专利名称：具有超高分子量的聚－γ谷氨酸及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种具有超高分子量的聚-γ谷氨酸(在此称为PGA)及其使用方法，该产品是从chungkookjang，一种韩国传统发酵的大豆食品中分离到的耐盐菌株枯草芽孢杆菌变种chungkookjang(KTCT 0697BP)中制备得到的。尤其是，本发明涉及分子量大于5,000KDa的PGA，它具有可食性、水溶性、阴离子特性和生物可降解性，本发明还涉及包含该物质的食品、化妆品、饲料和促矿物吸收组合物。
背景技术：
PGA是一种粘性聚合物，其中D，L-谷氨酸通过γ谷酰基而聚合。它是由杆状菌制得的，该菌株是从使用稻草进行大豆发酵而制备的韩国传统食品chungkookjang中分离得到，也可从日本传统发酵大豆食品纳豆以及尼泊尔传统发酵大豆食品kinema中分离得到。
杆状菌制得的聚合物PGA具有可食性、水溶性、阴离子特性和生物可降解性，并可作为吸湿剂、保湿剂和化妆品的原料，还可在使用酯衍生物合成制备天然可降解塑料中作为原料。
近来，随着PGA的生产和应用，尤其在高度发达的国家，正在积极致力于研究开发难降解性聚合物的替代材料、酯化生产耐热性塑料，以及生产水溶性纤维和膜。此外，研究者还对PGA受到γ射线辐射而导致的物理特性变化进行研究，也对使用交联剂的PGA水凝胶的开发和工业应用展开研究。
PGA水凝胶是一种通过PGA的分子内和分子外交联而制得的环保型材料，它是通过培养枯草芽孢杆菌变种chungkookjang而制得的生物聚合物，具有吸水性、生物可降解性和热塑性。交联PGA的方法包括例如γ射线或电子束辐射，以及使用化学交联剂如环氧树脂等进行交联。当PGA水溶液受到辐射时，则会发生PGA分子间交联，使得PGA树脂具有吸水性、生物可降解性和热塑性。
现有技术报导了锰离子对PGA组合物和制备的影响的研究、通过超声分解制备水溶性PGA的研究、通过酯衍生物合成来制备低水溶性塑料的研究(BiosciBiotechnol.Biochem.，60(8)1239-42，1996)、使用枯草芽孢杆菌制备PGA的研究、以及将PGA用在对骨质疏松有疗效的健康食品中，例如钙溶解剂等(日本专利公开号No.Heisei 6-32742)。
另外，还报道了PGA具有通过降低水系统中的磷含量来减少水污染的作用(欧洲专利No.838160)。此外，还公开了高度凝胶化、水溶性、生物可降解性和吸附性的PGA树脂及其用于卫生用品和食品以及园艺工业等领域中(日本专利公开No.Heisei 10-251402，7-300522和6-322358)。
此外，目前已知通过分解、沉淀和干燥PGA的方法将PGA用作固体可降解纤维、膜或膜状材料(日本专利公开Nos.Heisei 7-138364和5-117388)，以及将PGA用作药物载体(日本专利公开Nos.Heisei 6-92870and 6-256220)。
同时，还已知有效生产PGA的发明(韩国专利申请No.1997-67605)，生产高浓度PGA的发明(韩国专利申请No.2001-0106025)和耐盐菌株枯草芽孢杆菌变种chungkookjang生产高分子量PGA的发明(根据韩国专利公开No.2001-78440的PCT申请No.PCT/KRO 1/01372)。
现有技术制备的PGA分子量范围在大约100-2,000KDa，它们在应用中都有一定的局限性，尤其是由于溶解性、吸收性和矿物的持续释放性而在化妆品和食品领域中的应用受限。
因此，为了制备超高分子量的PGA，本发明的发明人进行了广泛的研究，结果发现在包含葡萄糖、柠檬酸和谷氨酸的介质中培养枯草芽孢杆菌变种chungkookjang能产生分子量大于5,000KDa的PGA，且没有副产品，所得的PGA在用作保湿剂、吸水剂和促矿物吸收剂时具有很好的效果。本发明正是根据这一点实现的。
