动物生长促进剂的制作方法

专利名称:动物生长促进剂的制作方法
本发明涉及在体内促进动物生长，更具体地讲，是关于一种生长促进剂，其生产方法以及增进动物生长的方法。
过去，通过在动物饲料中加入分解代谢的甾族物质，如雌激素已经获得了在动物，特别是家畜中的生长促进作用。最近，已开始不赞成这种做法了，不受欢迎之处在于大量甾类化合物堆积在动物组织中。结果产生不良影响，如引起食用喂以大量雌激素的小鸡的女孩胸部发育。
另一种普遍的做法是将抗生素掺入动物饲料。这有助于控制机会细菌感染，使牲畜自始至终保持良好的健康状况，随之发生体重增加。这种做法已经受到卫生部门的密切监视，并且由于促进抗生素抗性微生物菌株的生产而遭到反对。由于用作饲料添加剂的抗生素通常被建议治疗人类疾病，所以是特别值得关注的。
已进一步提出的建议是用各种消化酶作为饲料添加剂促进动物生长。这些酶有助于在肠内使粗饲料分解，从而使从定量给定的食物中得到的营养物的量增加，超过在正常消化条件下可得到的营养物。
将酶掺入饲料的缺点是酶常常会变性并在通过胃或瘤胃时失活，因为在胃或瘤胃中遇到的pH是极端的。由于酶对pH，温度，辅助因子等有特定的要求以保持其生物学活性，所以最适值的偏差可导致酶活性的降低或酶的不可逆失活。已经发现在动物饲料中加入消化酶在促进动物生长方面一般已不起作用。此外，由于只有一小部分掺入的酶在经过瘤胃或胃后保持活性，所以需要大量的酶，这样就使得这种处理方法不够经济。
澳大利亚专利516，072号提出通过使消化酶与粘合系统，稳定剂，和崩解剂混合，然后用肠衣包被该混合物使消化酶免于在胃中失活。肠衣可经过胃，此后其在十二指肠的碱性环境中分解。粘合剂和崩解剂促使酶迅速释放到十二指肠中。这一提议的缺点是在有机溶剂，如异丙醇和二氯甲烷存在下，消化酶在与粘合剂和崩解剂混合时部分失活。此外，加肠衣的消化酶也被有机溶剂部分失活。根据澳大利亚专利516，072号生产的颗粒粒度一般不能令人满意，这是由于防止均匀分布于饲料中而粒度大之故。
因此对酶促的动物生长促进剂的一个要求就是应克服一个或多个上述缺点。
本发明试图提供一种有效地利用饲料成分的生长促进剂。
根据本发明所提供的生长促进剂包括具有一个核心的微粒，该核心由选自下列的一种或多种酶组成(ⅰ)蛋白水解酶(ⅱ)糖水解酶(ⅲ)脂肪水解酶，或(ⅳ)以固定化形式存在的纤维水解酶，该核心用一水溶性薄膜囊包住，并包上含有一种碱溶而酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物的肠衣，聚合物的结构可用能被肠液溶解的脂肪酸或其它物质的通道所取代或含有这些通道。
“固定化形式”一词是指被固定在胶联物内的，封入半透膜内的，吸附到吸附剂上的或结合到螯合剂上的那些酶。
例如，可用下述任何一种方法使酶固定化(a)截留法将酶掺入到胶联物的核心或封入半透膜内;
(b)交联法用交联剂进行酶的分子间交联;或(c)载体结合法通过离子键和(或)共价键使酶与水不溶性物质物理或化学结合。
进行固定化要使酶保持其生物活性。
通过酶与胶凝剂在某些条件下混合可进行酶在核心内的截留，以便使酶滞留在所形成的凝胶基质中。
胶凝剂的例子包括K-角叉藻聚糖，明胶，藻酸盐，纤维素或其衍生物，或各种胶凝合成聚合物(如聚酰胺或脱乙酰壳多糖)。若使用吸附剂，则最好用细小的活性炭。
适用于酶固定化的螯合剂包括EDTA，它的盐或衍生物，和高分子量亲水聚合物(如聚丙烯酰胺)或能在水溶液或水(亲水)溶剂中使其离子键离解的高分子量盐类。
微粒的粒度最好为25～500μm，更好为50～350μm。
