所述抑制剂和/或抗氧化剂可占该制剂干重的1％-80％，一般可占制剂干重的2％-50％。
在示范性的肺表面活性物质性多肽中，Z是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸和/或3-羟脯氨酸；而U是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和/或α-氨基脂族羧酸；所述α-氨基脂族羧酸则例如α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
一类表面活性物质——蛋白质具有序列
KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO1)，KLLLLLLLLKLLLLLLLLKLL(SEQ ID NO2)，KKLLLLLLLKKLLLLLLLKKL(SEQ ID NO3)，DLLLLDLLLLDLLLLDLLLLD(SEQ ID NO4)，RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR(SEQ ID NO5)，RLLLLLLLLRLLLLLLLLRLL(SEQ ID NO6)，RRLLLLLLLRRLLLLLLLRRL(SEQ ID NO7)，RLLLLCLLLRLLLLCLLLR(SEQ ID NO8)，RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL(SEQ ID NO9)，或RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLR(SEQ ID NO10).
用于肺给药的组合物可包含一种表面活性物质混合物，该表面活性物质混合物即(i)干重50％-95％的磷脂、(ii)干重2％-25％的、有效促进磷脂在肺表面衬层内掺入与分布的铺展剂和(iii)干重0.1％-10％的肺表面活性物质性多肽的表面活性物质混合物。
在具体的示范性实施方案中，表面活性物质混合物中的磷脂包括摩尔比在4∶1和2∶1之间的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)。一种示范性的铺展剂是具有至少10个碳原子的脂肪酰基链长的脂肪酸或脂肪醇，例如棕榈酸或十六烷醇。
在由液体混悬剂产生气雾剂颗粒时，可将表面活性物质制剂悬浮为水性气雾剂小滴。在颗粒呈干粉状态时，颗粒是脱水的或大体上脱水的。所述气雾剂颗粒可具有1-5μm大小范围的平均中位空气动力学直径。
本发明也提供治疗哺乳动物肺部炎症的方法，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的包含蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂和抗氧化剂的组合物。虽然本领域技术人员可选择将该组合物直接给予肺组织(例如通过支气管肺泡灌洗、高浓度液体滴注或气管内给予)，但也可通过其他途径例如经由给药的非肠道途径、口服途径或静脉内途径，给予该组合物。当采用肺给药时，在所述组合物中包括至少一种肺表面活性物质性多肽。
用本发明方法治疗的肺部炎症可伴有例如肺动脉血压过高、新生儿肺动脉血压过高、新生儿支气管肺发育不良、慢性阻塞性肺病、急性支气管炎、慢性支气管炎、肺气肿、细支气管炎、支气管扩张、放射性肺炎、过敏反应、局限性肺炎、急性炎性哮喘、急性烟雾吸入、肺的热损伤、变应性哮喘、医源性哮喘、囊性纤维化、肺泡蛋白沉积症、α-1-蛋白酶缺乏症、肺部炎性疾病、肺炎、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、特发性呼吸窘迫综合征或特发性肺纤维化。
在另一个方面，本发明包括将活性剂例如蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂给予患者的方法。给予方法可以是支气管肺泡灌洗、液体快速浓注给药或吸入。该方法包括把所述活性剂掺入到由(i)干重50％-95％的磷脂、(ii)干重2％-25％的、有效促进磷脂在肺表面衬层内掺入与分布的铺展剂和(iii)干重0.1％-10％的肺表面活性物质性多肽组成的表面活性物质混合物中。最后一种组分包含介于10-60个的氨基酸残基，且有由式(ZaUb)cZd表示的、具有交替性疏水氨基酸残基和亲水氨基酸残基区的氨基酸序列，式(ZaUb)cZd中，Z是亲水氨基酸残基，U是疏水氨基酸残基，“a”有1至5的平均值，“b”有3至20的平均值，“c”为1-10且“d”是0至3。所得到的制剂包含干重1％-80％或2％-50％的活性剂。
可把所述制剂转变成颗粒组合物，该组合物的颗粒具有1-5μm的平均中位空气动力学直径。按治疗有效量，将所述颗粒以气雾剂组合物的形式给予到患者的呼吸道。
在某些实施方案中，所述制剂是一种通过支气管肺泡灌洗给予或通过直接高浓度大剂量给药例如经由气管给予的水性制剂。在另一个实施方案中，通过用一种溶剂溶解或悬浮该活性剂和制剂的其他组分，来制备所述制剂；该溶剂可以是水性溶剂、有机溶剂或混合溶剂。在有效产生具有所希望的大小范围1-5μm平均中位空气动力学直径(MMAD)的干燥颗粒的条件下，通过喷雾干燥该混合物，可把所述制剂转变成用于气雾剂给药的颗粒组合物。在其他的实施方案中，通过冻干液体组合物至干燥，且粉碎干燥了的混合物而产生所希望大小范围的干燥颗粒，则可把该制剂转变成用于气雾剂给药的颗粒组合物。
可通过支气管肺泡灌洗或高浓度大剂量给药，直接将液体(例如含水的)组合物给予肺。可通过以气雾剂形式吸入，来给予液体或干的颗粒。该制剂也可以为含水悬浮液，例如脂质体悬浮液，它被气雾化而形成已悬浮了制剂粒子的液滴。
当连同附图一起地阅读下面的发明详述时，本发明的这些及其他目的及特征将变得更显而易见的。
附图简述图1是一张阐明用于实施本发明某些方面的不同操作步骤之间关系的流程图。
图2A和2B阐明另外的、在本发明中可实施的操作步骤。
图3A和3B是无定形脂肪体(3A)和结晶脂肪体(3B)的显微照片。
图4A和4B阐明用(+)和没有用(-)表面活性物质递送的药物于零时的沉积与铺展(图4A)；以及不同时间下，铺展对增强肺中细胞摄取和渗透能力的影响(图4B)。
图4C阐明本发明的各种递药优点是如何达到的。
图5A是一抑制曲线，绘制了加入到标准量(0.125μg)人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)中的已知丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂的log值与所述混合物的相应OD410的关系。
图5B显示从ARDS患者回收的BAL液的量和弹性蛋白酶活性比色分析中OD410之间的剂量反应。
图6A显示了取自用3mg抗BSA/kg(兔子6098和6099)或5mg抗BSA/kg(兔子6100-6103)气管内滴注处理以及另外用10mg BSA静脉内处理(6098-6101)后6小时的兔子肺的BAL液中的弹性蛋白酶活性(斜线棒形图)。为了比较，也显示了在加入100μg/ml已知丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂之后，在这些BAL液中的弹性蛋白酶活性(交叉影线棒形图)。弹性蛋白酶活性以410nm下产生相应OD的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的浓度来表示。
图6B显示人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)活性被来自经历了肺损伤兔子的支气管肺泡灌洗(BAL)液抑制。气管内地给予兔子细菌脂多糖(LPS)和抗BSA(所有动物)之后3小时(兔子6315和6316)或6小时(6313、6314、6317和6318)，从兔子获取所述BAL液；动物6317和6318还在3小时之时另外接受了10mg/kg的BSA。单独测定BAL液(交叉影线棒形图)，或在加入1μg/ml HNE之后测定BAL液(交叉影线棒形图)。空心棒形图表示没加BAL液的HNE活性。在动物6317中存在显著的游离弹性蛋白酶；所有其他动物都显示出存在弹性蛋白酶抑制剂。
图7A显示正常兔子(组5)或用细菌脂多糖(liposaccharide)(LPS)和肉豆蔻酰佛波乙酸酯(PMA)损伤兔子(组1)的最终灌洗液(损伤后6小时)中的蛋白平均值，以及用模型表面活性物质混合物(组2)、一种已知的丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂(组3)或混合的模型表面活性物质混合物与该丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂(组4)同样处理的兔子的最终灌洗液(损伤后6小时)中的蛋白平均值。对于所用的量和处理时间，查看实施例8。误差棒形示SEM。组3中的一只动物具有异乎寻常高的蛋白值，用大的误差线反映这；且这结果歪曲了这个组的蛋白值，使其比应有的值偏高。除去这异常值，则能产生组3的平均值1.72。
图7B是得自用LPS/PMA诱发肺损伤的兔子的BAL液的蛋白质印迹分析图。用针对基底膜蛋白的抗体来检测基底膜蛋白是否存在于这些BAL液中。第一(最左边的)道包含作为对照的、大小范围约80000kDa和更大些的基底膜蛋白。低分子量(大约10000)的基底膜蛋白以及较高分子量的基底膜蛋白，存在于只用LPS和PMA处理的兔子的BAL液中(第二道、组1)。当用模型表面活性物质混合物(组2)、一种丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂(组3)、以及模型表面活性物质混合物与丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂两者(组4)处理LPS/PMA损伤的兔子时，出现稍微少些量的基底膜蛋白。未损伤的正常兔子的灌洗液几乎没有或没有低分子量的基底膜蛋白(最右侧图，组5)。组1至组4中的以70000MW出现的宽大之带是作为所用抗血清的污染物而存在的白蛋白。大于90000MW的带是基底膜特异性的，且不存在于正常兔子的血浆中(未显示的数据)。低分子量(＜10000MW)的带表示基底膜的片断。
图7C显示用LPS和PMA损伤且以不同方式处理的动物的最终灌洗液(损伤后6小时)中的红细胞(PBCs)平均数。用来自正常兔子组(组5)的两只没接受过处理的动物作对照。用LPS和PMA(组1)损伤的而没接受过进一步处理的兔子有最高的红细胞数。用模型表面活性物质混合物(组2)处理的LPS/PMA损伤之兔更是几乎没有红细胞。用丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂(组3)或模型表面活性物质混合物与弹性蛋白酶抑制剂(组4)处理的那些兔子，在其灌洗液中甚至更几乎没有红细胞。
图8显示已知量的HNE(0.02μg)被模型表面活性物质混合物(终浓度2mg/ml)、一种已知的丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂(100μg/ml)或模型表面活性物质混合物和该丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂两者一起所抑制。
图9显示实施例12中所描述的处理组的最终灌洗液中的弹性蛋白酶抑制程度。
图10阐明磷脂酶A2(PLA2)存在于来自肺损伤之兔的灌洗液中，所述肺损伤之兔即经历由于气管内给予抗-BSA抗体而诱发的肺损伤的肺损伤之兔。由PLA2底物——棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)释放出油酸量(峰高)作为时间的函数而被作图。正如所显示的，从0至大约40分钟，释放出的油酸量迅速增加。
图11图释了分离自动物之最终灌洗液中的磷脂酶A2(PLA2)活性的大小，所述动物即接受过2.5mg/ml抗-BSA抗体(动物6011和6012)、5.0mg/kg抗-BSA抗体(动物6013和6014)或12.5mg/kg抗-BSA抗体(动物6015和6016)的动物。正如所图解的，如果动物接受过增加量的抗-BSA抗体，则最终灌洗液中的磷脂酶A2(PLA2)的活性增大。
图12图释了在分离自动物之最终灌洗液中存在的亚麻酸(交叉影线棒形图)和亚油酸(斜线棒形图)的量，所述动物即接受过2.5mg/ml抗-BSA抗体(动物6011和6012)、5.0mg/kg抗-BSA抗体(动物6013和6014)或12.5mg/kg抗-BSA抗体(动物6015和6016)的动物。灌洗液中游离脂肪酸(亚麻酸和亚油酸)的存在表明磷脂酶A2(PLA2)在这些动物受损伤的肺组织中是有作用的。而且正如所图解的，在接受过较大量抗-BSA抗体的动物体中，游离脂肪酸的量增加。
图13图解地阐明通过添加一种PLA2抑制剂而以剂量依赖方式降低灌洗液中的PLA2活性。正如所显示的，POPG底物与灌洗液(得自兔子6015)一起温育，30分钟后，由POPG底物的油酸释放与抑制剂LY311727的量成反比。换言之，由于添加了增加量的抑制剂，因而观测到PLA2活性的下降。
图14图解地阐明作为抑制剂浓度之对数的函数的、来自BAL液的PLA2活性。正如所显示的，当抑制剂浓度增加时，BAL液的PLA2活性显著地下降。
发明详述本发明涉及包含肺表面活性物质性多肽与炎症期间发生的组织破坏过程的各种类型抑制剂之组合的组合物。可以包括其他成分例如磷脂和铺展剂，来促进所述组合物在肺中的递送和分散。
定义除非另有说明，否则下面的术语具有下述含义。
“氨基酸”是指组成蛋白的氨基酸残基。氨基酸通常呈天然的L-型，然而，也预期供本发明之用的D-氨基酸、取代的氨基酸(例如具有侧链修饰基团的氨基酸)、氨基酸代谢物和分解代谢物、具有“反向”(″retro″)主链的氨基酸以及氨基酸的模拟物或类似物；且本发明因此包括它们。与标准的多肽名称(J.Biol.Chem.，2433557-59，1969)一致，较常用氨基酸残基的缩写是正如下面对应表中所显示的对应表
应该注意，除非另有说明，本文中由组成式表示的氨基酸残基序列按氨基末端到羧基末端的常规方向而具有从左到右的定向。另外，广义地定义短语“氨基酸残基”包括对应表中列举的氨基酸以及修饰的氨基酸和罕见的氨基酸，例如在37C.F.R.§1.822(b)(4)中列举的那些氨基酸；且通过引用将其结合到本文中。同样，广义地定义短语“氨基酸残基”包括D-氨基酸、取代的氨基酸(例如具有侧链修饰基团的氨基酸)、修饰的氨基酸(例如氨基酸的代谢物、分解代谢物和具有“设计”侧链的氨基酸)以及氨基酸的模拟物或类似物。
而且应该注意，在氨基酸残基序列开端或末端的短划线通常表示与基团或者另外一个或更多个氨基酸残基序列的一个键，所述基团例如分别在氨基末端和羧基末端的H和OH(氢和羟基)。另外应该注意，在残基序列右手端的斜线(/)表示序列续接下一行。
“药学上可接受的”是涉及当给予人时不产生变应性反应或类似副反应之组合物的术语。
“蛋白”或“多肽”或“肽”是由氨基酸或氨基酸类似物亚单位(一般为在生物蛋白存在的20种常用L-氨基酸里的某些或全部)组成的、通过亚单位间肽键或者与酶-底物相互作用或受体结合配体相互作用一致的亚单位间其它键连接的生物聚合体。蛋白质具有由其亚单位序列表示的一级结构，且可有螺旋或褶的二级结构以及总体的三维结构。虽然“蛋白”通常是指相对大的、例如包含30个或30个以上氨基酸的多肽，而“肽”或“多肽”通常是指较小的多肽；但在本文中也可交换地使用这些术语。即，术语“蛋白”可以是指较大的多肽例如大于30个氨基酸的多肽，但不一定排除较小的多肽；而术语“多肽”可以是指较小的肽例如小于30个氨基酸的肽，但也可以包括较大的蛋白。
“表面活性物质的活性”是指例如有机分子、蛋白质或多肽的任何物质当与脂质(或者单独，或与其它有机分子联合在一起的)混合时，降低在气/水分界面的表面张力的能力。通过一种体外分析，可用一台Wilhelmy Balance或脉动气泡表面活性物质测量仪(surfactometer)来进行测定。查看例如King等(Am.J.Physiol.223715-726(1972))的那分析或本文中阐明的分析；该分析利用当使蛋白质或多肽与磷脂混合时的、在气-水分界面的表面张力测定。另外，可容易地进行在进入肺的空气的给定压力下应变性或气流量的体内测定，像Robertson(Lung，15857-68(1980))的分析之类的。在这分析中，把待评定的样品经由气管内地给予用Caesarian切开术早产接生的胎兔或羔羊。(这些“早产儿”缺乏它们自己的肺表面活性物质，而靠通气机帮助它们)。肺应变性、血液气体和通气机压力的测定则提供活性的指标。正如本文中所报道的，Revak等(Am.Rev.Respir.Dis.，1341258-1265(1986))详细描述了表面活性物质活性的体外分析(按降低脉动气泡的表面张力的能力来评定这种活性)和体内分析(利用胎兔)。
“表面活性物质分子”是指具有表面活性物质活性的有机分子，且正如通过降低ΔP值而证明的，当其与药学上可接受的脂质混合时，和单独的脂质相比，形成具有较大表面活性物质活性的表面活性物质。
“天然的肺表面活性物质”是指内衬在成熟哺乳动物肺的肺泡上皮的肺表面活性物质(PS)。天然或天生的PS已被称作“脂蛋白复合体”，因为它既包含磷脂又包含在肺的气-液分界面通过相互作用而减小表面张力的脱辅基蛋白。天然的表面活性物质包括几种脂质，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)是其中的主要组分。至少四种蛋白一般是以天然肺表面活性物质——SP-A、SP-B、SP-C和SP-D的形式存在的。至于这四种蛋白，SP-B和SP-C是性质不同的、低分子量的、相对憎水的蛋白，已经证实它们增强表面活性磷脂混合物的表面活性特性，推测其作用机理是促进脂质从体相层状结构转移到气/水界面，此外呼气时还稳定脂质单层。SP-B的结构是罕见的，因为带电荷氨基酸(多数为碱性的)以相当有规律的间隔位于另外疏水残基的范围内。对于由天然SP-B序列的残基59-80组成之域，已证明这些带电基团对生物学活性是必需的。另外，效法这疏水-亲水域的天然肽和合成肽，当其与DPPC和PG结合时，显示出良好的表面活物质活性。
天然表面活性蛋白质是以片层体形式贮藏在肺上皮细胞中的，而在输出之后，在气-水分界面产生单层分子前，它则经历结构转变，形成片状髓磷脂。已有人提出，表面活性物质蛋白SP-A、SP-B和SP-C可以促进这些构造转变，并且在肺泡伸缩期间稳定该脂单层；然而，目前缺乏对分子水平上脂质-蛋白质相互作用的完全了解。
“肺给药”是指递送药用活性物质至肺的任何表面的任何给药模式。递药模式可以包括但不限于适于气管内给药的模式，即，一般作为液体悬浮液滴注液、干粉“尘”或者吸入剂、或气雾剂。肺给药既可以用来局部递送药用活性物质，也可用来系统递送药用活性物质。
“跨肺表面转运”是指穿透或渗透肺暴露表面的任何传送模式。这包括经过包括肺泡表面(在此发生换气)、支气管表面在内的任何肺表面的传送，以及这些表面之间的传送。传送可以是直接传送至肺组织进行局部作用，或者经由肺组织进入循环系统进行系统作用。
“磷脂”是指由非极性疏水尾甘油或鞘氨醇部分和极性头构成的两亲性脂质。非极性疏水尾通常是饱和或不饱和脂肪酸。极性头具有通常连接于含氮碱基的磷酸基。
“铺展剂”意指促进磷脂掺入和分布在肺表面衬层内的化合物，即促进磷脂撒开在肺衬层表面的空气/液体界面的化合物。
“活性剂”是指被给予而达到所需治疗或诊断结果或目的治疗或诊断化合物。药用活性剂是指生物活性的合成或天然物质，它可用于治疗医学或兽医病症或创伤，预防医学或兽医病症，或者调节人或动物的生理机能。活性化合物详见下文。
“空气动力学直径”的定义是沉降速度与已表征粒子相同的单位密度的同等球状颗粒的直径。即无论粒子的形状或大小如何，该粒子设想成转化为单位密度的球体。球体的直径即空气动力学直径。因此，空气动力学直径在1-5微米尺寸的粒子具有与直径在1-5微米粒度范围的单位密度的球状粒子同样的空气动力性能。可以利用常规方法，例如级联碰撞、淘析器或者沉降槽，测定粒子的空气动力性能。通常，所使用的测试法是非常类似使用气雾剂所用的测试法。
一批粒子的“平均中位空气动力学直径”是指大量粒子的中位空气动力学直径，即大量粒子的一半是MMAD的或者低于MMAD的，而一半是超过MMAD的。可以用几何标准偏差(GSD)来定义气雾剂粒子的杂分散性。如果所有粒子都是一样的大小与形状，则GSD是1。GSD为3.5，则表示一批非常杂分散的粒子。本发明的气雾剂粒子最好是在产生1和2.5之间的GSD(优选1-2)的条件下形成的。
“模型表面活性物质混合物”或者“Surfaxin″是指用实施例1和2所述的表面活性物质混合物组分而依照本发明制备的表面活性物质混合物。
活性剂可以用本发明的表面活性物质载体来给予治疗肺病的一系列活性剂。这样的疾病包括肺动脉血压过高、新生儿肺动脉血压过高、新生儿支气管肺发育不良、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性和慢性支气管炎、肺气肿、细支气管炎、支气管扩张、放射性肺炎、过敏反应、局限性肺炎、急性炎性哮喘、急性烟雾吸入、肺的热损伤、变应性哮喘、医源性哮喘、囊性纤维化和肺泡蛋白沉积症、α-1-蛋白酶缺乏症、肺部炎性疾病、肺炎、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、特发性呼吸窘迫综合征和特发性肺纤维化。该活性剂可以直接作用于肺组织，或者作用于肺组织内的致病生物。