发明内容
本发明的一个主要目的是提供一种超高分子量的PGA，它的分子量大于5,000KDa。
本发明另一个目的是提供一种包含超高分子量PGA的化妆品，食品和饲料。
另一个目的在于提供一种由超高分子量PGA制得的水凝胶，以及包含该物质的吸湿剂和吸水剂。
本发明的再一个目的是提供一种包含超高分子量PGA和矿物的促矿物吸收组合物。
为了实现上述的发明目的，本发明提供了一种平均分子量大于5,000KDa的超高分子量PGA。
优选地，根据本发明的PGA分子量在5,000到15,000KDa之间。
由于本发明的PGA具有超高分子量，与现有的较低分子量的PGA相比，它具有非常好的吸湿性和保湿特性。因此，本发明还提供了包含超高分子量PGA的食品、化妆品和饲料。
本发明从PGA制备得到的水凝胶，其作为原料，与现有的较低分子量的同类产品相比具有非常好的吸水特性。因此，本发明还提供了从超高分子量PGA制备得到的水凝胶，以及包含该水凝胶的吸湿剂和吸水剂。
本发明的PGA具有良好的促进矿物离子溶解度的特性，以及持续释放矿物离子的良好特性。因而，本发明还提供了一种包含超高分子量PGA和矿物的促矿物吸收组合物。
在本发明中，矿物优选为Ca，Fe，Mg，Zn，Cu或Se，但是生命体所必需的矿物也可不受限制地得到应用。
在本发明中，也可用分子量大于5,000KDa的超高分子量PGA与带正电荷的聚氨基酸的共聚物来替代PGA。聚氨基酸优选为聚赖氨酸或聚精氨酸。本发明的PGA具有负电荷，因而可与聚氨基酸静电结合形成共聚物。
此外，本发明还提供了一种使用分子量大于5,000KDa的超高分子量PGA作为促矿物吸收剂的方法。
在本发明中，超高分子量PGA是通过培养微生物制得的。用于制备本发明超高分子量PGA的微生物是枯草芽孢杆菌变种chungkookjang(KTCT0697BP)，该菌株的分离、鉴定和生理特征本申请的发明人在2001年8月11日提交的PCT申请No.PCT/KR01/01372中有详细记载。
该菌株的形态学和生理学特征如下
该菌种是革兰氏阳性细菌，它在LB琼脂平板上培养时形成乳白色的集落，在高于37℃的需氧条件下快速生长，在高于55℃的条件下生长缓慢。此外，该菌株是耐盐菌，甚至能在9.0％的盐(NaCl)浓度下生长，这比一般的枯草芽孢杆菌的耐盐性高。并且，它是一种典型的杆状菌，当在LB液体介质或固体介质中培养至少70小时会形成内生孢子。将该菌株的16S rDNA序列与现有的杆菌菌株16SrDNA序列进行对比分析，显示该菌株与枯草芽孢杆菌有99.0％的高同源性。
结合以下的详细说明和附图，本发明的上述目的、特征和优点可被清楚地理解。图中图1展示了本发明PGA的分子量分布；图2展示了本发明超高分子量PGA的吸水特性和现有产品的对比；图3展示了本发明超高分子量PGA的保湿特性和现有产品的对比；图4展示了本发明超高分子量PGA改进Ca溶解性的效果。
图5展示了当使用本发明分子量为5,000KDa的PGA时，小肠内的Ca吸收随时间的变化情况。
图6展示了从本发明超高分子量PGA制得的水凝胶作为原料的吸水效果。
发明详述在后文中将用实施例进一步描述本发明。然而应该理解，这些实施例旨在解释本发明目而不是用来限制本发明。
尽管实施例记载的本发明的超高分子量PGA是用枯草芽孢杆菌变种chungkookjang(KTCT 0697BP)制得的，但是应该理解由其它菌株或采用化学方法制得的PGA也属于本发明保护范围内，只要超高分子量PGA的分子量大于5,000KDa。
实施例1超高分子量PGA的制备和分子量测定为了测定是否可通过优化介质和培养条件就能制备超高分子量的PGA，进行了下述的实验。