用来治疗肺炎性疾病的治疗药物包括蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、磷脂酶抑制剂、脂酶抑制剂及其组合。这些药物可以为蛋白质、肽、核酸、多糖、碳水化合物、脂质、糖蛋白以及有机化合物和无机化合物。
按照本发明，蛋白酶在炎症期间可以加剧肺组织损伤。可以在肺组织中或在得自肺部炎症患者或动物模型灌洗液中检测出这样的蛋白酶活性。在取自患有急性呼吸窘迫综合征的患者和肺损伤的动物模型的灌洗液中，可以检测出基底膜蛋白水平的增高。通过本领域可利用的方法，包括检测特定蛋白酶活性、利用蛋白酶-特异性抗体检测抗原性蛋白酶、探测蛋白酶活性的产物等等，可以鉴定出在发炎肺组织中有活性的蛋白酶的类型。
蛋白酶的活性可以受抑制剂调节和控制。蛋白酶抑制剂可通过占据蛋白酶的活性部位而防止正常底物占据从而调节靶蛋白酶的蛋白质分解活性。虽然蛋白酶抑制剂属于几类不相关的结构，但在许多情况下，抑制剂可以具有一个暴露的环(各式各样地称为“抑制剂环”、“反应核心”、“活性部位”或“结合环”)，通过位于该环和所述蛋白核心两侧的残基间的分子间相互作用，使其稳定(Bode和Huber Eur.J.Biochem.204433(1992))。抑制剂和酶之间的相互作用可产生一种稳定复合体，该复合体非常慢地分离，或者释放出未被切割的抑制剂，或者释放出在结合环的易切断键处被切割的、修饰过的抑制剂。
本发明预期在本发明所述组合物和方法中使用任何可得到的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的一个家族——Kunitz抑制剂，则包括胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、纤溶酶抑制剂、凝血因子XIa和凝血因子IXa的抑制剂以及组织蛋白酶G抑制剂。本领域技术熟练人员公认丝氨酸蛋白酶为蛋白酶的另一个家族。丝氨酸蛋白酶包括像弹性蛋白酶(例如人白细胞弹性蛋白酶)、组织蛋白酶G、纤溶酶、C-1酯酶、C-3转变酶(convertase)、尿激酶、纤溶酶原激活物、顶体蛋白、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa和激肽释放酶那样的酶。抑制剂的另一个家族包括金属蛋白酶例如金属蛋白酶1-13的任一种的抑制剂。
因此，本发明组合物和方法中可使用的蛋白酶抑制剂包括例如Kunitz抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂。
包含一种或更多种Kunitz结构域的蛋白酶抑制剂包括组织因子途径抑制剂(TFPI)、组织因子途径抑制剂2(TFPI-2)、淀粉样β-蛋白前体(AβPP)、抑酶肽以及胎盘bikunin。TFPI——一种外源途径抑制剂和天然抗凝血剂，包含三个串连的Kunitz抑制剂结构域。氨基末端的Kunitz结构域抑制凝血因子VIIa、纤溶酶和组织蛋白酶G，第二结构域则抑制凝血因子Xa、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，而第三结构域没有已知的活性(Petersen等，Eur.J.Biochem.125310(1996))。已经表明，TFPI-2是人凝血因子VIIa-组织因子复合物、凝血因子XIa、血浆激肽释放酶和血纤溶酶的酰胺水解和蛋白水解活性的抑制剂(Sprecher等，Proc.Nat′1 Acad.Sci.USA 913353(1994)；Petersen等，Biochem.35266(1996))。
抑酶肽(牛胰蛋白酶抑制剂)是一种广谱Kunitx型丝氨酸蛋白酶抑制剂，已表明它防止凝血级联活化。Davis和Whittington，Drugs 49954(1995)；Dietrich等，Thorac.Cardiovasc.Surg.3792(1989)；Westaby，Ann.Thorac.Surg.551033(1993)；Wachtfogel等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.1061(1993))。抑酶肽可以抑制血浆激肽释放酶或血纤溶酶(Dennis等，J.Biol.Chem.27025411(1995))。胎盘bikunin是一种含两个Kunitz结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Delaria等，J.Biol.Chem.27212209(1997))。Bikunin的各个结构域已被表达，且表明是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血纤溶酶、凝血因子XIa和组织及血浆激肽释放酶的有效抑制剂(Delaria等，J.Biol.Chem.27212209(1997))。
可用于本发明的弹性蛋白酶抑制剂的具体例子包括例如人白细胞弹性蛋白酶抑制剂、快反应型弹性蛋白酶抑制肽、α-1-蛋白酶抑制剂。其他合适的蛋白酶抑制剂包括人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、C-反应性蛋白及其组合。
这些蛋白酶抑制剂的核酸序列和氨基酸序列可在本领域中找到，例如在NCBI数据库中找到。例如，一个人白细胞弹性蛋白酶抑制剂的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为P30740(gi266344)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供该序列(SEQ IDNO14)。
1 MEQLSSANTR FALDLFLALS ENNPAGNIFI SPFSISSAMA41 MVFLGTRGNT AAQLSKTFHF NTVEEVHSRF QSLNADINKR81 GASYILKLAN RLYGEKTYNF LPEFLVSTQK TYGADLASVD121 FQHASEDARK TINQWVKGQT EGKIPELLAS GMVDNMTKLV161 LVNAIYFKGN WKDKFMKEAT TNAPFRLNKK DRKTVKMMYQ201 KKKFAYGYIE DLKCRVLELP YQGEELSMVI LLPDDIEDES241 TGLKKIEEQL TLEKLHEWTK PENLDFIEVN VSLPRFKLEE281 SYTLNSDLAR LGVQDLFNSS KADLSGMSGA RDIFISKIVH321 KSFVEVNEEG TEAAAATAGI ATFCMLMPEE NFTADHPFLF361 FIRHNSSGSI LFLGRFSSP人α-1-抗胰蛋白酶的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为P01009(gi1703025)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供该序列(SEQ ID NO15)。
1 MPSSVSWGIL LLAGLCCLVP VSLAEDPQGD AAQKTDTSHH41 DQDHPTFNKI TPNLAEFAFS LYRQLAHQSN STNIFFSPVS81 IATAFAMLSL GTKADTHDEI LEGLNFNLTE IPEAQIHEGF121 QELLRTLNQP DSQLQLTTGN GLFLSEGLKL VDKFLEDVKK161 LYHSEAFTVN FGDTEEAKKQ INDYVEKGTQ GKIVDLVKEL201 DRDTVFALVN YIFFKGKWER PFEVKDTEEE DFHVDQVTTV241 KVPMMKRLGM FNIQHCKKLS SWVLLMKYLG NATAIFFLPD281 EGKLQHLENE LTHDITTKFL ENEDRRSASL HLPKLSITGT321 YDLKSVLGQL GITKVFSNGA DLSGVTEEAP LKLSKAVHKA361 VLTIDEKGTE AAGAMFLEAI PMSIPPEVKF NKPFVFLMIE401 QNTKSPLFMG KVVNPTQK人bikunin的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为NP 066925(gi10864909)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供该序列(SEQ ID NO16)。
1 MAQLCGLRRS RAFLALLGSL LLSGVLAADR ERSIHDFCLV41 SKVVGRCRAS MPRWWYNVTD GSCQLFVYGG CDGNSNNYLT81 KEECLKKCAT VTENATGDLA TSRNAADSSV PSAPRRQDSE121 DHSSDMFNYE EYCTANAVTG PCRASFPRWY FDVERNSCNN161 FIYGGCRGNK NSYRSEEACM LRCFRQQENP PLPLGSKVVV201 LAGLFVMVLI LFLGASMVYL IRVARRNQER ALRTVWSSGD241 DKEQLVKNTY VL人快反应型弹性蛋白酶抑制肽的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为1FLEI(gi1942680)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供该序列(SEQ ID NO17)。
1 AQEPVKGPVS TKPGSCPIIL IRCAMLNPPN RCLKDTDCPG41 IKKCCEGSCG MACFVPQ与这种人快反应型弹性蛋白酶抑制肽相关的许多氨基酸序列也可在NCBI数据库中找到。例如，人蛋白酶抑制剂3(皮肤来源)与快反应型弹性蛋白酶相关，其登录号为NP 002629(gi4505787)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供这一人蛋白酶抑制剂3的序列(SEQID NO18)。
1 MRASSFLIVV VFLIAGTLVL EAAVTGVPVK GQDTVKGRVP41 FNGQDPVKGQ VSVKGQDKVK AQEPVKGPVS TKPGSCPIIL81 IRCAMLNPPN RCLKDTDCPG IKKCCEGSCG MACFVPQ具有与人快反应型弹性蛋白酶相似序列的抑制剂的另一例子是牛bTrappin-2，登录号为CAA11184(gi2764786)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供这一bTrappin-2的序列(SEQ IDNO19)。
1 QEPVKGQDPV KGQDPVKGQD PVKGQDPVKD QNPVRGQEPV41 KGQDPVKGQD PVKGQDPVKG QEPVKGQDPV KGQDPVKRQG81 RIGGPLLTKP GSCPRVLIRC AMMNPPNRCL RDAQCPGVK121 CCEGSCGKTC MDPQ本发明也设想了将金属蛋白酶抑制剂应用于组合物和方法中。有许多人金属蛋白酶。本发明设想了应用人金属蛋白酶的任何抑制剂。例如，在本发明中可以利用如金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)的抑制剂。人TIMP-1的序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为P01033(gi145850)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供这一人TIMP-1的序列(SEQ ID NO20)。
1 MAPFEPLASG ILLLLWLIAP SRACTCVPPH PQTAFCNSDL41 VIRAKFVGTP EVNQTTLYQR YEIKMTKMYK GFQALGDAAD81 IRFVYTPAME SVCGYFHRSH NRSEEFLIAG KLQDGLLHIT121 TCSFVAPWNS LSLAQRRGPT KTYTVGCEEC TVFPCLSIPC161 KLQSGTHCLW TDQLLQGSEK GFQSRHLACL PREPGLCTWQ201 SLRSQLA人TIMP-2的序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为NP003246(gi4507511)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供这一人TIMP-2的序列(SEQ ID NO21)。
1 MGAAARTLRL ALGLLLLATL LRPADACSCS PVHPQQAFCN41 ADVVIRAKAV SEKEVDSGND IYGNPIKRIQ YEIKQIKMFK81 GPEKDIEFIY TAPSSAVCGV SLDVGGKKEY LIAGKAEGDG121 KMHITLCDFI VPWDTLSTTQ KKSLNHRYQM GCECKITRCP161 MIPCYISSPD ECLWMDWVTE KNINGHQAKF FACIKRSDGS201 CAWYRGAAPP KQEFLDIEDP人TIMP3的序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为NP000353(gi4507513)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供这一人TIMP-3的序列(SEQ ID NO22)。
1 MTPWLGLIVL LGSWSLGDWG AEACTCSPSH PQDAFCNSDI41 VIRAKVVGKK LVKEGPFGTL VYTIKQMKMY RGFTKMPHVQ81 YIHTEASESL CGLKLEVNKY QYLLTGRVYD GKMYTGLCNF121 VERWDQLTLS QRKGLNYRYH LGCNCKIKSC YYLPCFVTSK161 NECLWTDMLS NFGYPGYQSK HYACIRQKGG YCSWYRGWAP201 PDKSIINATD P公众也可以得到其它的人TIMP序列。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。
人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为NP003055(gi4507065)。参见ncbi.nlm.nih.gov的网站。下面提供这一序列(SEQ ID NO23)。
1 MKSSGLFPFL VTLALGTLAP WAVEGSGKSF KAGVCPPKKS41 AQCLRYKKPE CQSDWQCPGK KRCCPDTCGI KCLDPVDTPN81 PTRRKPGKCP VTYGQCLMLN PPNFCEMDGQ CKRDLKCCMG121 MCGKSCVSPV KA因此，本发明提供了可以在本发明的组合物和方法中使用的各种各样蛋白酶抑制剂。
磷脂酶催化从磷酸甘油酯脱除脂肪酸。具体地说，磷脂酶A2(PLA2)在膜磷脂的甘油部分的2位切割酯键，产生等摩尔量的花生四烯酸和溶血磷脂。虽然PLA2优先从磷脂上切割花生四烯酸，但是花生四烯酸是从S1、磷脂酶C和磷脂酶D激活途径的中间体次级产生的。PLA2抑制剂包括诸如对溴苯乙酰溴之类的化学分子。其它PLA2抑制剂包括生物分子，如真菌产生的thielocin A1β(Tanaka等，(1995)Eur J Pharmacol 279143-8)、或脂皮质蛋白或膜连蛋白I(NCBI登录号gi71756；Wallner等，Cloning and expression of human lipocortin，a phospholipase A2 inhibitor with potential anti-inflammatory antivity，Nature 320(6057)，77-81(1986))、或响尾蛇(Crotalus)磷脂酶A2抑制剂(CNF)(NCBI登录号g501050；Fortes-Dias C L等，1994；J Biol Chem26915646-51)。非特异性PLA2抑制剂如糖皮质激素也可以使用。适用于本发明的磷脂酶A2抑制剂也包括LY11-727(Eli Lilly)。
Fortes-Dias C L等(1994；J Biol Chem 26915646-51)已经分离和表征了得自南美响尾蛇(South American rattlesnake)、南非响尾蛇(Crotalus durissus terrificus)血浆的PLA2抑制剂。这种命名为响尾蛇中和因子(CNF)的20-24kDa的蛋白似乎以6-8个寡聚团聚体自身缔合。CNF所中和的响尾蛇毒素仅仅以二聚体有活性，由与PLA2的两种碱性同种型(CB1和CB2)之一缔合的酸性分子(CA)组成。CNF实质上置换了CA，与所述CB分子之一形成稳定缔合。这种置换使响尾蛇毒素的神经毒性、心脏毒性、肌毒性、抗凝性和血小板活化活性失活。
CNF的全长840bp cDNA已从响尾蛇肝组织克隆，该核苷酸序列编码一个19个残基的信号肽和一个181个残基的成熟蛋白，具有16个半胱氨酸，其pI为5.45，在N157有一个可能的糖基化位点。Fortes-Dias指出，该cDNA含有非编码序列，并且缺乏推定的多聚腺苷酸化位点。在抑制剂分析中，该酸性CNF分子也抑制蜂毒活性，并且在血浆中100倍过量时抑制猪胰PLA2。
除蛋白酶抑制剂和磷脂抑制剂之外，本发明的组合物和方法也可以使用抗氧化剂。炎症可以刺激产生大量超氧化物(O2·-)和过氧化氢(H2O2)的多形核白细胞和巨噬细胞(Babior，B.M.等J ClinInvest 52741-744；Halliwell，B.等Free radicals in Biology andMedicine.Oxford N.Y.Clarendon Press，Oxford University Press)。这些自由基的有害效应在铁存在下可以被放大，随后形成其它反应性中间体，如羟基自由基(OH·)。
NADPH氧化酶是一种膜结合电子转移链蛋白，在炎症期间被活化，直接将O2还原为O2·-。超氧化物然后可以被超氧化物岐化酶岐化产生H2O2。超氧化物可以还原过渡金属，包括三价铁(Fe3+)，使其还原为亚铁(Fe2+)。被还原的金属离子然后可以与H2O2反应，产生高度氧化性的OH·自由基物质。羟基自由基已被普通推定为在体内引起对好几种生物分子的显著损伤。
可以被这类氧化性物质损伤的生物分子包括DNA、蛋白质和膜脂。被氧化的DNA可以被片段化。被氧化的蛋白和膜脂其功能可能被降低或改变，并且可能被定向破坏。氧化产物的存在和对肺组织的氧化效应，可以通过测定灌洗液或收集肺组织来检测。例如，可以收集得自对照和受PLS损伤的模型动物的肺组织，并且测试这类氧化物质。正如本文所述，可以气管内给予模型动物(如兔)以细菌脂多糖(LPS)，从而引发和刺激肺部炎症。
得自这种经LPS处理的模型动物的所收集的灌洗液和肺组织，可以以多种方式来分析。例如，DNA损伤可以通过标记组织样品或DNA分离物中的DNA分子末端来评估。片段化的DNA则通过检测组织切片的细胞核中是否存在显著的标记、以及在电泳分离从肺组织分离的被标记DNA之后是否检测到标记的低分子量条带来观察。这种低分子量DNA条带的存在，指示DNA被片段化。通过与已知分子量的DNA标记物进行比较，来评估条带的大小。
可以监测氧化的其它生物标记，包括例如游离铁、总抗氧化剂状况、8-异前列腺烷(isoprostane)(9-Iso-PGF2α)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽水平、乳酸脱氢酶(LDH)、C-反应性蛋白、脂质氢过氧化物酶(LOOH)、髓过氧化物酶、白介素-6(IL-6)、肌酸激酶(CK)、二酪氨酸和8-羟基鸟嘌呤或它们的组合。通过反相HPLC中存在溶血磷脂、即酰基侧链的脂肪酸断裂片段的消失、硫代巴比妥酸(TBA)结合物质产生和共轭二烯烃的产生来测定，肺部膜中的不饱和磷脂在暴露于H2O2时可经历过氧化变化。因此，灌洗液中溶血磷脂、硫代巴比妥酸结合物质、共轭二烯烃等的存在，可以用作被氧化脂质的指标。
为了降低氧化对肺组织的影响，可以在本发明的组合物和方法中加入抗氧化剂。合适的抗氧化剂包括过氧化氢酶、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、丙环司坦、迷迭香叶提取物、α-生育酚、2，4-二氨基吡咯并-[2，3-d]嘧啶、抗坏血酸和类胡萝卜素化合物，例如蛋黄色素(leutein)、玉米黄素、隐黄素、紫黄质、胡萝卜素二醇、羟基胡萝卜素、羟基番茄红素、双阿脲和脱氢隐黄素，包括它们的衍生物。例如，在本发明中可以用抗坏血酸的酯衍生物和类胡萝卜素化合物例如蛋黄色素、玉米黄素、隐黄素、紫黄质、胡萝卜素二醇、羟基胡萝卜素、羟基番茄红素、双阿脲和脱氢隐黄质的酯衍生物。
可以通过任何可利用的途径给予蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂和抗氧化剂，包括胃肠外、肺部、静脉内、皮内、皮下、口服、吸入、经皮(局部)、经粘膜、真皮下、皮下、经真皮或直肠途径。在某些实施方案中，本发明的活性剂通过肺部传递给药，然而，静脉内给药结合肺部传递活性剂，可增大本发明的有益效应。
在本发明的组合物可以包括其它化合物，包括与治疗肺部疾病可配伍或适合于的化合物。可以共同给予的药物包括抗过敏药、消炎药、抗微生物剂(包括抗细菌剂、抗真菌剂和抗病毒剂)、抗生素、免疫调节剂、造血药、黄嘌呤、抗交感模拟胺、粘液溶解剂、皮质类固醇、抗组胺药和维生素。其它实例包括支气管扩张药如沙丁胺醇、盐酸左沙、特布他林、沙美特罗、福莫特罗及其药理学可接受的盐，抗胆碱能药如异丙托溴铵，所谓的“肥大细胞稳定剂”如色甘酸二钠和奈多罗米，皮质类固醇如氟尼缩松、氟替卡松、倍氯米松、布地奈德、曲安西龙及其盐，干扰素如IFN-α、β和γ，粘液溶解剂如N-乙酰半胱氨酸和愈创甘油醚，白三烯拮抗剂如扎鲁司特、孟鲁司特，磷酸二酯酶IV抑制剂，抗生素如阿米卡星、庆大霉素、粘菌素、内源性抗微生物多肽、防御素和妥布霉素，抗病毒剂如利巴韦林，RSV单克隆抗体，VP14637，抗结核药如异烟肼、利福平和乙胺丁醇，以及抗真菌剂如两性霉素B。
肺表面活性物质性多肽所述表面活性物质多肽是包含具有交替的带电荷和不带电荷氨基酸残基区的氨基酸残基序列的多肽。按照本发明，也优选包含具有交替的疏水性和亲水性氨基酸残基区的氨基酸残基序列的多肽。这些组别内的特别优选的表面活性物质多肽的进一步特征为其长度有至少约4个、更优选至少约8个、再更优选至少约10个氨基酸残基、且一般不超过约60个氨基酸残基，然而也设想了更长和甚至全长的天然肺表面活性物质蛋白。
本发明的表面活性物质多肽优选由交替的带电荷氨基酸残基和不带电荷氨基酸残基组构成，以式[(带电荷)a(不带电荷)b]c(带电荷)n来表示，其中“a”的平均值约1-5；“b”的平均值约3-20；“c”的平均值为0-3，“d”为0-3。不仅仅由氨基酸残基构成的有机表面活性物质分子，优选具有以交替的带电荷和不带电荷(或亲水性/疏水性)组成分子组别构成的相似结构。
正如本领域技术人员已知的，主要根据氨基酸侧链的化学物理性质，可以将氨基酸分为不同的类别。例如，某些氨基酸普遍被认为是带电荷、亲水性或极性氨基酸，而其它氨基酸则被认为是不带电荷、疏水性或非极性氨基酸。极性氨基酸包括具有酸性、碱性或亲水性侧链的氨基酸，而非极性氨基酸则包括具有芳族或疏水性侧链的氨基酸。非极性氨基酸还可以进一步细分，其中包括脂族氨基酸。本文所用的氨基酸类别的定义如下“非极性氨基酸”是指其侧链在生理pH下不带电荷、非极性的、一般被水溶性所排斥的氨基酸。基因编码的疏水性氨基酸的实例包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在某些实施方案中，半胱氨酸是一种非极性氨基酸。非基因编码的非极性氨基酸的实例包括t-BuA、Cha、正亮氨酸和/或α-氨基脂族羧酸如α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-甲基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
“芳族氨基酸”是指其侧链含有至少一个具共轭π电子体系的环(芳族基团)的非极性氨基酸。芳族基团可以被诸如烷基、链烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基的取代基以及其它取代基进一步取代。基因编码的芳族氨基酸实例包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。通常遇到的非基因编码的芳族氨基酸包括苯甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
“脂族氨基酸”是指具有饱和或不饱和直链、支链或环状烃侧链的非极性、不带电荷的氨基酸。基因编码的脂族氨基酸的实例包括Ala、Leu、Val和Ile。非基因编码的脂族氨基酸的实例包括Nle。
“极性氨基酸”是指其侧链在生理pH下带电荷或不带电荷、并且在所具有的一个键中两个原子共享的电子对更接近所述原子之一的亲水性氨基酸。极性氨基酸通常是亲水性的，这是指它们具有被水溶液吸引的侧链。基因编码的极性氨基酸的实例包括天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和丝氨酸。在某些实施方案中，半胱氨酸是一种极性氨基酸。非基因编码的极性氨基酸的实例包括瓜氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
“酸性氨基酸”是指其侧链的pK值低于7的亲水性氨基酸。酸性氨基酸通常具有在生理pH下由于丢失氢离子而带负电荷的侧链。基因编码的酸性氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。
“碱性氨基酸”是指其侧链的pK值高于7的疏水性氨基酸。碱性氨基酸通常具有在生理pH下由于与水合氢离子缔合而带正电荷的侧链。基因编码的碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非基因编码的碱性氨基酸的实例包括无环氨基酸鸟氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“可离子化氨基酸”或“带电荷氨基酸”是指在生理pH下可以带电荷的氨基酸。这样的可离子化或带电荷氨基酸包括酸性氨基酸和碱性氨基酸，例如D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-羟赖氨酸、D-鸟氨酸、D-3-羟脯氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-羟基赖氨酸、L-鸟氨酸或L-3-羟脯氨酸。
正如本领域技术人员会认识到的，上述分类并不是绝对的。几种氨基酸表现出不止一种特征性特性，因此可被包括在不止一个类别中。例如，酪氨酸既有非极性芳环，也有极性羟基。因此，酪氨酸具有可被认为是非极性、芳族和极性的几个特征。然而，非极性环占主导地位，因此酪氨酸一般被认为是非极性的。同样，半胱氨酸除能形成二硫键之外，还具有非极性特征。因此，尽管没有被严格分类为疏水性或非极性氨基酸，但在许多情况下，半胱氨酸可以用来赋予肽疏水性或非极性。
以上所述的基因编码的和非基因编码的氨基酸的分类，仅仅是为了说明，而不是可以构成本文所述肺表面活性物质多肽的氨基酸的详尽一览表。可用于制备本文所述肺表面活性物质多肽的其它氨基酸残基，可以例如在下述文献及其中所引用的参考文献中找到Fasman，1989，CRC Practical Handbook of Biochemistry and MolecularBiology，CRC Press，Inc.。氨基酸残基的另一来源可由RSP Amino AcidsAnalogues，Inc.的网站(www.amino-acids.com)提供。本文没有具体提及的氨基酸通常根据与具体鉴定的氨基酸相比其已知的行为和/或其特征性化学和/或物理性质，被分类为上述类别中。
在某些实施方案中，表面活性物质多肽包含具有交替组别的氨基酸残基、以式(ZaUb)cZd表示的序列，其中Z为带电荷氨基酸，而U为不带电荷的氨基酸；“a”的平均值约1-5；“b”的平均值约3-20；“c”为1-10；而“d”为0-3。
在某些实施方案中，Z是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸和/或3-羟脯氨酸，而U是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和/或α-氨基脂族羧酸如α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
在另一实施方案中，本发明的优选多肽具有以式(BaUb)cBd表示的交替组别或氨基酸残基区，其中B为独立选自H、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸和3-羟脯氨酸的氨基酸残基；而U是独立选自V、I、L、C、Y和F的氨基酸残基。在一个优选变化方案中，B是一个来源于胶原蛋白的氨基酸，优选选自5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸和3-羟脯氨酸；“a”的平均值约1-5；“b”的平均值约3-20；“c”为1-10；而“d”为0-3。
在再一实施方案中，本发明的表面活性物质多肽包含以式(BaJb)cBd表示的具有交替组别氨基酸残基的序列，其中B为独立选自组氨酸、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸和3-羟脯氨酸的氨基酸残基；而J是α-氨基脂族羧酸；“a”的平均值约1-5；“b”的平均值约3-20；“c”为1-10；而“d”为0-3。
在相关结构式中包括“J”的各种实施方案中，J是具有4-6个(含4个和6个)碳的α-氨基脂族羧酸。在其它优选变化方案中，J是具有6个或6个以上碳的α-氨基脂族羧酸。在另外的变化方案中，J优选选自α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸和α-氨基己酸。
另一实施方案包括含以式(ZaUb)cZd表示的具有交替组别氨基酸残基的序列，其中Z为独立选自R、D、E和K的氨基酸残基；而U是独立选自由V、I、L、C、Y和F组成的组、由V、I、L、C和F组成的组或由L和C组成的组的氨基酸残基；“a”约1-5；“b”的平均值约3-20；“c”为1-10；而“d”为0-3。
在前述结构式中，Z和U、Z和J、D和U、以及B和J是每次出现时独自选择的氨基酸残基。另外，在上述每个结构式中，“a”的平均值一般为约1-5；“b”的平均值一般为约3-20；“c”为1-10；而“d”为0-3。
在上述实施方案的一个变体中，Z和B是带电荷的氨基酸残基。在其它优选的实施方案中，Z和B是亲水性或带正电荷的氨基酸残基。在一个变体中，Z优选选自R、D、E和K。在一个相关实施方案中，Z优选选自R和K。在另外优选的实施方案中，B选自H、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸和3-羟脯氨酸。在一个优选实施方案中，B是H。在另一优选实施方案中，B是胶原蛋白的构成氨基酸残基，选自5-羟赖氨酸、(δ-羟赖氨酸)、4-羟脯氨酸和3-羟脯氨酸。
在各种公开的实施方案中，U和J优选是不带电荷的氨基酸残基。在另一优选实施方案中，U和J是疏水性氨基酸残基。在一个实施方案中，U优选选自V、I、L、C、Y和F。在另一优选实施方案中，U选自V、I、L、C和F。在再一优选实施方案中，U选自L和C。在各种优选实施方案中，U为L。
同样，在各种实施方案中，B是优选选自H、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸和3-羟脯氨酸的氨基酸。或者，B可以选自来源于胶原蛋白的氨基酸，包括5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸和3-羟脯氨酸的氨基酸。
在本发明的另一实施方案中，带电荷和不带电荷的氨基酸选自经修饰的氨基酸。例如，在一个优选实施方案中，带电荷的氨基酸选自瓜氨酸、高精氨酸或鸟氨酸，这些是例举的几个实例。同样的，在各种优选实施方案中，不带电荷的氨基酸选自α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸和α-氨基己酸。
在本发明的优选实施方案中，术语“a”、“b”、“c”和“d”是表明带电荷或不带电荷残基(或亲水性或疏水性残基)数目的数字。在各种实施方案中，“a”的平均值约1-5，优选为约1-3，更优选为约1-2，最优选1。
在各种实施方案中，“b”的平均值约3-20，优选为约3-12，更优选约3-10，最优选约4-8。在一个优选实施方案中，“b”约为4。
在各种实施方案中，“c”为1-10，优选2-10，更优选3-8或4-8，最优选3-6。在一个优选实施方案中，“c”约为4。
在各种实施方案中，“d”为0-3或1-3。在一个优选实施方案中，“d”为0-2或1-2；在另一优选实施方案中，“d”为1。
所谓“氨基酸残基(例如由Z或U表示的残基)是独立选定的”，是指在每次出现时，选择来自特定组别中的一个残基。也就是说，当“a”为2时，例如由Z表示的每个亲水性残基将独立选择，因此可以包括RR、RD、RE、RK、DR、DD、DE、DK等。所谓“a”和“b”的平均值，是指虽然重复序列(例如ZaUb)中的残基数可以在肽序列内略有不同，“a”和“b”的平均值将分别为大约1-5和大约3-20。
例如，在以下表1中用式(ZaUb)cZd代表名为“KL8”的肽，所述结构式可以写为K1L8K1L8K1L2，其中“b”的平均值为6[即(8+8+2)/3＝6]，“c”为3，而“d”为0。上式的示例性优选多肽示于以下表1中表1
1命名是所示氨基酸残基序列的缩写。
约4-60个氨基酸的其构象可使其与肺泡的相互作用最大化的复合多肽也适用。复合多肽基本上由一个氨基末端序列和一个羧基末端序列组成。氨基酸末端序列具有以上结构式中定义的本发明疏水区多肽或疏水性肽、优选疏水性多肽的氨基酸序列。羧基末端序列具有主题(subject)羧基末端肽的氨基酸序列。
来源于天然表面活性物质(SP)或具有与其相似特征的蛋白质和多肽可用于本发明方法中。值得注意的是，虽然特别优选牛、猪和人的表面活性物质，但是可以使用由任何哺乳动物物种分离的SP。
天然表面活性物质蛋白包括单独存在或与脂质结合的SP-A、SP-B、SP-C或SP-D或它们的片段。优选的片段是SP-B的氨基末端残基1-25。
与这类天然表面活性物质蛋白相关的许多氨基酸可以在NCBI数据库中找到。例如，人肺表面活性物质相关蛋白A1的序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为NP 005402(gi13346504)。参见ncbi.nlm.nih.gov.的网站。以下提供这一人SP-A1的序列(SEQ ID NO25)。
1 MWLCPLALNL ILMAASGAVC EVKDVCVGSP GIPGTPGSHG41 LPGRHGRDGL KGDLGPPGPM GPPGEMPCPP GNDGLPGAPG81 IPGECGEKGE PGERGPPGLR AHLDEELQAT LHDFRHQILQ121 TRGALSLQGS IMTVGEKVFS SNGQSITFDA IQEACARAGG161 RIAVPRNPEE NEAIASFVKK YNTYAYVGLT EGPSPGDFRY201 SDGTPVNYTN WYRGEPAGRG KEQCVEMYTD GQWNDRNCLY241 SRLTICEF人肺表面活性物质相关蛋白A2的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为NP 008857(gi13346506)。参见ncbi.nlm.nih.gov.的网站。以下提供这一人SP-A2的序列(SEQ ID NO26).
1 MWLCPLALNL ILMAASGAAC EVKDVCVGSP GIPGTPGSHG41 LPGRDGRDGV KGDPGPPGPM GPPGETPCPP GNNGLPGAPG81 VPGERGEKGE AGERGPPGLP AHLDEELQAT LHDFRHQILQ121 TRGALSLQGS IMTVGEKVFS SNGQSITFDA IQEACARAGG161 RIAVPRNPEE NEAIASFVKK YNTYAYVGLT EGPSPGDFRY201 SDGTPVNYTN WYRGEPAGRG KEQCVEMYTD GQWNDRNCLY241 SRLTICDF人肺表面活性物质相关蛋白B的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为NP 000533(gi4506905)。参见ncbi.nlm.nih.gov.的网站。以下提供这一人SP-B的序列(SEQ ID NO27)。
1 MAESHLLQWL LLLLPTLCGP GTAAWTTSSL ACAQGPEFWC41 QSLEQALQCR ALGHCLQEVW GHVGADDLCQ ECEDIVHILN81 KMAKEAIFQD TMRKFLEQEC NVLPLKLLMP QCNQVLDDYF121 PLVIDYFQNQ IDSNGICMHL GLCKSRQPEP EQEPGMSDPL161 PKPLRDPLPD PLLDKLVLPV LPGALQARPG PHTQDLSEQQ201 FPIPLPYCWL CRALIKRIQA MIPKGALRVA VAQVCRVVPL241 VAGGICQCLA ERYSVILLDT LLGRMLPQLV CRLVLRCSMD281 DSAGPRSPTG EWLPRDSECH LCMSVTTQAG NSSEQAIPQA321 MLQACVGSWL DREKCKQFVE QHTPQLLTLV PRGWDAHTTC361 QALGVCGTMS SPLQCIHSPD L另外，人SP18(SP-B)表面活性物质蛋白可以按照本发明所述使用。参见例如美国专利5,407,914；5,260,273；和5,164,369，其公开内容引入本文作为参考。
人肺表面活性物质相关蛋白C的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为P11686(gi131425)。参见ncbi.nlm.nih.gov.的网站。以下提供这一人SP-C的序列(SEQ ID NO28)。
1 MDVGSKEVLM ESPPDYSAAP RGRFGIPCCP VHLKRLLIVV41 VVVVLIVVVI VGALLMGLHM SQKHTEMVLE MSIGAPEAQQ81 RLALSEHLVT TATFSIGSTG LVVYDYQQLL IAYKPAPGTC121 CYIMKIAPES IPSLEALNRK VHNFQMECSL QAKPAVPTSK161 LGQAEGRDAG SAPSGGDPAF LGMAVNTTCG EVPLYYI人肺表面活性物质相关蛋白D的氨基酸序列可以在NCBI数据库中找到，登录号为P50404(gi1709879)。参见ncbi.nlm.nih.gov.的网站。以下提供这一人SP-D的序列(SEQ ID NO29)。
1 MLPFLSMLVL LVQPLGNLGA EMKSLSQRSV PNTCTLVMCS41 PTENGLPGRD GRDGREGPRG EKGDPGLPGP MGLSGLQGPT81 GPVGPKGENG SAGEPGPKGE RGLSGPPGLP GIPGPAGKEG121 PSGKQGNIGP QGKPGPKGEA GPKGEVGAPG MQGSTGAKGS161 TGPKGERGAP GVQGAPGNAG AAGPAGPAGP QGAPGSRGPP201 GLKGDRGVPG DRGIKGESGL PDSAALRQQM EALKGKLQRL241 EVAFSHYQKA ALFPDGRSVG DKIFRTADSE KPFEDAQEMC281 KQAGGQLASP RSATENAAIQ QLITAHNKAA FLSMTDVGTE321 GKFTYPTGEP LVYSNWAPGE PNNNGGAENC VEIFTNGQWN361 DKACGEQRLV ICEF一种相关肽是WMAP-10肽(Marion Merrell Dow ResearchInstitute)，其具有序列琥珀酰-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Gln-TrD-Lys-酰胺(SEQ ID NO30)。可供选择的肽是赖氨酸、精氨酸或组氨酸的聚合物，它们与本文所述磷脂混合时可诱导降低表面张力。
在另一实施方案中，本发明的多肽具有这样的氨基酸序列，其复合疏水性(composite hydrophobicity)小于0，优选小于或等于-1，更优选小于或等于-2。多肽符合疏水性值的测定是本领域已知的，参见例如美国专利6,013,619，其公开内容引入本文作为参考。这些疏水性多肽执行SP18之疏水区的功能。因此，在一个优选实施方案中，所述的氨基酸序列模拟SP18的带电荷和不带电荷、或疏水性和亲水性的模式。
然而，应当理解，本发明的多肽和其它表面活性物质分子并不限于具有类似天然SP-B(SP18)的序列的分子。相反，本发明的某些最优选表面活性物质分子除了具有与SP18相似的表面活性物质活性和交替的带电荷/不带电荷(或疏水性/亲水性)残基序列之外，在特定的氨基酸残基序列上与SP18很少相似。
一个公开的本发明的实施方案包括含肽制备物，即21个残基的肽，是人SP-B的模拟物，由以碱基极性赖氨酸(K)残基连接的4个疏水性亮氨酸(L)残基的重复单位组成。这种示例性肽在本文中缩写为“KL4”，具有以下氨基酸残基序列KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO 1).