在含3L矿物介质(含4％L-谷氨酸、3％葡萄糖、1％(NH4)2SO4、1％柠檬酸钠、0.27％ KH2PO4、0.42％ Na2HPO4、0.05％ NaCl、0.3％ MgSO4、1ml/L维生素溶液的GS介质，pH 6.8)的5L发酵罐中接种1％的枯草芽孢杆菌变种chungkookjang(KTCT 0697BP)的培养肉汤，在150rpm的摇动速度、1vvm的通风速度，并在37℃下培养3天，然后加入2N的硫酸溶液调节pH至3.0，从而获得含PGA的样品溶液。
样品溶液在4℃下静置10小时以去除发酵液中的多糖，加入多于2倍发酵液体积的乙醇，然后充分混合。混合溶液在4℃下静置10小时，接着离心，得到PGA沉淀。
加入蒸馏水使沉淀溶解，再加入100ug/ml的蛋白酶，在培养箱中于37℃的条件下反应，从而分解PGA样品中的细胞外蛋白。
所得的物质用足量的蒸馏水透析，接着浓缩得到纯的PGA。
如图1所示，GPC分析发现，上述所得的PGA的平均分子量为13,000KDa，95％以上的分子的分子量范围为3,000至15,000kDa。
在本发明中，PGA的分子量通过凝胶渗透色谱(GPC)测定。在GPC分析PGA分子量时，使用了装有两个GMPWXL柱(VISCOTEK Co.)的GPC系统(Youngin Scientific Co，Ltd，Korea)。所用的溶剂，即0.1N的NaNO3的流速为0.8ml/分钟。采用氧化聚乙烯作为GPC分析的标准，用折射计(VISTOTEK Co.)测定PGA的分子量。
从培养枯草芽孢杆菌变种chungkookjang(KTCT 0697BP)而获得的现有PGA的分子量为大约2,000KDa(韩国专利公开No.2001-78440)，但是本发明在优化的介质和培养条件下能成功制得分子量大于5,000KDa的超高分子量PGA。
实施例2超高分子量PGA的吸湿和保湿特性将实施例1制得的超高分子量PGA的吸湿和保湿特性与分子量为600KDa的现有PGA对比。
(1)吸湿特性的对比将实施例1制得的PGA和分子量为600KDa的现有产品分别取0.5g置于培养皿中，在45℃的培养箱中放置14小时，使水分完全去除。将所得样品置于含有碳酸钙饱和水溶液(每500g纯净水中有250g碳酸钙)的干燥器(相对湿度81-88％)中，检测产品重量随时间的变化(吸湿特性)，检测24小时。检测结果见图2。
如图2所示，结果发现，24小时后600KDa分子量的PGA的水含量增加不到10％，而本发明PGA水含量增加约为60％，这说明本发明PGA具有极其优良的吸湿特性。
(2)保湿特性的对比将样品在上述实验(1)条件下放置48小时使之完全潮湿，然后放到包含500g干燥硅胶的干燥器(18％湿度)中，在25℃下测定水含量随时间的减少，测定24个小时。测定结果如图3。
图3显示，24小时后600KDa分子量的PGA的水含量减少13％，而本发明超高分子量PGA的水含量减少大约10％，说明本发明PGA具有极其优良的保湿特性。
从这一实施例的结果可以看出，本发明的超高分子量PGA能用在各种保湿和/或吸湿产品，例如化妆品、食品和饲料中。
实施例3超高分子量PGA的钙溶解性为了检测本发明超高分子量PGA的钙溶解性而进行下述的实验。
将实施例1制得的超高分子量PGA稀释，制备浓度分别为0.062，0.125，0.25和0.5mg/ml的PGA溶液。将上述PGA溶液每种取0.5ml加到含有0.5ml的10mM CaCl2和1.0ml的20mM磷酸盐缓冲液的反应溶液中，在37℃下反应。2小时后，各溶液在2000g下离心30分钟，用Ca定量试剂盒(WakoChemical Co.，Japan)对留在上清液中的Ca进行定量分析。此外，在对照组中，标记物A(从日本Ajinomoto公司购得的PGA)、分子量为1,000KDa的PGA和分子量为2,000KDa的PGA上也进行了Ca溶解性测定。结果如图4。