在一个优选实施方案中，KL4与磷脂二棕榈酰磷脂酰胆碱和棕榈酰-油酰磷脂酰甘油(3∶1)和棕榈酸组合，磷脂-肽水性分散体的名称为“KL4-表面活性物质”，在本文中一般以这种方式提及。KL4-表面活性物质在市场上有售，其名为Model表面活性物质混合物。KL4-表面活性物质中各种实验和临床研究中的功效先前已有报道，例如参见Cochrane等，Science，254566-568(1991)；Vincent等，Biochemistry，308395-8401(1991)；Cochrane等，Am J Rem & Crit Care Med，152404-410(1996)；和Revak等，Ped.Res.，39715-724(1996)。
在本发明的各种实施方案中，多肽∶磷脂的重量比为约1∶5-1∶10,000，优选约1∶7-1∶5,000，优选约1∶10-1∶1,000，最优选约1∶15-1∶100。在一个特别优选的实施方案中，多肽∶磷脂的重量比为约1∶37。
适用于制备本发明的载体表面活性物质组合物的合成多肽，可以用本领域技术人员已知的技术由氨基酸合成。可得到的对许多技术的出色的概述，可以在下述文献中找到关于固相肽合成，J.M.Steward和J.D.Young，SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS，W.H.Freeman Co.，San Francisco，1969，和J.Meienhofer，HORMONALPROTEINS AND PEPTIDES，Vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1983；而关于经典的溶液合成，E.Schroder和K.Kubke，THEPEPTIDES，Vol.1，Academic Press(New York)，1965。
一般而言，这些方法包括连续添加一个或多个氨基酸残基或适当受护的氨基酸序列，以使肽链生长。正常来讲，第一个氨基酸残基的氨基或羧基用适当的可选择性脱除的保护基来保护。关于含反应性侧链的氨基酸(如赖氨酸)，使用一种不同的可选择性脱除的保护基。
实施例1描述了表面活性物质肽的固相合成。简而言之，将受护的或衍生化的氨基酸通过其未受保护的羧基或氨基连接到惰性固相支持体上。然后将氨基或羧基的保护基选择性脱除，混合入该序列中适当受护的具有互补基团(氨基或羧基)的下一个氨基酸，然后在适合与已经连接到固体支持体的残基形成酰胺键的条件下进行反应。然后从这一新加入的氨基酸残基上脱除氨基或羧基的保护基，然后加入下一个氨基酸(适当受护的)，依此类推。在所有所需氨基酸都以适当的序列连接之后，连续或同时脱除剩余的末端基团和侧链基团的保护基(和任何固体支持体)，得到最终的多肽。然后该多肽通过溶于低级脂族醇中进行洗涤，干燥。需要时，干燥的表面活性物质多肽可以用已知技术进一步纯化。
本发明的表面活性物质蛋白和多肽也可以通过重组DNA技术来生产。由植物或动物宿主衍生蛋白分子的方法是本领域普遍知晓的。参见Jobe等，Am.Rev.Resp.Dis.，1361032(1987)；Glasser等，J.Biol.Chem.，26310326，(1988)。一般而言，将编码处于适当启动子和/或信号肽控制之下的所述蛋白或多肽的基因序列插入到供转染宿主细胞用质粒或载体中。可以从细胞培养物中分离已表达蛋白/多肽。
虽然认识到本文所公开的许多有用的多肽如KL4多肽(SEQ IDNO1)包含天然存在的以肽键连接的L型氨基酸，但是也应当理解，包括氨基酸侧链类似物-非酰胺键(如不同的主链)的分子也可显示显著的表面活性物质活性，并且也可能有其它的优势。例如，假若需要构建不易被降解的分子(如用于表面活性物质组合物中)，人们可能希望合成含一系列D-氨基酸的多肽分子。如本文所述，含一系列通过“反向(retro)”主链连接的氨基酸的分子，即具有以羧基末端至氨基末端相反方向构成的内部酰胺键的分子，也更难以降解，因此可用于各种应用中。例如，以下描述了主链中具有“反向”键合的示例性分子 在另一个变体中，人们可能希望构建一种采用更具“刚性”构象的分子，实现这一目的一个方式是在所述氨基酸的α碳原子上加入甲基或其它基团。
如上所述，除CH3基团的其它基团也可以加入到某一碳原子上，亦即本发明的表面活性物质不限于在α碳原子上引入CH3的那些分子。例如，以上所述的任何侧链和分子都可以替代α碳组分上所示出的CH3基团。
本文所用的术语多肽和氨基酸残基的“类似物”和“衍生物”意在包括氨基酸的合成代谢物和分解代谢产物、以及含有不同于在所谓的“天然存在的”L型氨基酸中所通常发现的键合、主链、侧链或侧链基团的分子。(术语“类似物”和“衍生物”在本文中也通常可互换使用)。因此，本文中的术语“类似物”和“衍生物”也包括模拟氨基酸以及具有“设计”侧链的氨基酸的分子即D-氨基酸(即它可以替代具有表面活性物质活性的分子中的一个或多个氨基酸)。
本发明也设想了一类宽范围的、包括具有一种或多种延长的或取代的R或R’基团的有用表面活性物质分子。本领域技术人员根据所公开的内容又应当认识到，人们可以对各个氨基酸、键合和/或链本身作出各种各样的修饰，只要所产生的分子具有本文所述的表面活性物质活性，则将产生落入本发明范围内的分子。
所述组合物可以包括其它组分。例如，本发明的表面活性物质混合物可以包括(i)50-95％干重的磷脂，(ii)2-25％干重的铺展剂，其有效促进磷脂掺入肺表面衬层中，和(iii)0.1-10％干重的肺表面活性物质多肽。如上所述，所述组分可以以干燥形式、溶液或颗粒-悬浮液形式混合，可以在加入治疗药物之前预先配制，或者，可以与所述治疗药物一起配制。
可用于本发明组合物的磷脂包括天然和/或合成磷脂。可使用的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和磷脂酰乙醇胺。示例性的磷脂有磷脂酰胆碱，如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二月桂基磷脂酰胆碱(DLPC)C12:0、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)C14:0、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二植烷酰磷脂酰胆碱、十九烷酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)(C18:1)、二棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(C16:1)、亚油酰磷脂酰胆碱(C18:2))、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酸。
具体来讲，1，2-二酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]、1，2-二酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸]、1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸、1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，其中二酰基可以是对称的、不对称的，并且含有链长为3-28碳且含至多6个不饱和键的各种类型的饱和或不饱和脂肪酸。
一种优选的磷脂是DPPC。DPPC是一种在迄今所检查的所有哺乳动物物种中的主要磷脂。DPPC由气腔隙的上皮细胞(肺泡的2型肺细胞(pneumocyte)，是气道中一种尚未鉴定的细胞)合成。DPPC被分泌到细胞衬层中，且在肺泡上扩展开单分子薄膜。位于空气-细胞衬层界面的DPPC薄膜具有某些特有的性质，可解释其天然功能(1)所述薄膜铺展覆盖所有表面，在压缩时(如呼气时)达到极低的表面张力，从而降低使液体运动到气腔隙中的净力；(2)当气道或肺泡大小减少时，表面张力按比例减小，从而在多种结构之间建立一种压力平衡，以防止塌陷；(3)薄膜由于具有其两性结构，可以与疏水性部分和亲水性部分的形成松散的化学结合，并且由于其具有高压缩性，这些结合在薄膜压缩时可以被断开，从而由所述界面释放出所述的部分；和(4)这些松散的化学结合可以通过加入表面活性物质体系中存在的其它化合物(如PG)来加以修饰，这可改变薄膜上的电荷分布，从而改变由所述薄膜释放出所述部分(以上(3)中提到的)的速率。
在本发明的各种实施方案中，脂质组分是DPPC，它占表面活性物质载体组合物的约50-90％重量。在本发明的另一实施方案中，DPPC包含约50-75％重量的表面活性物质组合物，余量包括不饱和磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油(PG)、三酰基甘油、棕榈酸、鞘磷脂或它们的混合物。在本发明的再一实施方案中，磷脂组分是重量比大约在4∶1-2∶1之间的DPPC和DOPG的混合物。在一个优选实施方案中，磷脂组分一重量比约为3∶1的DPPC和棕榈酰-油酰磷脂酰甘油(DOPG)的混合物。
DPPC和上述脂质及磷脂可以在市场上得到，或者按照本领域众所周知的已经公布的方法来制备。所述混合物的磷脂组分包括一种或多种磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM)。磷脂中的脂肪酰基链优选至少长约7个碳原子，通常长12-20个碳，可以是全饱和或部分不饱和的。
磷脂占表面活性物质混合物的50-95％干重，优选占混合物的80-90％干重。已知磷脂如DPPC当单独给予相对缓慢地被吸收到空气-细胞衬层界面，并且一旦被吸收，则铺展缓慢。
铺展剂的目的是促进表面活性物质-混合物脂质从颗粒形式转变为单层形式，导致沿肺表面铺展和分布。因此，例如，如果将所述表面活性物质制剂以脂质体形式传递到肺部，铺展剂则有效地促进脂质体磷脂在肺表面从脂质体双层转变为平面单层形式。同样地，如果将所述表面活性物质制剂以无定型或晶状脂质颗粒传递到肺部，铺展剂则有效地促进表面活性物质-混合物脂质在肺表面转变为平面单层形式。
示例性的铺展剂包括但不限于与脂质双层或脂质单层形成相适应的非磷脂脂质，但其单独使用时不能支持脂质双层形成。示例性的铺展剂包括溶血磷脂；脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪醇和其它单链脂肪酰基化合物。优选的铺展剂包括烷基链长至少约12个碳原子、优选链长为15-20个碳原子的脂肪酸和脂肪醇。一种优选的铺展剂为棕榈酸，另一种为鲸蜡醇。铺展剂占表面活性物质混合物的2-25％干重，优选占所述混合物的10-15％干重。一种示例性的混合物也含有84.5％干重的DPPC∶DOPG(3∶1)，含有12.75％干重的棕榈酸。
本发明中所使用的铺展剂可以从商业供应商购得。例如，棕榈酸(PA)可以得自Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，Ala.)。铺展剂也可以按照本领域众所周知的已经公布的方法来制备。
在某些实施方案中，所述组合物可以包括Tyloxapol作为铺展剂，它可以几种商品名由各家公司如Sterling-Winthrop和Rohm andHaas购得。Tyloxapol是一种4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯酚与甲醛和环氧乙烷的聚合物。Tyloxapol在人用药用制剂中已经应用超过30年(Tainter ML等New England Journal of Medicine(1955)253764-767)。Tyloxapol相对无毒，并且在1000倍于其它去垢剂溶血的浓度下不会使红细胞溶血(Glassman HN.Science(1950)111688-689)。
治疗方法呼吸系统的许多病症和疾病引起肺表面活性性能降低和炎症。本文所用的术语“呼吸系统病症和疾病”包括涉及肺泡以及通往肺泡的气道的病症和疾病。这样的病症和疾病包括肺动脉血压过高、新生儿肺动脉血压过高、新生儿支气管肺发育异常、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性和慢性支气管炎、肺气肿、细支气管炎、支气管扩张、放射性肺炎、过敏反应、局限性肺炎、急性炎性哮喘、急性烟雾吸入、肺的热损伤、过敏性哮喘、医源性哮喘、囊性纤维化、肺泡蛋白沉积症、α-1蛋白酶缺乏、肺部炎性疾病、肺炎、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、特发性呼吸窘迫综合征和特发性肺纤维化。所述活性剂可以直接作用于肺部组织，或者作用于肺组织内的病原生物。
人们普遍认为，肺表面活性物质的缺乏是早产婴儿呼吸窘迫综合征(RDS)的病因。虽然这种缺乏症不是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发生的原发因素，但它可能在很大程度上引起这种疾病的生理病理反应。RDS是早产婴儿中死亡和残疾的主要病因。另外，据报道每年有大约150,000个ARDS病例，死亡率为60-80％。对触发ARDS的机制仅有部分了解。然而，在由氧中毒引起的许多病例中，综合征由大量氧衍生的自由基和亲核物质如过氧化物、超氧化物、羟基化合物、单线态氧和其它物质引起。自由基诱导的对肺实质的损伤导致炎症和“渗漏性”毛细管反应。这一反应可以发展成为特征为肺顺应性降低、低氧和分流的ARDS。
炎症是伴随呼吸系统疾病并且随局部创伤、细菌感染、病毒感染、过敏和免疫原性反应等等而发生的普遍性的症状。被募集到气道中炎症部位的炎性细胞，特别是白细胞，释放出介质，其可以触发或阻断肺表面活性物质组分分泌，也能破坏肺的上皮细胞衬层，引起胞质组分释放。在后一类介质中，包括丝氨酸蛋白酶，特别是白细胞弹性蛋白酶、磷脂A2和活性氧物质，如超氧化物和羟自由基。例如，囊性纤维化中的气道感染与气道分泌物的异常转运性质有关，这可能决定着疾病的严重程度(E.Puchell等，Eur.J.Clin.Invest.，15389-394，1985)。
本发明的治疗方法使用表面活性物质混合物与蛋白酶抑制剂、磷脂酶抑制剂或抗氧化剂、或上述物质中两种或两种以上的混合物，作为本发明制剂中的活性剂。所述制剂可以是液体制剂，可用于例如支气管肺泡灌洗液、口服、血管内、一次大剂量给药或其它给药。所述制剂也可以雾化用于给予患者。制剂的给药量通常为约1-100mg/剂、5-20mg/剂，如10mg/剂，一剂中活性剂的量为治疗有效量，如约0.01mg至50mg药物，或约0.01mg至5mg药物。实际药物剂量可以如下确定首先计算当制剂在肺中以单层铺展时所需的药物浓度，并且以适量的表面活性物质制剂给予这一剂量。可以根据可能涉及肺部炎症的动物模型和/或对人类肺病炎症患者的临床研究的已知方法，来确定调节所述使疗效最大而使副作用最小的剂量。
在一个实施方案中，本发明设想了一种治疗哺乳动物肺部炎症的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的一种组合物，所述组合物包含蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂。
在某些实施方案中，所述方法涉及通过肺部灌洗给予本发明的组合物。在本领域可得到进行肺部灌洗的方法。例如参见美国专利6,013,619，该专利引入本文作为参考。例如，肺部灌洗可以如下进行a)用呼吸器在哺乳动物肺部，以受调节的压力、优选约4-20cm水，施加终末呼气正压(gas positive end-expiratory pressure)(PEEP)；b)滴注灌洗组合物到一个或多个肺叶或肺段中，所述组合物在药学上可接受的水性介质中含有稀释的表面活性物质；和c)用短间隔的气管-支气管吸引，优选使用约20-100mm汞柱的负压，从肺部除去所产生的肺液。
通常，在滴注步骤(b)之前，优选至多约30分钟，施加预定时间的PEEP，另外，PEEP通常在步骤(b)和(c)期间连续施加，并且在除去步骤(c)之后施加预定的时间，优选至多约6小时。不同的肺段可以独立治疗。
在其它实施方案中，所述组合物可以通过液体大剂量给药法来给予。例如，可以放置气管导管，从而给予肺组织所述组合物滴剂。在某些实施方案中，可以对肺部的一部分进行大剂量给药，而不对另一部分给药，或者肺部的不同部分可以在不同时间通过大剂量滴注给药。
在另外的实施方案中，所述组合物可以吸入给药。在其它实施方案中，所述的蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂和/或抗氧化剂可以口服或胃肠外给药。当设想到口服或胃肠外(非肺部)给药时，所述组合物不需要包括表面活性物质混合物。然而，按照本发明，表面活性物质化合物与抑制剂的组合出乎意料地有效治疗肺病疾病。因此，表面活性物质-抑制剂联合药物可能协同作用，以有益地治疗肺病疾病。
所以，本发明提供载于表面活性物质载体中的蛋白酶抑制剂、用于治疗肺部炎症的药用组合物。
在一个示例性的实施方案中，所述组合物含有人白细胞弹性蛋白酶抑制剂。人白细胞弹性蛋白酶(HLE)是一种嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中存在的蛋白水解酶。在炎性部位被释放后，这种蛋白酶能水解重要结缔组织组分，如弹性蛋白和胶原蛋白。这种酶对其在吞噬坏死组织和微生物中是必不可少的。同时，这种酶对机体施加了相当大的挑战，因为其不受控制的释放可导致健康组织和循环蛋白的破坏。已有人提出，所导致的组织损伤构成了成人呼吸窘迫综合征(Lee，C.T.等，New England J.of Med.，304192-196，1981和肺气肿(Janoff，A.，A.，InINFLAMMATIONBASIC PRINCIPLES ANDCLINICAL CORRELATES，Gallin，J.I.等编著，803-814，Raven Press，New York，1988)的病因。
按照本发明，对肺组织中蛋白酶抑制剂和脂酶的抑制和/或氧化的还原，导致对血管基底膜的损伤减小和蛋白渗漏和出血减少。在平行研究中，用外源表面活性物质进行支气管肺泡灌洗，也减少了对基底膜的损伤、蛋白渗漏和出血。然而，仅用表面活性物质混合物治疗并不能显著抑制蛋白酶或脂酶的活性，也不能提供显著的抗氧化剂活性。按照本发明，用本发明的包含蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂和/或抗氧化剂的表面活性物质制剂治疗肺部炎症，在抑制对基底膜损伤、蛋白渗漏和肺部血管出血方面是有效的。通过最佳减少血管蛋白渗漏和出血，这种疗法也可防止导致肺功能丧失、多种器官功能障碍和30-40％患者死亡的天然表面活性物质失活和肺部产生炎性渗出物。
蛋白酶抑制剂包括弹性蛋白酶抑制剂，如人白细胞弹性蛋白酶抑制剂、人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、α1-蛋白酶抑制剂(或α1抗胰蛋白酶)和其它Kunitz或丝氨酸蛋白酶抑制剂。以上描述了适用于本发明的其它蛋白酶抑制剂。
示例性的抗氧化剂包括EUK134，过氧化氢酶，谷胱甘肽，N-乙酰半胱氨酸、丙环司坦、α-生育酚、抗坏血酸、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、天然flavidins(如2，7-二羟基-9，10-二氢菲并-4，5bcd-吡喃，参见美国专利6,503,552)和这些化合物的衍生物。一种示例性的磷脂酶A2抑制剂是LY11-727(Eli Lilly)。
进行了多个实验，以说明所述药用组合物在抑制蛋白酶活性中的疗效。所述研究首先建立一种用于在兔子和/或人支气管肺泡灌洗(BAL)液中测定弹性蛋白酶活性的测定(实施例3)。用具有人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)活性的样品而得到的比色信号，与410nM下的光密度(OD410)成正比。然后检查弹性蛋白酶抑制剂抑制HNE的能力(实施例4)。混合物的OD410与抑制剂加入量的log值的相关性是线性的，证明HNE活性在体外受所述丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂的抑制。
然后，用所建立的比色测定法，测量从患有ARDS(急性呼吸窘迫综合征)的人和实验诱发性呼吸窘迫的兔子获取的BAL液中弹性蛋白酶活性。图5B显示了BAL量和OD410之间的线性相关性；证明用所述比色测定法可以测定弹性蛋白酶活性，并且弹性蛋白酶存在于患有ARDS的人的BAL液中。
同样对从具有诱发性肺损伤的兔子获取的支气管肺泡(BAL)液进行了比色测定(实施例6)。还在加入100μg/ml丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂之后，对每种BAL液进行了比色测定。图6A显示了单独的BAL液以及加有丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂的BAL液中的弹性蛋白酶活性。弹性蛋白酶活性以给出相应OD410的HNE的浓度来表示。在所有兔子BAL液中都观测到弹性蛋白酶活性，所述6种BAL液的5种中所述活性被所加入的丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂所抑制。由于所加入的丝氨酸弹性蛋白酶是一种已知的HNE抑制剂(实施例4)，所以所测的弹性蛋白酶活性可能是HNE所致。
应当注意到，灌洗液可能含有内源弹性蛋白酶抑制剂。这可能是α1-蛋白酶抑制剂、α2-巨球蛋白、SLPI或另一种弹性蛋白酶抑制剂。这种抑制剂的存在可通过取自诱发性肺损伤兔子的支气管肺泡(BAL)液的体外测定来表明(实施例6)。参看图6A，在气管内给予兔子细菌脂多糖(LPS)和抗BSA(所有动物)之后3小时(兔子6315和6316)或6小时(6313、6314、6317和6318)，从兔子获取BAL液；动物6317和6318在3小时时还接受10mg/kg的BSA，对所提取的BAL液(交叉影线)单独进行测试或与1μg/ml HNE混合后(黑实心条)进行测试。在取自动物6317的BAL液中存在显著量的游离弹性蛋白酶；取自所有其它动物的BAL液显示出存在弹性蛋白酶抑制剂，尤其是HNE抑制剂。因此，兔子BAL液中不存在游离弹性蛋白酶活性，并不表明样品中缺乏弹性蛋白酶，它可以存在但受到抑制。可以进行免疫学测定来进行区别。
用ARDS兔子模型，评估模型表面活性物质混合物、丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂、和这两种的组合对肺部炎症的作用。这些实验在实施例8-12中有详细描述。20只兔子分为5个组用于此项研究。在组1-4的兔子中，通过用细菌脂多糖(LPS)灌洗刺激，并且在3小时之后用肉豆蔻酰佛波乙酸酯(PMA)刺激，诱发肺部炎症。另外，作为治疗，组2兔子接受模型表面活性物质混合物，组3兔子接受丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂，而组4动物接受模型表面活性物质混合物和丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂两者。组5兔子是正常兔子，用作对照。动物在6小时时处死，对右下肺叶灌洗3次，合并每只动物的灌洗液(终末灌洗液)。根据终末灌洗液中发现的基底膜蛋白片段和红细胞的量，测定损伤水平和治疗的效果。
图7A显示出取自肺部损伤动物的终末灌洗液中所存在的蛋白量升高。所发现的蛋白量指示出对基底膜基质损伤的水平，所述所害使血浆蛋白可以渗漏到肺泡空间中；蛋白量越高，则肺部存在的损伤越大。结果表明，由LPS和PMA损伤所引起的蛋白量(约2.5mg/ml)在仅接受模型表面活性物质混合物的组2中减少，在接受模型表面活性物质混合物和弹性蛋白酶抑制剂两者的组4中甚至被进一步减少。仅接受弹性蛋白酶抑制剂的组3没有显示出蛋白水平降低，这可能由于该组中一只动物获取的数值异常高所致。如果排除这只动物，则组3的平均值约等于仅用模型表面活性物质治疗的组2所所得数值。
图7B显示了用豚鼠产生的抗基底膜基质蛋白的抗体对终末灌洗液中所存在蛋白的SDS凝胶分析所作的蛋白质印迹分析。兔子肺部基底膜的蛋白组分示于左图中。仅用LPS和PMA处理、加入模型表面活性物质混合物、加入丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂、以及加入模型表面活性物质混合物和丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂两者的兔子的BAL液中的蛋白组分，分别示于组1至组4的图中。正常、非损伤性兔子的BAL液中的蛋白组分示于组5的图中。在这些图中，高于90,000MW的条带是基底膜特有的，在正常兔子血浆中不存在(数据未显示)。组1-4中70,000MW的大条带是白蛋白，这是所用抗血清中的污染物。低MW条带(＜10,000MW)代表基底膜的片段。观察到基底膜中损伤缓解，并且可以在用模型表面活性物质混合物、弹性蛋白酶抑制剂或这两者组合的处理的动物中可以定量检测到。
动物中损伤水平的另一种衡量指标是终末灌洗液中的出现的出血量或红细胞(RBC)量。存在RBC表明与存在蛋白相比有甚至更大程度的损伤，这种损伤可使完整的红细胞穿过基质中产生的孔。图7C显示了终末灌洗液中的RBC计数。当加入模型表面活性物质混合物时，观察到RBC数略微降低，提示损伤有一定程度的缓解，而当加入弹性蛋白酶抑制剂时观察到损伤有更大的减少。加入模型表面活性物质混合物和弹性蛋白酶抑制剂两者也导致损伤显著减少。
先前已经表明，用氮芥处理耗竭循环嗜中性粒细胞的兔子，并没有显示出暴露于LPS和PMA时有显著的损伤。在终末灌洗液中没有蛋白、RBC和弹性蛋白酶就证明了这一点。(Cochrane，CG等，Am.J.Resp.and Crit.Care Med.，Vol.163139，2001)。这强烈提示了体内弹性蛋白酶来源是嗜中性粒细胞。评估了仅模型表面活性物质混合物、仅丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂和这两者组合抑制人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力。图8显示了弹性蛋白酶抑制剂以及另外存在模型表面活性物质混合物对HNE活性的显著抑制。模型表面活性物质混合物并不干扰弹性蛋白酶抑制剂抑制弹性蛋白酶的能力，其本身也不直接抑制弹性蛋白酶。
通过将BAL液与已知量的HNE一起温育，评估终末BAL液中弹性蛋白酶抑制剂的残留活性(实施例12)。结果示于图9。通过OD410测定，在组2-4中观察到HNE活性的显著降低。HNE活性的降低表明存在一种或多种弹性蛋白酶抑制剂。用取自组3和组4的灌洗液观察到的对弹性蛋白酶抑制是显著的，这些组中的动物通过静脉内途径以及气管内途径接受了已知的弹性蛋白酶抑制剂。然而，在模型表面活性物质混合物组(组2)中观察到的对弹性蛋白酶的抑制，也可能是由于兔子中的内源弹性蛋白酶抑制剂如SLPI或α-1蛋白酶抑制剂或某些组合存在所致。正常兔子(组5)和LPS/PMA阳性损伤动物(组1)在该实验中没有显示出在其终末灌洗液中存在弹性蛋白酶抑制剂。然而，兔子#5541(组1)显示出在终末BAL液中存在游离的弹性蛋白酶；在正常动物的BAL中没有检测(组5)。
上述研究表明，由白细胞释放的弹性蛋白酶是具有诱发性肺部炎症兔子的肺部所观察的蛋白水解损伤的可能根源。急性肺部损伤导致肺部血管基底膜被降解，并且血浆蛋白和红细胞被释放到肺泡间隙中。用模型表面活性物质混合物、或丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂、或这两者的组合治疗，减轻了损伤的程度。因此，认为含有表面活性物质混合物和丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂的药用组合物将成功地预防和治疗肺部炎症损伤。
如上所述，本发明可有利地治疗多种肺病疾病，包括其中涉及炎性组分的疾病。哮喘和相关的支气管收缩疾病可通过给予含支气管扩张药的表面活性物质制剂来有利地得以治疗，所述支气管扩张药如沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗、福莫特罗及其药学上可接受的盐。
肺部细菌感染如支气管炎和结核病，可以用含抗生素作为活性剂的表面活性物质有利地治疗。
囊性纤维化可以通过给予制备用于传递DNA酶的本发明表面活性物质制剂得以有利的治疗。
因此，本发明的组合物也可以包括其它有用的药物。例如，可以包括以下药物支气管扩张药、抗生素、DNA酶、镇痛药或多肽如细胞因子和肽类激素。
改善的分布和摄取这一节描述由上述表面活性物质制剂所提供的、导致药物在肺部分布和摄取改善的因素。药物分布的改善可能由于多种因素综合所致，所述因素包括(1)药物在肺表面的扩展和分散得以改善，事实上，增加了药物可以转移到肺中和透过肺的有效表面积，和(ii)使脂质单层在肺表面稳定，从而在肺表面保持有利的药物运输界面。
图4A和4B描述了有和无脂质铺展剂时在脂质微粒中被递送至肺部的活性剂的沉积和扩展。图4A图示了在存在(+，空心圆)和不存在(-，部分影线圆)铺展的情况下紧接沉积后脂质微粒的大小。随着时间的增加(图4B)，覆盖面积的差异变得更为明显，因为铺展微粒继续在沉积区域扩展、融合，形成大面积覆盖。无铺展时，微粒保持分离且局限，仅在小的局限区域释放其内含物。
给定量的给定大小脂质微粒可以覆盖的总面积，可以容易地根据微粒脂质所代表的总单层面积来计算。举例来讲，10mg 1μm大小的表面活性物质制剂微粒的计算表面积是60cm2，或占肺总表面积的约0.00125％。存在铺展时，微粒中的磷脂分散为单层形式，制剂所覆盖的总表面(这将包括分散于脂质中的活性剂)计算为肺表面的34％。因此，铺展使可用于将药物运输到肺中或穿过肺部的总肺表面增加大约至少4个数量级。
除大大增加药物传递用的肺表面积之外，本发明的表面活性物质制剂还通过稳定所述单层以抵抗压力下塌陷并且使脂质掺入到单层肺表面中而不会使单层去稳定，从而促进更有效的摄取。
图4C描述了这些特征是如何导致细胞摄取活性剂以及被递送到患者肺部区域的活性剂透过增加的。在图左侧，显示了沉积在肺表面的局性部脂质微粒仅有效地覆盖微粒本身的小的表面积。由该微粒递送药物，将受到药物从微粒扩散的速率和/或微粒的溶出率的限制。
图右侧图示了脂质铺展在具有本发明表面活性物质制剂的微粒中的作用。该图意在表明微粒脂质和相连的药物在肺表面的单层/空气界面的大表面积上铺展开来。药物现被分布，以供在大的肺表面积上被立即摄取，通过包括经囊泡、细胞周(paracellular)或跨细胞渗透在内的机制被摄取。囊泡转运是对细胞表面上发生的多种复杂机制的相当不严格的描述。肺泡内的细胞膜产生含药物的囊泡，药物微粒和细胞膜的这种融合可以自发发生。药物，特别是大分子，可以通过这种途径跨越细胞膜转运。在细胞周摄取途径中，活性剂通过上皮细胞间的细胞周空隙扩散，从而被摄取到循环中。跨细胞摄取和渗透包括直接摄入肺上皮细胞、通过肺上皮细胞和在肺上皮细胞外被摄取到循环中。
图3C也显示了药物传递中铺展和单层稳定化如何可以增强对肺部病原体的治疗，在这种情况下是指肺表面的细菌。在无铺展时，脂质微粒可能与病原体微粒接触或不接触。在无铺展时，药物传递仅发生在所述药物接触点或通过药物的扩散而发生。另一方面，脂质铺展也能淹没病原体，使药物在病原体整个外表面被病原体摄取。
上述特征对于给予化合物如蛋白酶或磷脂酶抑制剂和抗氧化剂，以用于治疗肺部炎症尤其有用，在肺部炎症中活性多肽药物需要在肺组织广泛地分布。此外，这些特征可用于治疗影响肺中大部分的肺病，因为所给药物在大的肺表面积上可快速利用。这些特征还可用于给予可能自身不易扩散的多肽和肽。需要渗透到肺中感染部分的抗生素包括肽类抗生素，可以有效地给药，并且在给药后容易有效攻击肺表面的细菌。
组合物本发明的蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂、抗氧化剂和表面活性物质混合物，可以被配制为各种各样可接受的组合物。这样的药用组合物可以多种适合于所选给药途径的形式，即通过灌洗、经口服或胃肠外(静脉内、肌内、肺部或吸入途径)，给予哺乳动物宿主，如人类患者。
在化合物如抗氧化剂和多肽抑制剂或其它化合物具有足够酸性或碱性以形成稳定的无毒酸式或碱式盐的情况下，以盐形式给予这类化合物可能是合适的。药学上可接受的盐的实例是与可形成生理上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。也可形成适宜的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。用本领域众所周知的标准方法，如通过使足够碱性的化合物如胺与提供生理上可接受阴离子的适宜酸，可获得药学上可接受的盐。也可制备羧酸的碱金属(如钠、钾或锂)或碱土金属(如钙)盐。
多肽的药学上可接受的盐包括与无机酸或有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成的)，无机酸如盐酸或磷酸，有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基形成的盐也可以由无机碱和有机碱衍生，无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。
因此，含有蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂的本发明组合物可以结合药学上可接受的溶媒如惰性稀释剂或可同化的食用载体来系统给予，例如口服。它们可包封于硬壳或软壳明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接加入到患者饮食的食品中。对于口服治疗性给药，所述组合物可以与一种或多种赋形剂结合，以可摄入的片剂、口含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等使用。这样的组合物和制剂应当含有至少0.1％的活性化合物。所述本发明和制剂的百分比自然可以有所变动，通常可以是给定单位剂型的大约2-60％重量。这种治疗上有用的组合物中蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂的量使得可获得有效的剂量水平。
所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等也可含有以下成分粘合剂，如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯帕坦，或者可以加入矫味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香料。当单位剂型是胶囊时，除含有上述类型的材料此外，它还可以含有液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可以作为包衣存在，或改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆剂或酏剂可以含有所述活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、着色性矫味剂如樱桃香料或橙香料。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料都应当是药学上可接受的，并且在所用的量下基本无毒。另外，所述活性化合物可以掺入到缓释制剂和装置中。
所述活性化合物也可通过输注或注射静脉内或腹膜内给药。活性剂的溶液可以在水中制备，任选混合有无毒表面活性物质。也可以在甘油、液态聚乙二醇、三醋精和它们的混合物以及在油中制备分散体。在正常贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以防止微生物生长。
适用于注射或输注的药用剂型可以包括无菌水溶液或分散体，或者含有所述活性成分、适合于临时制备无菌注射液或输液或分散体的无菌粉剂，所述活性成分任选包封于脂质体中。在所有情况下，最终的剂型都应当是无菌的液体，并且在生产和贮存条件下是稳定的。液体载体或溶媒可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯以及它们合适的混合物。可以保持适当的流动性，例如通过形成脂质体、就分散体而言维持所需的粒径、或者利用表面活性物质来保持。可以用各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，防止微生物作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖、缓冲剂或氯化钠。可以在组合物中应用延长吸收的原料，如单硬脂酸铝和明胶，可以导致注射用组合物的延长吸收。
无菌注射液如下制备将所需量的所述蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂与上述各种其它需要的成分加入到适当的溶剂中，然后过滤除菌。就制备无菌注射液用的无菌粉剂而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，产生先前经过滤除菌溶液中的所述蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂加上任何附加的所需成分的粉剂。
本发明蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂的有效剂量，可以通过比较其体外活性和动物模型中的体内活性来确定。将小鼠和其它动物的有效剂量外推至人类的方法是本领域已知的；例如参见美国专利4,938,949。
一般而言，本发明的蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂在液体组合物中的浓度为大约0.01-25wt-％或大约0.1-10wt-％。
蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂、或其活性盐或衍生物用于治疗的所需量，不仅随所选的特定盐而变化，而且也随给药途径、待治疗病症的性质以及患者的年龄和病症而有所变化，并且最终由主治医师或临床医师来判断。
然而，一般说来，合适的剂量范围为大约0.1-100mg/kg/日，如大约1.0-75mg/kg体重/日，如1至约50mg/kg受者体重/日，或者为3-90mg/kg/日或5-60mg/kg/日。
所述蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂通常以单位剂型给药，例如每一单位剂型大约5-1000mg，通常10-750mg，大多50-500mg的活性成分。
理想的是，应当给予所述蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂以达到肺病的最佳治疗。当口服、静脉内或胃肠外给药时，所述活性剂的血浆峰值浓度可达到约0.5-75μM或约1-50μM或大约2-30μM。也可以例如静脉内注射0.05-5％的所述蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂的溶液，任选在盐水中的溶液，或者以含有大约1-100mg所述蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂的一次性大剂量口服给药，来达到这一点。可以通过连续输注以提供大约0.01-5.0mg/kg/hr或间断地输注含有大约0.4-15mg/kg的所述蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂，维持理想的血液水平。
所需的剂量通常可以以单一剂量或以适当间隔给予的分剂量提供，分次剂量例如每日两次、三次、四次或更多次。分剂量本身可以再分为例如多个单独的松散间隔的给药；如由吹入器多次吸入或在眼中施用多滴滴剂。
在某些实施方案中，抗氧化剂进入细胞，与反应性氧物质反应，从而降低细胞中反应性氧物质的浓度。在一个可供选择的实施方案中，抗氧化剂进入细胞，或存在于周围胞外环境中，与由反应性氧物质产生的氧化剂反应。
设想用于本发明的蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂可以被直接递送到目的部位(肺部)，达到立即缓解肺部炎症的症状。这种递药可以通过支气管肺泡灌洗、气管内给药、吸入或一次性大剂量给药。在这种情况下，包括所述的表面活性物质混合物。
用于进行肺部灌洗的方法在本领域中是可得到的。例如参见美国专利6,013,619，其内容引入本文作为参考。例如，可以如下进行肺部灌洗a)用呼吸器在哺乳动物肺部，以受调节的压力、优选约4-20cm水，施加终末呼气正压(PEEP)；b)滴注灌洗组合物到一个或多个肺叶或肺段中，所述组合物在药学上可接受的水性介质中含有稀释的表面活性物质；和c)用短间隔的气管-支气管吸引，优选使用约20-100mm汞柱的负压，从肺部除去所产生的肺液。
通常，在滴注步骤(b)之前，优选至多约30分钟，施加预定时间的PEEP，另外，PEEP通常在步骤(b)和(c)期间连续施加，并且在除去步骤(c)之后施加预定的时间，优选至多约6小时。
经吸入递药在本文中有进一步的描述。可供选择的递药方法包括但不限于静脉内、口服、吸入、插管、腔内、肌内、透皮和舌下给药。
本发明的治疗性组合物含有药学上可接受的载体以及作为活性成分分散于其中的上述表面活性物质混合物、蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂或抗氧化剂。在一个优选实施方案中，所述治疗性组合物当给予哺乳动物或人类患者用于治疗时无免疫原性。
含有溶于或分散于其中的活性成分的药用组合物制剂是本领域众所周知的，不需要在配制上受到限定。通常，这样的组合物被制备为注射剂，或为液体溶液或为混悬剂，然而，也可以制备适用于临用前在液体中配制成溶液或混悬剂的固体形式。也可以将所述制剂乳化。
所述活性剂可以与药学上可接受并且可与所述活性剂配伍的赋形剂以适用于本文所述治疗方法的量混合。合适赋形剂例如为水、盐水、葡萄糖、乙醇等等及其组合。另外，如有需要，所述组合物可含有少量增强所述活性成分效力的辅料，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。
典型的液体载体是无菌水溶液，它除活性成分和水之外不含任何材料，或者含有缓冲剂如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或这两者，如磷酸缓冲盐溶液。再者，水性载体可以含有不止一种缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。
在某些实施方案中，液体载体是一种Tham缓冲体系，它可以基本如下制备。用乙酸(AR Select，ACS，Mallinckrodt，Paris，KY)调至pH 7.2±0.5的0.37ml Tham溶液(氨丁三醇注射液，NDC 0074-1593-04，Abbott Laboratories，North Chicago，IL)，与0.33ml盐水(0.9％氯化钠注射液，USP，Abbott Laboratories)和0.30ml水(无菌注射用水，USP，Abbott Laboratories)混合。将溶液经过滤除菌来灭菌。
制备肺部递药用的气雾剂本节考虑了用于生产用于给予表面活性物质制剂至患者肺表面的干粉或液滴气雾剂的方法和装置。
图1提供了加工步骤和本发明制剂的概述。标注“表面活性物质混合物”的框10是指磷脂、铺展剂和肺表面活性物质蛋白的混合物。该表面活性物质混合物可以加工成脂质-小体制剂，如脂质体混悬剂。标注“表面活性物质制剂组分”的框12是指表面活性物质混合物的其它组分。将活性剂掺入到该制剂中。
由图1可见，可以将活性剂加入到预先形成的表面活性物质混合物如预先形成的脂质体中，形成表面活性物质制剂，或者可以将其直接加入到表面活性物质混合物中组分中，如在12加入，从而直接产生框14所示的表面活性物质制剂。所述表面活性物质制剂可以是成分确定的脂质小体，如掺入所述活性剂的脂质体、含有表面活性物质混合物和活性剂组分两者的脂质-晶状或无定形脂质小体、有机溶剂或有机/无机助溶剂中的所述组分的溶液、或其中某些所述组分是脂质小体形式形式而其它组分为溶质形式的混悬剂。正如由以下可认识到的，所述表面活性物质制剂的唯一组成和结构要求，在于它可以被转变为或加工成含有所有上述脂质和药物组分的合适的气雾剂粒子。
考虑到本发明所设想的各种加工步骤，标注“冻干粒子”的框16是指其中所述表面活性物质制剂(优选作为脂质小体的含水混悬剂)冻干形成干团，然后例如研磨粉碎形成含直径为1-5μm大小的干粉粒子的组合物。以框16所示的干粉粒子贮存，然后以适宜的雾化装置使用，产生适于吸入治疗的干燥粒子气雾剂(框26)，或者悬浮于合适的溶剂中，以粒子悬浮液雾化(框24)。
在另一实施方案中，本发明设想了利用用户控制的雾化器或喷雾器加工框20所示的液体表面活性物质制剂，产生含有脂质小体形式的表面活性物质制剂的含水小滴气雾剂。该实施方案的表面活性物质制剂组分可以以悬浮于气雾剂小滴中的有序结晶或无定形脂质粒子形式存在。
在再一实施方案中，表面活性物质制剂通过喷雾干燥加工，产生框18所示的、具有所需平均中位空气动力学由用户直径为1-5μm的喷雾干燥粒子。然后喷雾干燥的粒子贮存，于如上所述的雾化装置中使用，用于吸入治疗。如上所述，粉状粒子可以作为干粉气雾剂给药，或者所述粒子可以悬浮于水性介质中，以含水小滴形式雾化。或者，如框14和26之间的直接连线所示，适当的液体形式的表面活性物质制剂，如包含于挥发性生物相容流体中的制剂溶液或悬浮液，可以用雾化方法形成，其中所形成的粒子立即被吸入，从而治疗性递送所述活性剂。
以下进一步描述通过气雾给予本发明的表面活性物质制剂来递药、以及形成适于实现那些优势的气雾剂的方法的基础。以下也考虑了在各种治疗和诊断方法中的应用本发明以将活性剂递送至肺部通道。
如上所述，本发明的制剂可以制备为溶液制剂或粒状制剂。脂质组分或所述治疗药或这两者，也可以被掺入到悬浮于水性溶剂、有机溶剂或混合溶剂中的脂质体、结晶或无定形脂质小体中。
脂质体悬浮液(脂质囊泡)可以用各种各样的方法来制备，如Szoka，F.Jr.等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9467-508，1980中详细描述的方法。本发明的脂质体表面活性物质组合物一般是无菌脂质体悬浮液。这些脂质体可以是多室或多层脂质体、单室脂质体和大脂质体。多层脂质体一般是最常见的。多层脂质体(MLV)可以通过单纯脂质薄膜水合技术来形成，优选在无菌条件下进行。
用于生产脂质体表面活性物质组合物的一种方法包括将表面活性物质多肽与所选磷脂一起溶于有机溶剂中，然后将所得溶液与含水缓冲液混合。所得的悬浮液然后透析，以除去有机溶剂。或者，可以通过蒸发和/或暴露于真空来除去有机溶剂。如此产生的干燥的脂质/多肽混合物在含水缓冲体系中再水合，产生脂质体(Olson，F.等，Biochim.Biophys.Acta，5579-23，1979)。
合适的缓冲剂包括使用的Tris缓冲剂、Tham缓冲体系和类似缓冲剂。Tham是一种缓冲剂，也称为Tris、氨丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷。在各种优选实施方案中，所述组合物的pH为大约6.5-8.0。
通过将脂质体的含水悬浮液挤压通过一系列具有所选均一孔径的聚碳酸酯膜，来对脂质体的大小进行限定。膜的孔径大致对应于通过挤压通过该膜所产生的脂质体的最大尺寸，尤其是当制剂被挤压通过同一大小的膜两次或两次以上时。如此产生的脂质体可以为0.03-5微米。均化和超声处理方法也可用于减少脂质体尺寸至平均尺寸100nm或更小(Martin，F.J.，InSPECIALIZED DRUG DELIVERYSYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY，P.Tyle编著，Marcel Dekker，New York，pp.267-316，1990)。
如果需要在脂质体形成之前将治疗药掺入脂质体中，则这可以用标准技术来实现。例如，如果通过脂质水合来形成脂质体，则可以在待水合脂质混合物中包括疏水性药物，而可以将亲水性药物掺入到水合溶液中。亲水性化合物如蛋白质的高包封率，可以利用逆相蒸发法来实现，其中含药物的含水介质加入到部分蒸发的脂质结构。
用于实现亲水性药物高包封率的另一种方法是通过溶剂注射，其中将挥发性有机溶剂如乙醚中的脂质溶液注射到药物水溶液中。将脂质溶液连续注射至高脂质浓度，则可以达到非常高的包封率，如50％以上。
图2A更概括地描述了溶剂注射法，该图显示了将亲水性药物的水溶液或疏水性药物的有机溶液加入至脂质的助溶剂分散体(含有表面活性物质混合物组分)中，同时或随后用水稀释并蒸发有机溶剂，形成掺入或包封有药物的脂质粒子的批量制剂，如脂质体。
或者，可以将活性剂加入到预先形成的脂质体中。在这种情况下，表面活性物质多肽-脂质混合物包含预先形成的脂质体。如果所述化合物是疏水性化合物，则该化合物可以简单地与脂质体接触，便于通过被分配到水相介质外而被吸收到双层膜中。对于可离子化的亲水性和两亲化合物，可以按照可利用的方法，通过对pH或其它离子梯度(如铵梯度)加载药物，达到高内部包封到预先形成的脂质体中。
脂质体制剂可以作为脂质悬浮液贮存，以便以含水小滴形式雾化，如图1的20所示，或者脂质体制剂可以被冻干、制成粉状、以干粉气雾剂给药，如图1的16、22所示。或者，可以将脂质体悬浮液喷雾干燥，如18所示，形成干燥的粉状脂质粒子，用于作为粉状气雾剂给药。
冷冻干燥(冻干)是一种由溶液或悬浮液生产干粉的标准方法。例如参见Freide，M.等，Anal.Biochem.，211(1)117-122，1993；Sarbolouki，M.N.和T.Toliat，PDA J.Pharm.Sci.Technol.，52(1)23-27，1998)。冻干之后，将干燥的表面活性物质制剂粉碎，例如通过研磨或其它常规方法粉碎，形成所需大小的粒子。
最近，利用液化气体超临界特性的技术已经用于产生含有治疗性蛋白的微粒和粉末(Niven，R.W.，InMODULATED DRUGTHERAPY WITH INHALATION AEROSOLSREVISITED，A.J.Hickey编著，Marcel Dekker，New York)。具有适用于吸入的优选晶体习性和特征的粒子可以用这些方法来制备。示例性的超临界流体加工技术包括超临界流体的快速膨胀(RESS)、应用气体-反溶剂(GAS)沉淀制备粒子、以及超临界流体的溶液增强分散(SEDS)(参见美国专利5,301,644；5,707,634；5,770,559；5,981,474；5,833,891；5,874,029和6,063,138)。
喷雾干燥也可以有利地用于生产所需大小的干燥脂质粒子(参见Master，K.，SPRAY DRYING HANDBOOK，5th edition，J.Wiley & Sons，New York，1991；Maa，Y.F.等，Pharm.Res.，15(5)768-775，1998；Maa，Y.F.，Phare.Dev.Technol.，2(3)213-223，1997)。各种喷雾干燥方法在专利文献中有介绍，参见例如美国专利6,174,496、5,976,574、5,985,284、6,001,336、6,015,256、5,993,805、6,223,455、6,284,282、6,051,257。
可以使用的一种喷雾干燥装置是具有一个干燥罐的旋风干燥器。液体混合物被送入到干燥罐中，暖气体如空气或氮气或另一种惰性气体被压入罐顶部。液体进料当进入罐时被破碎，当它被载入罐底部并由此松脂收集装置时被暖气体干燥。根据已知的加工参数，可以对溶剂、注射速率和暖气体流流速加以调节，从而产生所需大小的干燥粒子。在这种情况下，可以使用平均中位空气动力学直径例如为1-5μm的粒子。在该方法中，干燥温度至少为大约37℃，优选高于40℃，可能超过100℃为好。收集室内的温度大大低于加热空气温度。这种通用方法描述于图2B，该图显示了被加入到还含有表面活性物质混合物组分的适宜助溶剂溶液的疏水性或亲水性药物。将所得混合物喷雾干燥，产生批量粉末制剂的所需大小的干燥粒子。这些粒子然后可以包装贮存，优选在干燥条件下包装贮存，用雾化器给予肺部干燥的粒子。
图3A和3B是可用该方法生产类型的干燥脂质粒子的显微照片。图3A显示了具有多种形态的无定形粒子，但是所有粒子都在一个窄的大小范围内。图3B所示的粒子是具有完全确定的晶形的结晶粉末粒子。这两种类型的粒子都适用于本发明，但是最好所述粒子一旦形成，则保持在初始状态，因为这两种状态见的转变可能影响活性药用组分的化学和物理稳定性，并且可能直接影响粉末由吸入装置分散和解聚的能力。这些变化也可能影响所述粒子的药物动力学特性。一般而言，影响无定形粉末经历向晶状转变倾向的因素包括水分含量、亲水性药物的存在、杂质、温度和时间。可能减小无定形粒子经历向晶状转变倾向的因子是蛋白和聚合物、以及疏水性物质的存在。在影响转变的这几种因素中，最重要的是温度和水分含量，需要强调的是在雾化之前，需要在适度的贮存温度下以干燥状态贮存粒子。
无论何种形成悬浮或干燥粒子的方法，所述粒子都在可产生1-5微米所需MMAD范围的条件下形成。当粒子要携带活性剂深入到肺部，例如用于治疗影响肺深部组织的肺部疾病(如肺气肿)时，所述粒子最好主要在1-3或1-2微米MMAD大小范围内。当药物传递靶向气道时，更大的粒径如3-5MMAD的大小范围可能是更适当的。
当所述制剂为脂质体或其它脂质粒子的含水悬浮液时，可以用各种各样的商业雾化器来产生所需的气雾剂粒子。通常，雾化操作在大约10-50psig下进行，并且所形成的含有粒子通常在大约2-6微米范围内。可以按照已知的操作参数控制该装置，以产生测量量的雾化脂质体或基于脂质的粒子。
适用于使脂质体含水悬浮液(优选含有低于大约25-30％半囊化水性体积的相对稀的悬浮液)雾化的另一种装置，利用超声波能将载体流体破碎成细小含水粒子雾。业已发现超声雾化器装置产生脂质体气雾剂雾，其粒径与用压缩空气雾化器所形成的粒径大致相同，即大约2-6微米。
为使递送水溶性脂质体可渗透药物所用类型的浓缩脂质体分散体雾化，首先将分散体与载体溶剂混合，形成可被雾化的稀分散体。载体溶剂可以是水性介质，在这种情况下分散体被稀释或调节形成适于如用气动或超声雾化器喷雾的形式。添加剂的加入量足以使分散体适于喷雾，例如含有低于大约30％的总包封体积。假定分散体的初始包封提及为分散体总体积的70-75％，则可知给定体积的分散体必须用至少一倍和两倍体积的稀释剂来稀释。
或者，可以将表面活性物质组分分散或悬浮于适当的挥发性生物相容性溶剂中，如以下给定的溶剂，然后由合适的喷雾器装置喷雾，喷雾条件(i)导致最初形成喷雾干燥的粒子，和(ii)将刚刚形成的粒子吸入肺中。
本节描述了各种用于产生干燥脂质粒子气载悬浮液的自含式递药装置(self-contained delivery devices)。本文所述的“自含式”是指在自含式装置中产生粒子气雾剂，所述自含式装置通过由于压缩含氟氯烃抛射剂释放或使用者通过装置抽出的空气流或使用者用装置产生的空气流而产生的压力差而推动。人们会认识到，干粉用的常规粉雾器也适用。
脂质粒子/抛射剂悬浮液.这种装置或系统使用常规加压抛射剂喷雾装置，来递送计量量的悬浮于所述抛射剂中的干燥脂质粒子。因此该系统要求脂质粒子如脂质体在适当的抛射剂中长期悬浮，所以必须根据贮存稳定性来选择脂质粒子和悬浮液的抛射剂组分。
几种氟氯烃抛射剂溶剂业已用于或提出用于自含式吸入装置。代表性溶剂包括″Freon 11″(CCl3F)、″Freon 12″(CCl2F2)、″Freon 22″(CHClF2)、″Freon113″(CCl2FCClF2)以及其它溶剂。要形成脂质粒子/抛射剂悬浮液，将干燥脂质粒子加入到所选抛射剂或抛射剂混合物中，至脂质粒子终浓度为总抛射剂重量的大约1-30％重量，优选大约10-25％重量。在药物是保持包封于抛射剂悬浮液的干燥脂质粒子中的水溶性化合物的情况下，对抛射剂中脂质粒子的终浓度加以调节，从而产生给定气雾剂悬浮液体积中的所选计量剂量的所述药物。因此，如果脂质体被配制成每mg干燥脂质体制剂含有0.05mg药物，并且待给予药物的选定剂量为1mg，则悬浮液被配制为每剂气雾剂含有20mg干燥脂质体。