图4显示，本发明的PGA在所有浓度下都比现有产品能溶解(吸附)更多的Ca离子。尤其是，0.125mg/ml的PGA、标记物A、1,000KDa分子量的PGA和2,000KDa分子量的PGA的Ca溶解性分别为大约12％，27％和37％，而分子量为5,000KDa的超高分子量PGA的Ca溶解性为大约46％。
实施例4超高分子量PGA的对肠内钙吸收的促进效果测定实施例1制得的超高分子量PGA对肠内钙吸收的促进效果。
分子量为5,000KDa的PGA经稀释而制备浓度分别为0.05，0.1和0.2％的溶液，然后与5mM氯化钙混合。给小鼠口服施用1ml的每种溶液。为了证明超高分子量PGA具有良好的促进肠内钙吸收的效果，进行了本发明PGA和1,000KDa分子量PGA的对比实验。
购得30个4周龄的雄性BALB/c小鼠，合适温度下在鼠笼中进行1212小时的黑暗-光照周期的培养，用基本的饲料和蒸馏水喂养。将小鼠分成3组，每组10只。第一组采用1,000KDa分子量的PGA给药，第二组采用5,000KDa分子量的PGA给药，第三组为未进行PGA给药的对照组。使个组口服含氯化钙的PGA溶液样品，而对照组则口服磷酸盐缓冲液。
口服后2小时，小鼠用乙醚麻醉，从小鼠腹部分离出从十二指肠至回肠的所有小肠部分。将小肠分成上下两部分，然后用冷盐水冲洗。接着，加入冷盐水，用搅拌器将小肠组织均质化。均质化的组织在8,000rpm和4℃下离心20分钟。离心后，分别收集组织样品中可溶组分和不溶的沉淀，在-20℃下保藏，同时用定量试剂盒(Wako Chemical Co.，Japan)分析它们的Ca浓度。分析结果见表1。
如表1所示，发现分子量为5,000KDa的超高分子量PGA具有促进Ca吸收的优良效果。这说明超高分子量的PGA能用于帮助Ca吸收的工业或食用产品。
表1根据PGA分子量的Ca吸收促进效果(Ca含量mg)
实施例5超高分子量PGA对肠内Ca离子持续释放的影响为了检测分子量为5,000KDa的本发明PGA对肠内Ca离子持续释放的影响，进来了下述的实验。
0.2％的分子量为5,000KDa的PGA溶液与5mM氯化钙混合，然后使小鼠口服1.0ml的溶液。此后，对小鼠采用实施例4步骤的相同处理，区别仅在于口服PGA溶液后的1，1.5和2小时对小鼠进行麻醉，然后，将十二指肠至回肠的所有小肠部分从小鼠腹部分离出。测定结果见图5。
如图5所示，施用包含本发明分子量为5,000KDa的PGA和氯化钙的混合溶液表明肠内的Ca吸收速度随时间而增加。这说明本发明的PGA对肠内矿物的持续释放具有很好的效果。
实施例6超高分子量PGA对血液中铁离子吸收的促进效果为了检测分子量为5,000KDa的本发明PGA对血液中铁离子吸收的促进效果而进行下述的实验。
0.04％的分子量5,000KDa的PGA与20mM的乳酸亚铁混合，使小鼠口服1.0ml的溶液向。为了证明超高分子量的PGA对促进铁离子吸收具有很好的效果，进行了本发明PGA和1,000KDa分子量PGA的对比实验。
购得30个4周龄的雄性BALB/c小鼠，合适温度下在鼠笼中进行1212小时的黑暗-光照周期的培养，用基本的饲料和蒸馏水喂养。将小鼠分成3组，每组10只。第一组采用1,000KDa分子量的PGA给药，第二组采用5,000KDa分子量的PGA给药，第三组为未进行PGA给药的对照组。使各组分别口服含PGA和氯化钙的溶液，使对照组口服磷酸盐缓冲液。
口服后的第3天，小鼠用乙醚麻醉，抽血，然后用颗粒计数模式PCE-170(ERMA Inc.，Japan)测定血液中的铁含量。测到的铁含量也可用血红蛋白量来表示。测定结果见表2。