对于脂溶性药物，即易溶于抛射剂溶剂中的药物，两种配制途径是可行的。在第一种途径中，所述药物最初包含在用于形成干燥脂质粒子的脂质中，然后将其以如上所述产生所选浓度药物/体积抛射剂的量加入到抛射剂中。或者，可以最初将药物以所选药物浓度加入到溶剂中。这种制剂中的脂质粒子是“空”干燥粒子，将在气雾剂形成和溶剂蒸发期间用作药物用的脂质贮库。调节空脂质粒子的终浓度，产生适用于保持药物计量量的常规总脂质剂量。
脂质粒子夹带在抛射剂中.在该装置或系统中，含计量剂量量药物的干燥脂质粒子以脱水形式被预包装在递药小包中。递药小包与抛射剂喷雾装置一起使用，喷射脂质体粒子气载悬浮液形式的递药小包的脂质体内含物。
脂质粒子夹带在空气中.第三种类型的递药装置或系统利用使用者吸入所产生的气流来夹带干燥脂质粒子，并将其吸入使用者的呼吸道中。在操作中，小包被置于喷嘴上，优选以破坏上述小包“内”端封条的方式放置，小包另一端是未密封的。使用者现在将其唇部置于周围，用力吸入，将空气快速吸入吸入器的管道中。被吸入管道的空气在喷嘴处被浓缩，产生高速气流，携带脂质粒子离开小包而进入对流区。气流和所夹带的脂质体撞击搅拌浆，使其旋转并建立对流气流。脂质粒子因此恰好在经吸入而被吸引到使用者呼吸道之前，被均匀地在更宽的横截面散布。
或者，脂质粒子可以被保留在独立于患者吸气气息而提供分散和雾化粉剂的装置中。吸入操作中的给药定时也可以由被加入到该递药装置中的传感器控制。
以下实施例旨在说明本发明，而非限制本发明。
实施例1表面活性物质蛋白/多肽的制备本发明的表面活性物质多肽如KL4的合成可以按照各种各样的已知合成方法来进行。描述以下方法作为例子。
或者，以下方法也可按本文所述来使用。用于合成表面活性物质多肽批料如KL4多肽批料的化学药品和试剂包括下述药品和试剂t-Doc-L-赖氨酸(C1-Z)PAM-树脂(t-Bcc-L-Lys(C1-Z)(AppliedBiosystems，Foster City，C(A)；a-Boc-ε-(2-氯-CBZ)-L-赖氨酸(Bachem，San Diego，CA)；N-Boc-L-亮氨酸-H2O(N-Boc-L-Leu；Bachem)；二氯甲烷(DCM；EM Science，Gibbstown，NJ，或Fisher，Pittsburgh，PA)；三氟乙酸(TFA；Halocarbon)；二异丙基乙胺(DIEA；Aldrich，Aldrich，MI)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF；EM Science，Gibbstown，NJ)；二甲基亚砜(DMSO；Aldrich)；N-甲基吡咯烷酮(NMP；Burdick Jackson，Muskegon，MI)；1-羟基苯并三唑水合物(HOBt；Aldrch)；1，3-二环己基碳二亚胺(DCC；Aldrich)；乙酸酐(Ac2O；Mallinckrodt，St.Louis，MO)；和氟化氢(HF；Air Products，Allentown，PA)一种合成KL4肽的方法在Coupler 296肽合成仪(VegaBiotechnologies，Tucson，AZ)上进行，使用Merrifield法。一种“典型的”合成如下所述。在100g赖氨酸PAM树脂上，用以下表2所述的方法进行链延伸。除步骤7、10和11之外的所有步骤都自动进行。
表2使用HOBt活性酯法的一个循环的程序
当将肽-树脂脱保护时，制备合适的氨基酸衍生物。将合适的氨基酸溶于1升NMP中。在获得澄清溶液之后，加入HOBt至溶液中。当HOBt溶解时，加入DCC至溶液中。将该溶液于室温搅拌1小时。在此1小时搅拌期间，形成副产物-二环己基脲(白色沉淀)。用Whatman′s#1滤纸，通过布氏漏斗滤出该副产物。然后在步骤7将滤液人工加入到Vega 296反应容器的内容物中。
随后为合成仪制订程序，在完成步骤9之后终止。对等份的肽树脂进行Sarin等的定量茚三酮测试(Applied Biosystems431A usermanual，Appendix A)。在整个合成过程中，偶联效率良好。未反应的肽树脂在赖氨酸12(循环9)和亮氨酸5(循环6)之后乙酰化。在每次乙酰化之后，用二氯甲烷洗涤肽树脂(参见表2，步骤11)。
在合成结束时，通过完成程序的步骤1-3(参见表2)，使已完成的肽树脂脱保护(去除Boc基)。然后用适当体积的无水乙醇洗涤脱保护的肽树脂，并且经P2O5真空干燥。干燥的脱保护肽树脂的重量为256.48克。由于批料以100g t-Boc-赖氨酸(C1-Z)OCH2PAM树脂开始，替换率为0.64mmol/克，负载量相当于64mmol。扣除初始的100克树脂，增重为156.48克。新生受护肽的分子量(不包括锚定到树脂上的C末端赖氨酸)为3011.604g/mole。
HP切割.一批256.48克的肽树脂用氟化氢(HF)分三个大的等份处理。使用得自Peninsula Laboratories(Belmont，CA)的V型HF反应装置，用液态氟化氢切割肽树脂。苯甲醚在使用前蒸馏。HF不经任何处理使用。需要干冰、异丙醇和液氮用于冷却。
对于第一次HF，将大约88g KL4肽树脂置于具有磁力搅棒的1升反应容器中。25ml经蒸馏苯甲醚加入到肽树脂中。在整个系统装配和经渗漏测试后，将HF冷凝到反应容器中，直至总水平达到大约300ml。从树脂上切下所述肽的反应在-4℃进行1小时。用吸水泵部分除去HF达1-2小时。1-2小时之后，用高真空(机械真空泵)达1-2小时，除去其余的HF。在整个HF去除过程中，反应容器的温度保持在-4℃。
然后将HF装置平衡至大气压，在反应容器底部发现油状淤渣。在反应容器的内容物中加入冷的无水乙醚(700ml，预冷至-20℃)。用玻棒，以乙醚研磨树脂块。在树脂沉降后倾析出乙醚。然后用500ml室温的无水乙醚洗涤树脂，将其搅拌大约5分钟。在树脂沉降后倾析出乙醚。洗涤树脂直至它变为自由流动(总共洗涤4-5次)。将树脂置于通风橱干燥过夜。
然后将所得干燥的经HF处理的树脂称重，贮存于冰箱中。取出1.021克干燥的经HF处理的树脂，用50ml 50％乙酸/水萃取，并且搅拌30分钟。透过粗烧结玻璃漏斗过滤树脂，将滤液收集到冷冻罐中。滤液用大约200ml水稀释，壳形冷冻，置于冻干机中。1克经萃取的HF处理过的树脂产生569mg粗制肽。下表(表3)总结了剩余KL4肽树脂的大规模HF处理。所有经HF处理的树脂都贮存在冰箱中。
表3
纯化.用Dorr-Oliver B型制备性HPLC(Dorr-Oliver，Inc.，Milord，CT)纯化肽。将这种装置与Linear Model 204分光光度计和Kipp和Zonen双通道记录仪连接。这制备性HPLC与Waters KIL250Column Module(Waters Associates，Milord，MA)连接，后者带有放射状压缩的1×60cm柱，柱中填充Vydac C4载体，15-20微米和300孔径(Vydac，Hesperia，CA)。溶剂“A”由含0.1％HOAc的水组成，溶剂“B”由含0.1％HOAc的乙腈组成。流速设定为400ml/min，柱被压缩至150-200psi，制备性HPLC系统的背压为550-600psi。
对于第一次Dorr-Oliver运行，得自HF#1的20g经HF处理的树脂在500ml冰乙酸中提取5分钟。向树脂/乙酸混合物中加入水(500ml)。将这种50％乙酸/水溶液再搅拌25分钟。用粗烧结玻璃漏斗滤出树脂。取出含肽滤液，加载到所述Dorr-Oliver上。所用的HPLC梯度是45分钟/1-40％“B”，然后保持等梯度达7分钟。此时，将“B”的百分比每分钟增加1％，增至44％(未显示)。
手动收集各级分，然后通过HPLC分析。符合纯度≥95％的所有级分合并在一起，贮存于大玻璃容器中。该材料随后称为“BPS#1”。收集具有所需组分但不符合纯度≥95％的所有级分，随后进行再循环。在Dorr-Oliver装置上再进行至少10次制备性HPLC运行。
反渗透，冷冻.BPS#1的总体积大约为60升。利用反渗透将肽溶液浓缩至终体积2升。使用配有可保留所述肽的R74A膜的MilliporeModel 6015反渗透装置。所得的2升BPS#1用两张Whatman#1滤纸，通过布氏漏斗过滤，分到大约11个冷冻罐中，用等体积水稀释。将冷冻罐壳形冷冻并冻干。该步骤结束时干燥的KL4肽的总重量为40.25克。
重新冻干.业已发现，不同的冻干条件(如肽浓度、待冻干溶剂的组成、冻干步骤的时间长度、搁板温度等)可产生具有不同溶解特性的干燥制剂。理想的是干燥KL4肽在1mg/ml时可溶于氯仿∶甲醇(1∶1)溶液，并且在10mg/ml时≥90％是可溶的。如果在上述冻干步骤结束时不符合这些标准，则可以将肽重新冻干。
典型的重冻干描述如下。将大约5g肽缓慢加入到2升乙腈中，在玻璃烧瓶中搅拌。大约1分钟后，加入3升Milli-Q水，然后加入50ml乙酸(乙酸终浓度＝1％)。将其于37℃搅拌3天，在布氏漏斗中通过Whatman#1滤纸过滤，然后放入冷冻罐中。随后用干冰和异丙醇进行壳形冷冻，置于冻干机中。冻干时间可在3-7天变动。然后对最终的干燥产物称重，包装，取等份样品进行溶解性和化学分析。
实施例2模型表面活性物质混合物的准备材料.1，2-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、1-棕榈酰，2-油酰磷脂酰甘油(POPG)和棕榈酸(PA)得自Avanti Polar Lipids Inc.(Birmingham，AL)。具有氨基酸序列KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQID NO1)的KL4多肽按本文所述方法合成，或者得自Discovery Laboratories，Inc.(Doylestown，PA.)。所使用的所有盐、缓冲液和有机溶剂都是可得到的最高等级。
配制表面活性物质组合物的贮液使其含有40mg/ml总磷脂，其组成基于以下公式PLT＝总磷脂＝DPPC+POPG
3DPPC:1 POPG1PIT:0.15PA:0.027KL4肽。
利用上述公式，制备含有不同量棕榈酸(PA)和每ml总磷脂2.5-30mg KL4肽的表面活性物质组合物(表4)。
表4
如下制备一种模型表面活性物质混合物。将KL4肽(9mg)、DPPC(225mg)、POPG(75mg)和PA(45mg)于45℃溶于2.5毫升(ml)95％乙醇中。然后将其于45℃加入到7.5ml蒸馏水中，同时快速涡旋搅拌，加入2ml 500mM NaCl、250mM Tris-乙酸盐pH 7.2。将所得的乳状悬浮液于37℃搅拌15分钟，然后于37℃下对100倍体积的130mM NaCl、20mM Tris-乙酸盐pH 7.2缓冲液透析(Spectrapor 2；截留分子量13,000)，除去存在的乙醇。透析持续48小时，更换两次透析液。
另外，所述组合物还包含每ml最终产物具有以下组成的缓冲体系/悬浮液(表5)。
表5
这种Tham缓冲体系基本如下制备。用乙酸(AR Select，ACS，Mallinckrodt，Paris，KY)调制pH 7.2±0.5的0.37ml Tham溶液(氨丁三醇注射液，NDC 0074-1593-04，Abbott Laboratories，North Chicago，IL)，与0.33ml盐水(0.9％氯化钠注射液，USP，Abbott Laboratories)和0.30ml水(无菌注射用水，USP，Abbott Laboratories)混合。将溶液过滤除菌。
实施例3人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的比色分析具有序列MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(SEQ ID NO24)的肽用作弹性蛋白酶底物。将100μl 0.425mM的SEQ ID NO24肽底物溶液置于一系列微量滴定板的孔中。向微量滴定板各孔中加入不同量的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)。用410nM的光密度(OD410)测量弹性蛋白酶活性，所观测的光密度对HNE的加入量作图，得到标准曲线。
实施例4人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶受弹性蛋白酶抑制剂的抑制为了测试丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂抑制人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的能力，将标准量的0.125μg HNE与增加量的丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂混合，然后加入实施例3所述的弹性蛋白酶底物。图5A中绘制的抑制曲线表明在抑制剂量的log与所得的OD410之间有线性反应。
实施例5得自ARDS患者的BAL液的弹性蛋白酶活性从患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的人收集支气管肺泡灌洗(BAL)液。用不同量的BAL液进行弹性蛋白酶活性比色分析。图5B中绘制了加入到样品中的BAL量和OD410之间的剂量反应曲线。
得自其它ARDS患者的灌洗液具有不同量的弹性蛋白酶活性。
实施例6兔子BAL液中的弹性蛋白酶活性6只兔子用3mg抗BSA/kg(兔子6098和6099)处理，或气管内滴注5mg抗BSA/kg(兔子6100-6103)和静脉内给予10mg BSA(6098-6101)，以诱发呼吸窘迫。处理后6小时，由这些兔子肺部取支气管肺泡灌洗(BAL)液，对这些BAL液进行弹性蛋白酶活性的比色分析。弹性蛋白酶活性以产生410nm下相应OD的HNE浓度来表示。
另外，在向BAL液中加入100μg/ml丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂之后，进行同样的分析。用于此项研究中的丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂特异性地抑制HNE。图6A图示了这些结果。在所有情况下，弹性蛋白酶活性都受到抑制，证实了所测量的蛋白水解活性是HNE所致。
实施例7兔子BAL液中弹性蛋白酶抑制剂的证据6只兔子气管内接受细菌脂多糖(LPS)和抗BSA，以诱发呼吸窘迫。动物6317和6318于3小时还接受10mg/kgBSA。在首次抗BSA给药后3小时，由兔子6315和6316取BAL液，在6小时后由兔子6313、6314、6317和6318取BAL液。单独测试(交叉斜线)或者在加入1μg/ml HNE(Solid)之后测试BAL液。结果图示于图6B中。在动物6317中存在显著的游离弹性蛋白酶；所有其它动物都显示存在弹性蛋白酶抑制剂。
实施例8模型表面活性物质混合物和丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂减少炎症期间肺BAL液中所检测到的蛋白酶量材料LPSMinm(List Biological)。5mg管形瓶。动物通过定量灌洗处理，以8ml/kg中留下120μg/kg。
PMA(Sigma)用盐水或模型表面活性物质混合物稀释至5μg/ml，灌洗使用20ml/kg/兔子，在动物中留下所述剂量的20％。
模型表面活性物质混合物(Discovery Labs)10mg/ml。对于灌洗，使用20ml/kg/兔子，在动物中留下所述剂量的20％。
丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂Elafin(Astra-Zeneca)3mg/ml贮液，对盐水透析以除去叠氮化物于1.5小时时静脉内给予1.3ml/kg Elafin于3小时时气管内给予0.33ml/kg(x 2侧)，于4.5小时时静脉内给予0.66ml/kg。
125I-BSA(NEN)在200μg/ml BSA/盐水中稀释至20μCi/ml。在处死前静脉内应用0.4ml/kg。
兔子10只新西兰白(NZW)兔，任何性别，2.0-2.5Kg。
程序20只NZW兔子分成5个处理组，每组4只动物。用LPS盐水灌洗两次，3小时时通过灌洗给予一次PMA处理，以诱导肺损伤。对丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂和模型表面活性物质混合物进行分别测试或结合测试，以确定这些因素可缓解炎症症状的程度。不同组接受的治疗如下组1动物接受两次含LPS盐水灌洗，3小时时通过灌洗给予一次PMA处理。5.5小时时静脉内给予动物一剂125I-BSA，于6小时处死动物。
组2动物接受两次含LPS盐水灌洗，3小时时通过灌洗给予一次PMA和模型表面活性物质混合物治疗。5.5小时时静脉内给予动物一剂125I-BSA。于6小时处死动物。
组3动物接受两次含LPS盐水灌洗，3小时时通过灌洗给予一次PMA处理。1.5、3.0和4.5小时时给予3剂丝氨酸蛋白酶抑制剂，5.5小时时静脉内给予动物一剂125I-BSA。于6小时处死动物。
组4动物接受两次含LPS盐水灌洗，3小时时通过灌洗给予一次PMA和模型表面活性物质混合物治疗。1.5、3.0和4.5小时时给予3剂丝氨酸蛋白酶抑制剂，5.5小时时静脉内给予动物一剂125I-BSA。于6小时处死动物。
组5正常动物用作对照。对照在接受一剂125I-BSA后30分钟处死。
所有动物都以呼吸器维持，以低换气压接受室内空气。如果在灌洗后不久，动物需要更高压力和/或氧气以维持高于大约80的SaO2，则给予一定时间更高的终末呼气正压(PEEP)和/或氧气治疗。
在动物被处死后，取出肺，结扎左侧主支气管。将右下侧肺叶灌洗3次，每次10ml盐水。合并每只动物的三次灌洗液(终末灌洗液)，向每个合并的灌洗液中加入5μl 20mM BHT以防止氧化。以1000rpm离心10分钟，除去终末灌洗合并液中的细胞。然后以40,000g离心15分钟，制备表面活性物质沉淀和富含蛋白的上清液。左肺的多个肺段保存在福尔马林中，将其它肺段冷冻。分析终末灌洗液中的蛋白含量和红细胞(RBC)。
终末灌洗液中的蛋白含量表明对基底膜基质的损伤水平，所述损伤使血浆蛋白可渗透到肺泡腔隙中。随着终末灌洗液中蛋白量增加，在肺中观察到更大的损伤。每个处理组的终末灌洗液中所发现的蛋白量图示于图7A中。结果表明，由LPS和PMA损伤产生的蛋白量(约2.5mg/ml)，在接受模型表面活性物质混合物的组中被降低，在接受模型表面活性物质混合物和弹性蛋白酶抑制剂的组中甚至进一步降低。仅接受弹性蛋白酶抑制剂的组3没有显示出蛋白水平降低，这最有可能是该组中1只动物所得到的异常高的数值所致(见


)。如果排除这只动物，则组3的平均值为1.72mg/ml，大约等于仅用模型表面活性物质化合物治疗的组2的平均值。误差棒显示SEM。
实施例9炎症期间在肺BAL液中存在基底膜蛋白片段实施例8表明，兔子体内LPS和PMA损伤引起蛋白及其蛋白水解片段的释放。对受试兔子的终末灌洗液中所存在的蛋白质，在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离之后，进行蛋白质印迹分析。使用豚鼠中产生的抗基底膜基质蛋白的抗体来显现和证实灌洗液中基底膜蛋白的存在。
结果示于图7B。肺基底膜基质的组分示于左图。仅用以LPS和PMA处理(组1)、或加入模型表面活性物质混合物(组2)、弹性蛋白酶抑制剂(组3)、或模型表面活性物质和弹性蛋白酶抑制剂两者(组4)的代表性兔子的BAL液中的蛋白和蛋白片段示于组2-4图中。正常的未损伤的兔子灌洗液示于组5图中。在完整基底膜基质和组5图中不存在的低分子量条带(＜10,000MW)，代表基底膜片段。组1-4中存在的70,000MW的大条带是白蛋白，以所用抗血清中的污染物存在。高于90,000MW的条带是基底膜特有的，在正常兔子血浆中不存在(数据未显示)。
实施例10模型表面活性物质混合物和丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂降低肺部炎症期间BAL液中的红细胞量终末灌洗液中出现的出血量或红细胞(RBC)量是动物损伤的另一个指标。虽然灌洗液中出现蛋白增加可以指示基底膜基质的损伤水平，RBC的存在提示损伤程度更大，即允许完整的血细胞穿过基质中所产生孔的损伤。
对实施例8中获得的终末灌洗液进行RBC计数，在图7C中绘制了每组两只动物所得的平均结果。当存在模型表面活性物质混合物时观察到RBC数略微降低，提示损伤有一定的缓解，但当存在丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂时观察到损伤有更大的缓解。根据终末灌洗液中存在的RBC数测定，同时加入模型表面活性物质混合物和丝氨酸蛋白酶抑制剂导致损伤有显著缓解。
实施例11对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制将0.02μg人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)与2mg/ml模型表面活性物质混合物、100μg/ml丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂、或者与模型表面活性物质混合物和丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂两者一起温育。用上述的比色分析，分析残留的HNE活性。结果图示于图8。
当加入丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂、另外存在或不存在模型表面活性物质混合物时观察到显著的抑制。数据表明，模型表面活性物质混合物并不干扰丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂抑制弹性蛋白酶的能力，其自身也不直接抑制弹性蛋白酶。
实施例12BAL液中的弹性蛋白酶抑制剂对HNE的抑制以上实施例8-10中所示的数据提示，在用LPS和PMA损伤后6小时内在兔子肺中发生的基底膜基质损伤，在体内可受丝氨酸弹性蛋白酶抑制剂和/或模型表面活性物质混合物的抑制。对终末灌洗液(按实施例8所述制备的)中存在弹性蛋白酶抑制剂(或残留活性)进行测试。
0.02μg人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)与得自一个实验组(组1-5)的一只代表兔子的50μl终末灌洗液一起温育。用实施例1中所述的比色分析，分析HNE活性。分析结果图示于图9。
由组2、3或4的动物观察到BAL液对HNE有显著的抑制。用得自通过静脉内途径和气管内途径接受已知弹性蛋白酶的抑制剂的组3和组4灌洗液所观察到的HNE弹性蛋白酶抑制非常显著。所观察到的活性表面活性物质混合物组(组2)的弹性蛋白酶抑制可能是由于兔子体内的内源弹性蛋白酶抑制剂如SPLI或αl蛋白酶抑制剂或其某些组合所致。在该实验中，正常兔子(组5)和LPS/PMA阳性损伤动物(组1)没有显示出在其终末灌洗液中存在弹性蛋白酶抑制剂。然而，5541号兔子(组1)显示出在终末BAL液中存在游离的弹性蛋白酶；而在正常动物的BAL(组5)中没有检测到。
实施例13灌洗液中磷脂酶A2(PLA2)的检测材料和方法由经历由气管内给予部分纯化的针对BSA的抗体(抗BSA抗体)起动的肺部损伤的兔子收集终末灌洗液。棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG，Avanti Polar Lipids)加入到灌洗液中，作为检测灌洗液中PLA2活性用的底物。在加入POPG底物之前，将混合物调至终浓度为10mMCaCl2、100mM KCl和25mM Tris-Cl，pH 8.5。将该混合物于37℃温育。随着时间的流逝取出等份样品，用高压液相色谱(HPLC)测定由POPG底物释放的油酸量。根据以207nm吸光度测定的从C-19HPLC柱洗出时间为4.59min的峰高，对油酸的释放量进行定量。
结果图10描述了兔子6015的灌洗液由POPG释放油酸率。如图所示，在所用的条件下，油酸被快速释放大约40分钟。这种由POPG释放油酸，表明在灌洗液中存在PLA2。
实施例14灌洗液磷脂酶A2(PLA2)活性与气管内抗BSA给药量相关材料和方法将BSA经静脉内给予6只兔子。兔子用16ml/kg盐水灌洗1次，然后静脉内滴注如下不同量的抗BSA抗体兔子6011和6012-2.5mg/kg抗BSA抗体兔子6013和6014-5.0mg/kg抗BSA抗体兔子6015和6016-12.5mg/kg抗BSA抗体收集终末灌洗液，如上述实施例中所述，测定终末灌洗液中所产生的油酸，分析PLA2活性。
也通过观察所收集的终末灌洗液中内源出现的游离脂肪酸(非油酸)，检测体内PLA2活性。具体来讲，亚麻酸和亚油酸具有3组和2组容易与油酸区别开并且用HPLC定量的碳碳双键。
结果图11表明，在与得自兔子6011、6012、6013、6014、6015和6016的灌洗液温育30分钟后，由POPG释放油酸。如图所示，所释放的油酸量以及因此得出的PLA2活性水平，与气管内给予所述动物的抗BSA抗体的给药量成正比。换句话说，仅接受2.5mg/kg抗BSA抗体的动物所具有的PLA2活性低于接受5.0mg/kg或12.5mg/kg抗BSA抗体的兔子的活性。因此，PLA2活性的程度随着肺损伤水平的增加而增加。
图12描述了磷脂在受损肺组织内体内被降解。具体来说，图12显示了由兔子6011、6012、6013、6014、6015和6016获取的终末灌洗液内观测到的、由内源组织释放亚麻酸和亚油酸。如图所示，所释放的亚麻酸和亚油酸的量以及因此得出的PLA2活性水平，与气管内给予所述动物的抗BSA抗体的给药量成正比。
实施例15灌洗液中磷脂酶PLA2(PLA2)的抑制材料和方法将BSA和抗BSA抗体给予兔子6015，如前述实施例所述，从兔子6015获取灌洗液。化合物磷酸3-[3-(2-氧代乙基)-2-乙基-1-(苯甲基)-1H-吲哚-5-基]氧基]丙酯(LY311727，Eli Lilly Co.，Indianapolis，IN)用作PLA2抑制剂，进一步证实灌洗液中脂肪酸的出现是因PLA2活性引起的，从而促进开发用于肺部炎症的有效疗法。通过将增加量的抑制剂在1.2mM CaCl2和Tris缓冲液pH 8.5存在下，加入到恒定量的得自6015兔子的灌洗液中，测试LY311727抑制剂调节PLA2的能力。将该混合物于37℃温育15分钟，然后加入POPG底物。用前述实施例所述，用洗脱出的油酸HPLC峰高测量PLA2活性。
结果图13表明，在与得自兔子6015的灌洗液温育30分钟后由POPG释放的油酸量，与LY311727抑制剂的量成正比。换句话说，当加入了增加量的所述抑制剂时，观察PLA2活性降低。
图14图示了随抑制剂浓度的log而变化的PLA2活性。如图所示，随着抑制剂浓度的增加，PLA2活性显著下降。
实施例16抗氧化剂抑制炎症期间的肺部损伤材料和方法所用的程序与前述实施例中所用程序相似。用含5μg/ml细菌LPS的盐水以20mg/kg的剂量，通过支气管肺泡灌洗(BAL)，在兔子(1.0-1.5k)体内诱发肺部损伤。给予LPS后2.5小时，兔子通过支气管肺泡灌洗接受20mg/kg肉豆蔻酸乙酸佛波醇酯(PMA)。如表6和表7所示，将兔子分成4个治疗组，每组2-6只动物。给予LPS后2.5小时，组1动物经气管内接受抗氧化剂过氧化氢酶。组2动物经气管内和静脉内接受过氧化氢酶。组3动物经气管内和静脉内接受过氧化氢酶，以及气管内接受5mg/l模型表面活性物质混合物(KL4)。组4动物不接受进一步的治疗(对照)。兔子以PIP 1PEEP 3cm水压接受人工呼吸。研究于6小时时终止。表6和表7数值为平均值±平均值的标准误差(SEM)。