表2数据明显显示，施用本发明分子量5,000KDa的PGA对于促进血液吸收铁有很好的效果。这说明本发明超高分子量的PGA能用于Fe吸收的工业或食用产品。
表2根据PGA分子量的促进Fe吸收的效果
实施例7超高分子量PGA水凝胶的吸水性实施例1制得的5％的每种超高分子量PGA水溶液和现有的PGA产品(600KDa)用25KGy的γ射线辐射，从而制得水凝胶。
将制得的每种水凝胶浸入水中，24小时后测定它在水中的重量，从而测定水凝胶的吸水特性。测定结果见图6。
图6显示，现有的PGA水凝胶吸收自身重量2000倍的水，但是本发明PGA水凝胶吸收自身重量6400倍的水，说明本发明水凝胶吸水能力是现有含PGA的水凝胶产品的3倍多。结果发现，与现有PGA制得的水凝胶相比，本发明PGA制得的吸水水凝胶即使在更小的体积下也具有吸收大量水的优良效果。
工业应用性如上所述，本发明提供了一种超高分子量的PGA，它的分子量大于5,000KDa。此外，本发明提供了一种包含超高分子量PGA的化妆品，食品和饲料，以及由超高分子量PGA制得的强吸水性水凝胶。并且，本发明还提供了一种促矿物吸收组合物，它包含分子量大于5,000KDa的超高分子量PGA，该产品能显著增加机体对矿物质的吸收。由于本发明的PGA具有超高分子量，它对机体吸收矿物质以及持续释放矿物质有很好的效果，因此能用于矿物吸收的工业或食用产品。
权利要求
1.一种超高分子量的聚-γ谷氨酸(PGA)，它的平均分子量大于5，000KDa。
2.根据权利要求1所述的PGA，其中，所述的PGA的平均分子量为5,000到15,000KDa之间。
3.根据权利要求1或2所述的PGA，其中，所述的PGA由枯草芽孢杆菌变种chungkookjang(KTCT 0697BP)制得。
4.一种水凝胶，它是由权利要求1-3任意之一所述的PGA制得的。
5.一种化妆品，包含权利要求1-3任意之一所述的PGA。
6.一种食品，包含权利要求1-3任意之一所述的PGA。
7.一种饲料，包含任意一个权利要求1-3任意之一所述的PGA。
8.一种吸水剂，包含权利要求4所述的水凝胶。
9.一种促矿物吸收组合物，包含权利要求1-3任意之一所述的PGA和矿物。
10.根据权利要求9所述的促矿物吸收组合物，其中，所述的促矿物吸收组合物具有持续释放特性。
11.根据权利要求9所述的促矿物吸收组合物，其中，所述的矿物是Ca，Fe，Mg，Zn，Cu或Se。
12.根据权利要求9所述的促矿物吸收组合物，其中，所述的PGA由平均分子量大于5,000KDa的超高分子量PGA与带正电荷的聚氨基酸的共聚物替代。
13.根据权利要求12所述的促矿物吸收组合物，其中，所述的聚氨基酸是聚赖氨酸或聚精氨酸。
14.一种将权利要求1-3任意之一所述的PGA用于促矿物吸收剂的方法。
全文摘要
本发明涉及一种具有超高分子量的聚－γ谷氨酸(PGA)，它的分子量大于5,000KDa。本发明的超高分子量PGA的平均分子量大于13,000KDa，并且95％以上分子的分子量范围在3,000至15,000KDa之间。该物质可通过培养枯草芽孢杆菌变种chungkookjang而制备得到。本发明的超高分子量PGA具有非常好的吸湿性、保湿性、持续释放性、矿物溶解性和吸水性，因此，可在多种方面被用作新的高添加性能的材料。
文档编号A61K47/42GK1665862SQ03815769
公开日2005年9月7日 申请日期2003年7月10日 优先权日2002年7月10日
发明者成文喜, 朴清, 洪承杓, 金光锡, 宋在俊, 罗有真, 金光, 左右田健次, 芦内诚, 夫夏玲, 李升九 申请人:生物领先公司, 韩国生命工学研究院