结果结果示于表6和表7。虽然接受表面活性物质加上过氧化氢酶的动物数目太低，从而不能得出确定的结论，但是如几个因素所示，给予过氧化氢酶的确显著改善了肺机能。
表6
表7
*数值为0-4如表6和表7数据所示，用抗氧化剂过氧化氢酶治疗，防止了肺组织免受炎症的破坏作用。特别是，给予过氧化氢酶普遍性地改善了血液气体(一般而言，与未经治疗的动物相比，经治疗动物的PaO2更高，而PaCO2更低)。此外，经治疗动物的终末灌洗液中白蛋白和红细胞的量以及肺湿重与干重之比低于未经治疗动物的相应数值。最后，经治疗动物的大体病理学和组织病理学一般好于未经治疗动物。因此，肺组织炎症期间应用抗氧化剂，可能限制或减少与炎症相关的肺组织的损伤。
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Szoka，F.Jr.等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9467-508，1980所有出版物和专利都引入本文作为参考，就如同单独引入作为参考一样。
以上说明，包括具体实施方案和实施例，目的是为了说明本发明，而不应当用来限制本发明。在不偏离本发明实质精神和范畴的情况下可以实现众多改变和改进。
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<223>表面活性蛋白<400>1Lys Leu Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Lys20<210>2<211>21<212>PRT
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Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly355 360 365Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile370 375 380Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu385 390 395 400Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr405 410 415Gln Lys<210>16<211>252<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>16Met Ala Gln Leu Cys Gly Leu Arg Arg Ser Arg Ala Phe Leu Ala Leu1 5 10 15Leu Gly Ser Leu Leu Leu Ser Gly Val Leu Ala Ala Asp Arg Glu Arg20 25 30Ser Ile His Asp Phe Cys Leu Val Ser Lys Val Val Gly Arg Cys Arg35 40 45Ala Ser Met Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln50 55 60Leu Phe Val Tyr Gly Gly Cys Asp Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Thr65 70 75 80Lys Glu Glu Cys Leu Lys Lys Cys Ala Thr Val Thr Glu Asn Ala Thr85 90 95Gly Asp Leu Ala Thr Ser Arg Asn Ala Ala Asp Ser Ser Val Pro Ser100 105 110Ala Pro Arg Arg Gln Asp Ser Glu Asp His Ser Ser Asp Met Phe Asn115 120 125Tyr Glu Glu Tyr Cys Thr Ala Asn Ala Val Thr Gly Pro Cys Arg Ala130 135 140Ser Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Val Glu Arg Asn Ser Cys Asn Asn145 150 155 160
Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Arg Ser Glu165 170 175Glu Ala Cys Met Leu Arg Cys Phe Arg Gln Gln Glu Asn Pro Pro Leu180 185 190Pro Leu Gly Ser Lys Val Val Val Leu Ala Gly Leu Phe Val Met Val195 200 205Leu Ile Leu Phe Leu Gly Ala Ser Met Val Tyr Leu Ile Arg Val Ala210 215 220Arg Arg Asn Gln Glu Arg Ala Leu Arg Thr Val Trp Ser Ser Gly Asp225 230 235 240Asp Lys Glu Gln Leu Val Lys Asn Thr Tyr Val Leu245 250<210>17<211>57<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>17Ala Gln Glu Pro Val Lys Gly Pro Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser Cys1 5 10 15Pro Ile Ile Leu Ile Arg Cys Ala Met Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys20 25 30Leu Lys Asp Thr Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser35 40 45Cys Gly Met Ala Cys Phe Val Pro Gln50 55<210>18<211>117<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>18Met Arg Ala Ser Ser Phe Leu Ile Val Val yal Phe Leu Ile Ala Gly1 5 10 15
Thr Leu Val Leu Glu Ala Ala Val Thr Gly Val Pro Val Lys Gly Gln20 25 30Asp Thr Val Lys Gly Arg Val Pro Phe Asn Gly Gln Asp Pro Val Lys35 40 45Gly Gln Val Ser Val Lys Gly Gln Asp Lys Val Lys Ala Gln Glu Pro50 55 60Val Lys Gly Pro Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser Cys Pro Ile Ile Leu65 70 75 80Ile Arg Cys Ala Met Leu Asn Pro Pro Ash Arg Cys Leu Lys Asp Thr85 90 95Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser Cys Gly Met Ala100 105 110Cys Phe Val Pro Gln115<210>19<211>134<212>PRT<213>牛(Bos taurus)<400>19Gln Glu Pro Val Lys Gly Gln Asp Pro Val Lys Gly Gln Asp Pro Val1 5 10 15Lys Gly Gln Asp Pro Val Lys Gly Gln Asp Pro Val Lys Asp Gln Asn20 25 30Pro Val Arg Gly Gln Glu Pro Val Lys Gly Gln Asp Pro Val Lys Gly35 40 45Gln Asp Pro Val Lys Gly Gln Asp Pro Val Lys Gly Gln Glu Pro Val50 55 60Lys Gly Gln Asp Pro Val Lys Gly Gln Asp Pro Val Lys Arg Gln Gly65 70 75 80Arg Ile Gly Gly Pro Leu Leu Thr Lys Pro Gly Ser Cys Pro Arg Val85 90 95Leu Ile Arg Cys Ala Met Met Asn Pro Pro Asn Arg Cys Leu Arg Asp100 105 110Ala Gln Cys Pro Gly Val Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser Cys Gly Lys115 120 125
Thr Cys Met Asp Pro Gln130<210>20<211>207<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>20Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Val Pro Pro His Pro Gln20 25 30Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys Phe yal Gly35 40 45Thr Pro Glu Val Asn Gln Thr Thr Leu Tyr Gln Arg Tyr Glu Ile Lys50 55 60Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp65 70 75 80Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Val Cys Gly Tyr Phe85 90 95His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys Leu100 105 110Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Thr Cys Ser Phe Val Ala Pro Trp115 120 125Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr Thr130 135 140Val Gly Cys Glu Glu Cys Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro Cys145 150 155 160Lys Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln165 170 175Gly Ser Glu Lys Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro Arg180 185 190Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg Ser Gln Ile Ala195 200 205
<2l0>21<211>220<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>21Met Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu Arg Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Thr Leu Leu Arg Pro Ala Asp Ala Cys Ser Cys Ser Pro Val20 25 30His Pro Gln Gln Ala Phe Cys Asn Ala Asp Val Val Ile Arg Ala Lys35 40 45Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser Gly Asn Asp Ile Tyr Gly Asn50 55 60Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys65 70 75 80Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Ser Ala85 90 95Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly Gly Lys Lys Glu Tyr Leu Ile100 105 110Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met His Ile Thr Leu Cys Asp115 120 125Phe Ile Val Pro Trp Asp Thr Leu Ser Thr Thr Gln Lys Lys Ser Leu130 135 140Asn His Arg Tyr Gln Met Gly Cys Glu Cys Lys Ile Thr Arg Cys Pro145 150 155 160Met Ile Pro Cys Tyr Ile Ser Ser Pro Asp Glu Cys Leu Trp Met Asp165 170 175Trp Val Thr Glu Lys Asn Ile Asn Gly His Gln Ala Lys Phe Phe Ala180 185 190Cys Ile Lys Arg Ser Asp Gly Ser Cys Ala Trp Tyr Arg Gly Ala Ala195 200 205Pro Pro Lys Gln Glu Phe Leu Asp Ile Glu Asp Pro210 215 220<210>22<211>211
<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>22Met Thr Pro Trp Leu Gly Leu Ile Val Leu Leu Gly Ser Trp Ser Leu1 5 10 15Gly Asp Trp Gly Ala Glu Ala Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln20 25 30Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly35 40 45Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile50 55 60Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln65 70 75 80Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu85 90 95Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys100 105 110Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr115 120 125Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn130 135 140Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys145 150 155 160Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly165 170 175Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys180 185 190Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala195 200 205Thr Asp Pro210<210>23<211>132<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)<400>23Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu Val Leu Leu Ala Leu Gly1 5 10 15Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala20 25 30Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys35 40 45Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys50 55 60Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn65 70 75 80Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro yal Thr Tyr Gly Gln Cys85 90 95Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys100 105 110Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser115 120 125Pro Val Lys Ala130<210>24<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用作弹性蛋白酶底物的肽<221>位点<222>1<223>Xaa＝MeO-Suc
<221>位点<222>5<223>Xaa＝Val-pNA<400>24Xaa Ala Ala Pro Xaa1 5<210>25<211>248<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>25Met Trp Leu Cys Pro Leu Ala Leu Asn Leu Ile Leu Met Ala Ala Ser1 5 10 15Gly Ala Val Cys Glu Val Lys Asp Val Cys Val Gly Ser Pro Gly Ile20 25 30Pro Gly Thr Pro Gly Ser His Gly Leu Pro Gly Arg His Gly Arg Asp35 40 45Gly Leu Lys Gly Asp Leu Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly50 55 60Glu Met Pro Cys Pro Pro Gly Ash Asp Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly65 70 75 80Ile Pro Gly Glu Cys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Glu Arg Gly Pro85 90 95Pro Gly Leu Arg Ala His Leu Asp Glu Glu Leu Gln Ala Thr Leu His100 105 110Asp Phe Arg His Gln Ile Leu Gln Thr Arg Gly Ala Leu Ser Leu Gln115 120 125Gly Ser Ile Met Thr Val Gly Glu Lys Val Phe Ser Ser Asn Gly Gln130 135 140Ser Ile Thr Phe Asp Ala Ile Gln Glu Ala Cys Ala Arg Ala Gly Gly145 150 155 160Arg Ile Ala Val Pro Arg Asn Pro Glu Glu Asn Glu Ala Ile Ala Ser165 170 175Phe Val Lys Lys Tyr Asn Thr Tyr Ala Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gly
180 185 190Pro Ser Pro Gly Asp Phe Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Pro Val Asn Tyr195 200 205Thr Asn Trp Tyr Arg Gly Glu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Glu Gln Cys210 215 220Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Gln Trp Asn Asp Arg Asn Cys Leu Tyr225 230 235 240Ser Arg Leu Thr Ile Cys Glu Phe245<210>26<211>248<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>26Met Trp Leu Cys Pro Leu Ala Leu Asn Leu Ile Leu Met Ala Ala Ser1 5 10 15Gly Ala Ala Cys Glu Val Lys Asp Val Cys Val Gly Ser Pro Gly Ile20 25 30Pro Gly Thr Pro Gly Ser His Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp35 40 45Gly Val Lys Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly50 55 60Glu Thr Pro Cys Pro Pro Gly Asn Asn Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly65 70 75 80Val Pro Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Ala Gly Glu Arg Gly Pro85 90 95Pro Gly Leu Pro Ala His Leu Asp Glu Glu Leu Gln Ala Thr Leu His100 105 110Asp Phe Arg His Gln Ile Leu Gln Thr Arg Gly Ala Leu Ser Leu Gln115 120 125Gly Ser Ile Met Thr Val Gly Glu Lys Val Phe Ser Ser Asn Gly Gln130 135 140Ser Ile Thr Phe Asp Ala Ile Gln Glu Ala Cys Ala Arg Ala Gly Gly145 150 155 160Arg Ile Ala Val Pro Arg Asn Pro Glu Glu Asn Glu Ala Ile Ala Ser
165 170 175Phe Val Lys Lys Tyr Asn Thr Tyr Ala Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gly180 185 190Pro Ser Pro Gly Asp Phe Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Pro Val Asn Tyr195 200 205Thr Asn Trp Tyr Arg Gly Glu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Glu Gln Cys210 215 220Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Gln Trp Asn Asp Arg Asn Cys Leu Tyr225 230 235 240Ser Arg Leu Thr Ile Cys Asp Phe245<210>27<211>381<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>27Met Ala Glu Ser His Leu Leu Gln Trp Leu Leu Leu Leu Leu Pro Thr1 5 10 15Leu Cys Gly Pro Gly Thr Ala Ala Trp Thr Thr Ser Ser Leu Ala Cys20 25 30Ala Gln Gly Pro Glu Phe Trp Cys Gln Ser Leu Glu Gln Ala Leu Gln35 40 45Cys Arg Ala Leu Gly His Cys Leu Gln Glu Val Trp Gly His Val Gly50 55 60Ala Asp Asp Leu Cys Gln Glu Cys Glu Asp Ile Val His Ile Leu Asn65 70 75 80Lys Met Ala Lys Glu Ala Ile Phe Gln Asp Thr Met Arg Lys Phe Leu85 90 95Glu Gln Glu Cys Asn Val Leu Pro Leu Lys Leu Leu Met Pro Gln Cys100 105 110Asn Gln Val Leu Asp Asp Tyr Phe Pro Leu Val Ile Asp Tyr Phe Gln115 120 125Asn Gln Ile Asp Ser Asn Gly Ile Cys Met His Leu Gly Leu Cys Lys130 135 140
Ser Arg Gln Pro Glu Pro Glu Gln Glu Pro Gly Met Ser Asp Pro Leu145 150 155 160Pro Lys Pro Leu Arg Asp Pro Leu Pro Asp Pro Leu Leu Asp Lys Leu165 170 175Val Leu Pro Val Leu Pro Gly Ala Leu Gln Ala Arg Pro Gly Pro His180 185 190Thr Gln Asp Leu Ser Glu Gln Gln Phe Pro Ile Pro Leu Pro Tyr Cys195 200 205Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro Lys210 215 220Gly Ala Leu Arg Val Ala Val Ala Gln Val Cys Arg Val Val Pro Leu225 230 235 240Val Ala Gly Gly Ile Cys Gln Cys Leu Ala Glu Arg Tyr Ser Val Ile245 250 255Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg260 265 270Leu Val Leu Arg Cys Ser Met Asp Asp Ser Ala Gly Pro Arg Ser Pro275 280 285Thr Gly Glu Trp Leu Pro Arg Asp Ser Glu Cys His Leu Cys Met Ser290 295 300Val Thr Thr Gln Ala Gly Asn Ser Ser Glu Gln Ala Ile Pro Gln Ala305 310 315 320Met Leu Gln Ala Cys Val Gly Ser Trp Leu Asp Arg Glu Lys Cys Lys325 330 335Gln Phe Val Glu Gln His Thr Pro Gln Leu Leu Thr Leu Val Pro Arg340 345 350Gly Trp Asp Ala His Thr Thr Cys Gln Ala Leu Gly Val Cys Gly Thr355 360 365Met Ser Ser Pro Leu Gln Cys Ile His Ser Pro Asp Leu370 375 380<210>28<211>197<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>28Met Asp Val Gly Ser Lys Glu Val Leu Met Glu Ser Pro Pro Asp Tyr1 5 10 15Ser Ala Ala Pro Arg Gly Arg Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His20 25 30Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val35 40 45Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His Met Ser Gln Lys His50 55 60Thr Glu Met Val Leu Glu Met Ser Ile Gly Ala Pro Glu Ala Gln Gln65 70 75 80Arg Leu Ala Leu Ser Glu His Leu Val Thr Thr Ala Thr Phe Ser Ile85 90 95Gly Ser Thr Gly Leu Val Val Tyr Asp Tyr Gln Gln Leu Leu Ile Ala100 105 110Tyr Lys Pro Ala Pro Gly Thr Cys Cys Tyr Ile Met Lys Ile Ala Pro115 120 125Glu Ser Ile Pro Ser Leu Glu Ala Leu Asn Arg Lys Val His Asn Phe130 135 140Gln Met Glu Cys Ser Leu Gln Ala Lys Pro Ala Val Pro Thr Ser Lys145 150 155 160Leu Gly Gln Ala Glu Gly Arg Asp Ala Gly Ser Ala Pro Ser Gly Gly165 170 175Asp Pro Ala Phe Leu Gly Met Ala Val Asn Thr Leu Cys Gly Glu Val180 185 190Pro Leu Tyr Tyr Ile195<210>29<211>374<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>29Met Leu Pro Phe Leu Ser Met Leu Val Leu Leu Val Gln Pro Leu Gly1 5 10 15
Asn Leu Gly Ala Glu Met Lys Ser Leu Ser Gln Arg Ser Val Pro Asn20 25 30Thr Cys Thr Leu Val Met Cys Ser Pro Thr Glu Asn Gly Leu Pro Gly35 40 45Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Glu Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly Asp50 55 60Pro Gly Leu Pro Gly Pro Met Gly Leu Ser Gly Leu Gln Gly Pro Thr65 70 75 80Gly Pro Val Gly Pro Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ala Gly Glu Pro Gly85 90 95Pro Lys Gly Glu Arg Gly Leu Ser Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Ile100 105 110Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Ser Gly Lys Gln Gly Asn Ile115 120 125Gly Pro Gln Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Pro Lys Gly130 135 140Glu Val Gly Ala Pro Gly Met Gln Gly Ser Thr Gly Ala Lys Gly Ser145 150 155 160Thr Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Val Gln Gly Ala Pro165 170 175Gly Asn Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly180 185 190Ala Pro Gly Ser Arg Gly Pro Pro Gly Leu Lys Gly Asp Arg Gly Val195 200 205Pro Gly Asp Arg Gly Ile Lys Gly Glu Ser Gly Leu Pro Asp Ser Ala210 215 220Ala Leu Arg Gln Gln Met Glu Ala Leu Lys Gly Lys Leu Gln Arg Leu225 230 235 240Glu Val Ala Phe Ser His Tyr Gln Lys Ala Ala Leu Phe Pro Asp Gly245 250 255Arg Ser Val Gly Asp Lys Ile Phe Arg Thr Ala Asp Ser Glu Lys Pro260 265 270Phe Glu Asp Ala Gln Glu Met Cys Lys Gln Ala Gly Gly Gln Leu Ala275 280 285Ser Pro Arg Ser Ala Thr Glu Asn Ala Ala Ile Gln Gln Leu Ile Thr290 295 300
Ala His Asn Lys Ala Ala Phe Leu Ser Met Thr Asp Val Gly Thr Glu305 310 315 320Gly Lys Phe Thr Tyr Pro Thr Gly Glu Pro Leu Val Tyr Ser Asn Trp325 330 335Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Asn Gly Gly Ala Glu Asn Cys Val Glu340 345 350Ile Phe Thr Asn Gly Gln Trp Asn Asp Lys Ala Cys Gly Glu Gln Arg355 360 365Leu Val Ile Cys Glu Phe370<210>30<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>WMAP-10肽<221>位点<222>1<223>Xaa＝琥珀酰-Leu<221>位点<222>9<223>Xaa＝Lys-酰胺<400>30Xaa Leu Glu Lys Leu Leu Gln Trp Xaa1 权利要求
1.一种治疗或预防肺部炎症的液体组合物，所述组合物包含肺表面活性物质性多肽和蛋白酶抑制剂。
2.权利要求1的液体组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、纤溶酶抑制剂、凝血因子XIa抑制剂、凝血因子IXa抑制剂、组织蛋白酶G抑制剂、人白细胞弹性蛋白酶抑制剂或人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
3.权利要求1的液体组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是人白细胞弹性蛋白酶抑制剂、α1-蛋白酶抑制剂、α1-抗胰蛋白酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、bikunin、C-反应蛋白或它们的组合物。
4.权利要求1的液体组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是快反应型弹性蛋白酶抑制肽。
5.权利要求1的液体组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
6.权利要求1的液体组合物，其中所述蛋白酶抑制剂包括含SEQID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ IDNO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22或SEQ ID NO23的多肽。
7.权利要求1的液体组合物，其中所述肺表面活性物质性多肽包含具有10-60个氨基酸残基且具有交替性疏水氨基酸残基和亲水性氨基酸残基区、式(ZaUb)cZd表示的氨基酸序列的多肽，式(ZaUb)cZd中，Z是亲水氨基酸残基，U是疏水氨基酸残基，a是平均值为1-5的整数，b是平均值为3-20的整数，c为约1-10的整数，d为约0-3的整数。
8.权利要求7的液体组合物，其中Z是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸或3-羟脯氨酸。
9.权利要求7的液体组合物，其中U是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和/或α-氨基脂族羧酸，所述α-氨基脂族羧酸例如α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
10.权利要求7的液体组合物，其中U是α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
11.权利要求11的液体组合物，其中所述肺表面活性物质性多肽包含氨基酸序列KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO1)，KLLLLLLLLKLLLLLLLLKLL(SEQ ID NO2)，KKLLLLLLLKKLLLLLLLKKL(SEQ ID NO3)，DLLLLDLLLLDLLLLDLLLLD(SEQ ID NO4)；RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR(SEQ ID NO5)；RLLLLLLLLRLLLLLLLLRLL(SEQ ID NO6)；RRLLLLLLLRRLLLLLLLRRL(SEQ ID NO7)，RLLLLCLLLRLLLLCLLLR(SEQ ID NO8)，RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL(SEQ ID NO9)，或RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLR(SEQ ID NO10).
12.权利要求1的液体组合物，其中所述肺表面活性物质性多肽是KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO1)。
13.权利要求1的液体组合物，其中所述肺表面活性物质性多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQID NO28或SEQ ID NO29。
14.权利要求1的液体组合物，其中所述组合物包含约0.1％-10％的所述肺表面活性物质性多肽。
15.权利要求1的液体组合物，其中所述组合物还包含约50％-约95％干重的磷脂。
16.权利要求15的液体组合物，其中磷脂包括摩尔比大约4∶1至大约2∶1的二棕榈酰磷脂酰胆碱和棕榈酰油酰磷脂酰甘油。
17.权利要求1的液体组合物，其中所述组合物包含约2％-约25％干重的铺展剂。
18.权利要求17的液体组合物，其中所述铺展剂是具有至少10个碳原子的脂肪酰基链长的脂肪酸或脂肪醇。
19.权利要求17的液体组合物，其中所述铺展剂进一步包括泰洛沙泊。
20.权利要求1的液体组合物，其中所述组合物还包含脂酶抑制剂或抗氧化剂。
21.权利要求20的液体组合物，其中所述脂酶抑制剂是磷脂酶A2抑制剂。
22.权利要求20的液体组合物，其中所述脂酶抑制剂是对溴苯甲酰甲基溴、thielocin A1β、脂皮质蛋白、膜联蛋白I或响尾蛇(Crotalus)磷脂酶A2抑制剂。
23.权利要求20的液体组合物，其中所述脂酶抑制剂是LY11-727。
24.权利要求20的液体组合物，其中所述抗氧化剂是过氧化氢酶、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、丙环司坦、α-生育酚、迷迭香叶提取物、2，4-二氨基吡咯并-[2，3-d]嘧啶、抗坏血酸、蛋黄色素、玉米黄素、隐黄素、紫黄质、胡萝卜素二醇、羟基胡萝卜素、羟基番茄红素、双阿脲或脱氢隐黄素。
25.权利要求1的液体组合物，其中所述液体组合物通过支气管肺泡灌洗给药、口服给药、静脉内给药、非肠道给药或快速浓注给药。
26.一种治疗或预防肺部炎症的气雾剂化组合物，所述组合物包含肺表面活性物质性多肽和蛋白酶抑制剂。
27.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、纤溶酶抑制剂、凝血因子XIa抑制剂、凝血因子IXa抑制剂、组织蛋白酶G抑制剂、人白细胞弹性蛋白酶抑制剂或人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
28.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是人白细胞弹性蛋白酶抑制剂、α1-蛋白酶抑制剂、α1-抗胰蛋白酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、bikunin、C-反应蛋白或它们的组合物。
29.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是快反应型弹性蛋白酶抑制肽。
30.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
31.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述蛋白酶抑制剂包括含SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQID NO22或SEQ ID NO23的多肽。
32.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述肺表面活性物质性多肽包含具有10-60个氨基酸残基且具有交替性疏水氨基酸残基和亲水氨基酸残基区、式(ZaUb)cZd表示的氨基酸序列的多肽，式(ZaUb)cZd中，Z是亲水氨基酸残基，U是疏水氨基酸残基，a是平均值为1-5的整数，b是平均值为3-20的整数，c为约1-10的整数，d为约0-3的整数。
33.权利要求32的气雾剂化组合物，其中Z是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸或3-羟脯氨酸。
34.权利要求32的气雾剂化组合物，其中U是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和/或α-氨基脂族羧酸，所述α-氨基脂族羧酸例如α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
35.权利要求32的气雾剂化组合物，其中U是α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
36.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述组合物包含约0.1％-10％的所述肺表面活性物质性多肽。
37.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述肺表面活性物质性多肽包含氨基酸序列KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO1)，KLLLLLLLLKLLLLLLLLKLL(SEQ ID NO2)，KKLLLLLLLKKLLLLLLLKKL(SEQ ID NO3)，DLLLLDLLLLDLLLLDLLLLD(SEQ ID NO4)；RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR(SEQ ID NO5)；RLLLLLLLLRLLLLLLLLRLL(SEQ ID NO6)；RRLLLLLLLRRLLLLLLLRRL(SEQ ID NO7)，RLLLLCLLLRLLLLCLLLR(SEQ ID NO8)，RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL(SEQ ID NO9)，或RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLR(SEQ ID NO10)。
38.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述肺表面活性物质性多肽是KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO1)。
39.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述肺表面活性物质性多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28或SEQ ID NO29。
40.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述组合物还包含约50％-约95％干重的磷脂。
41.权利要求40的气雾剂化组合物，其中所述磷脂包括摩尔比大约4∶1至大约2∶1的二棕榈酰磷脂酰胆碱和棕榈酰油酰磷脂酰甘油。
42.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述组合物包含约2％-约25％干重的铺展剂。
43.权利要求42的气雾剂化组合物，其中所述铺展剂是具有至少10个碳原子的脂肪酰基链长的脂肪酸或脂肪醇。
44.权利要求42的气雾剂化组合物，其中所述铺展剂进一步包括泰洛沙泊。
45.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述组合物还包含脂酶抑制剂或抗氧化剂。
46.权利要求45的气雾剂化组合物，其中所述脂酶抑制剂是磷脂酶A2抑制剂。
47.权利要求45的气雾剂化组合物，其中所述脂酶抑制剂是对溴苯甲酰甲基溴、thielocin A1β、脂皮质蛋白、膜联蛋白I或响尾蛇磷脂酶A2抑制剂。
48.权利要求45的气雾剂化组合物，其中所述脂酶抑制剂是LY11-727。
49.权利要求45的气雾剂化组合物，其中所述抗氧化剂是过氧化氢酶、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、丙环司坦、α-生育酚、迷迭香叶提取物、2，4-二氨基吡咯并-[2，3-d]嘧啶、抗坏血酸、蛋黄色素、玉米黄素、隐黄素、紫黄质、胡萝卜素二醇、羟基胡萝卜素、羟基番茄红素、双阿脲或脱氢隐黄素。
50.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述组合物是一种液体组合物。
51.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述组合物是一种固体组合物。
52.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述组合物包含平均中位空气动力学直径大约1μm至大约5μm的气雾剂粒子。
53.权利要求26的气雾剂化组合物，其中所述组合物配制用于治疗哮喘。
54.一种治疗哺乳动物肺部炎症的方法，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的包含蛋白酶抑制剂、脂酶抑制剂和抗氧化剂的组合物。
55.权利要求54的方法，其中肺部炎症伴有肺动脉血压过高、新生儿肺动脉血压过高、新生儿支气管肺发育不良、慢性阻塞性肺病、急性支气管炎、慢性支气管炎、肺气肿、细支气管炎、支气管扩张、放射性肺炎、过敏反应、局限性肺炎、急性炎性哮喘、急性烟雾吸入、肺的热损伤、变应性哮喘、医源性哮喘、囊性纤维化、肺泡蛋白沉积症、α-1-蛋白酶缺乏症、肺部炎性疾病、肺炎、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、特发性呼吸窘迫综合征或特发性肺纤维化。
56.权利要求54的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、纤溶酶抑制剂、凝血因子XIa抑制剂、凝血因子IXa抑制剂、组织蛋白酶G抑制剂、人白细胞弹性蛋白酶抑制剂或人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
57.权利要求54的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是人白细胞弹性蛋白酶抑制剂、α1-蛋白酶抑制剂、α1-抗胰蛋白酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、bikunin、C-反应蛋白或它们的组合物。
58.权利要求54的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是快反应型弹性蛋白酶抑制肽。
59.权利要求54的方法，其中所述蛋白酶抑制剂包括含SEQ IDNO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22或SEQ ID NO23的多肽。
60.权利要求54的方法，其中所述脂酶抑制剂是磷脂酶A2抑制剂。
61.权利要求54的方法，其中所述脂酶抑制剂是对溴苯甲酰甲基溴、thielocin A1β、脂皮质蛋白、膜联蛋白I或响尾蛇磷脂酶A2抑制剂。
62.权利要求54的方法，其中所述抗氧化剂是过氧化氢酶、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、丙环司坦、α-生育酚、迷迭香叶提取物、2，4-二氨基吡咯并-[2，3-d]嘧啶、抗坏血酸、蛋黄色素、玉米黄素、隐黄素、紫黄质、胡萝卜素二醇、羟基胡萝卜素、羟基番茄红素、双阿脲或脱氢隐黄素。
63.权利要求54的方法，其中所述组合物通过非肠道、口服或静脉内给予。
64.权利要求54的方法，其中所述组合物通过支气管肺泡灌洗、吸入或液体快速浓注给予到肺。
65.权利要求54的方法，其中所述组合物还包含肺表面活性物质性多肽，该多肽包含10-60个氨基酸残基且具有交替性疏水氨基酸残基和亲水氨基酸残基区、式(ZaUb)cZd表示的氨基酸序列，式(ZaUb)cZd中，Z是亲水氨基酸残基，U是疏水氨基酸残基，a是平均值为1-5的整数，b是平均值为3-20的整数，c为约1-10的整数，d为约0-3的整数。
66.权利要求65的方法，其中所述组合物包含约0.1％-10％干重的肺表面活性物质性多肽。
67.权利要求65的方法，其中Z是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸或3-羟脯氨酸。
68.权利要求65的方法，其中U是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和/或α-氨基脂族羧酸，所述α-氨基脂族羧酸例如α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
69.权利要求65的方法，其中U是α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、α-氨基-2-甲基丙酸或α-氨基己酸。
70.权利要求65的方法，其中所述肺表面活性物质性多肽包含氨基酸序列KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO1)，KLLLLLLLLKLLLLLLLLKLL(SEQ ID NO2)，KKLLLLLLLKKLLLLLLLKKL(SEQ ID NO3)，DLLLLDLLLLDLLLLDLLLLD(SEQ ID NO4)；RLLLLRLLLLRLLLLRLLLLR(SEQ ID NO5)；RLLLLLLLLRLLLLLLLLRLL(SEQ ID NO6)；RRLLLLLLLRRLLLLLLLRRL(SEQ ID NO7)，RLLLLCLLLRLLLLCLLLR(SEQ ID NO8)，RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLL(SEQ ID NO9)，或RLLLLCLLLRLLLLCLLLRLLLLCLLLR(SEQ ID NO10)。
71.权利要求65的方法，其中所述肺表面活性物质性多肽是KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK(SEQ ID NO1)。
72.权利要求65的方法，其中所述肺表面活性物质性多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28或SEQ ID NO29。
73.权利要求65的方法，其中所述组合物还包含约50％-约95％干重的磷脂。
74.权利要求73的方法，其中所述磷脂包括摩尔比大约4∶1至大约2∶1的二棕榈酰磷脂酰胆碱和棕榈酰油酰磷脂酰甘油。
75.权利要求65的方法，其中所述组合物还包含约2％-约25％干重的铺展剂。
76.权利要求75的方法，其中所述铺展剂是具有至少10个碳原子的脂肪酰基链长的脂肪酸或脂肪醇。
77.权利要求75的方法，其中所述铺展剂进一步包括泰洛沙泊。
78.权利要求54的方法，其中所述脂酶抑制剂是LY11-727。
79.权利要求54的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
全文摘要
本发明提供治疗肺病和减少肺部炎症负面作用的组合物与方法。这样的组合物及方法应用蛋白酶抑制剂和一种肺表面活性物质混合物。所述组合物与方法也可包括脂酶抑制剂(例如磷脂酶抑制剂)和抗氧化剂。
文档编号A61K38/08GK1838964SQ03814517
公开日2006年9月27日 申请日期2003年4月25日 优先权日2002年4月25日
发明者C·G·科克拉内 申请人:斯克里普斯研究学院