可用于本发明的酶的例子包括(1)蛋白水解酶组织蛋白酶a，b和c腺激肽释放酶，蛋白酶K，枯草溶菌素，无花果蛋白酶，链道酶，木瓜蛋白酶，凝乳酶，胰蛋白酶，菠萝蛋白酶和任何来自细菌，真菌，植物或动物的蛋白酶，(2)糖水解酶淀粉酶，葡糖淀粉酶，麦芽糖酶，乳糖酶，β-葡聚糖酶，葡糖异构酶，葡糖氧化酶，蔗糖酶和任何来自细菌，真菌，植物或动物的糖水解酶，(3)脂肪水解酶胰脂肪酶，细菌和真菌脂肪酶，
(4)纤维水解酶纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶。
封装包括薄膜或机械屏障在核心上的沉积使每个微粒的核心能与其环境物理分离。该屏障或薄膜可溶于水溶液。可形成适宜的机械屏障的化合物的例子是明胶。
肠衣最好为乙酸邻苯二甲酸纤维素。然而，任何其它的耐酸，碱溶性聚合物都可被利用。
甲基丙烯酸丁酯或其它高分子量聚合物都可用能被肠液溶解的硬脂酸或任何其它的脂肪酸衍生物(如C12-24脂肪酸)的通道所取代或含有这些通道。
消化酶在凝胶内的固定化是一个最有利的特征。特别是，凝胶基质限制变性剂进入酶，变性剂如那些用于包被肠衣(一种酸不溶性，碱溶性包衣，如乙酸邻苯二甲酸纤维素)的有机溶剂。因而大部分固定在凝胶基质中的消化酶最终都具有催化活性。这将与在先有技术中所获得的结果形成鲜明的对照，在先有技术中，当包被肠衣时发生酶活性的重大丧失。
可使消化酶固定于其中的凝胶基质是多孔和具渗透性的。因此，当凝胶处于含水条件时，如处于十二指肠的环境下时，由于肠液进入凝胶基质而使凝胶溶胀，并且使具有催化活性的消化酶从凝胶中释放出来。
按照本发明的做法可按50μm～500μm的等级生产具有极小粒度的微粒而不丧失消化酶的生物学活性。特别是，固定在凝胶中，或存在于能形成凝胶的溶液中的消化酶易于处理和加工，并且可经过细心操作生产所需的小粒度微粒。例如，含有消化酶的凝胶可通过极小孔径的筛网挤压成形，或者可被冷冻干燥制成所需大小的颗粒。通过一个合适的喷嘴可喷洒存在于能形成凝胶的溶液中的消化酶形成细小的液滴，这些液滴可进入使液滴形成凝胶的溶液，从而使消化酶固定在所形成的凝胶基质中。用这种方法所形成的颗粒的大小可由喷嘴的孔径大小和可使溶液雾化的压力来决定。与之相比，这样的结果不能用先有技术的方法得到。在先有技术中，仅使酶与不易受到上述处理的常规粘合剂混合生产出所需粒度的微粒。
小粒度的微粒是最合乎需要的，因为它们可均匀分布于饲料中，并且由于微粒表面积的增加，使得酶迅速释放出来。
在含有酶的核心周围有一层水溶性屏障，可使酶不因在包被肠衣过程中使用有机溶剂而变性。由于前述的凝胶基质的保护性，可有效地保持消化酶的生物学活性。而这就意味着可大大节约用来促进生长的消化酶的量。
本发明的生长促进剂使得pH敏感消化酶在胃或瘤胃中不会失活，而可在肠道内起作用，特别是在十二指肠内起作用。当生长促进剂到达单胃动物肠的碱性区域时，外面的包衣就会被溶解，或者脂肪酸通道被消化。然后肠液能够到达水溶性包衣而使之发生降解。这样就可使核心暴露，使之溶胀并释放消化酶。
在反刍动物中，高分子量聚合物(如具有脂肪酸通道的甲基丙烯酸丁酯)，最好是C12-24，允许生长促进剂通过瘤胃和胃。在肠区，特别是在十二指肠中，脂肪酸通道被脂肪酶所消化，因而可使水溶性包衣降解并使核心暴露，使之溶胀并释放消化酶。在这方面应该注意的是可按照本发明的做法获得的小粒度的微粒可促使微粒通过瘤胃。
根据本发明的另一方面，提供了一种通过给动物服用有效量的如前所述的生长促进剂来增进动物生长的方法。
按上述方法处理的动物表现出体重增加和提高的饲料利用率。
可用本发明方法处理的动物包括猪，绵羊，山羊，马，鸡，鸭和其它家畜。
可给动物喂食本发明的生长促进剂。
本发明的另一方面，提供了一种增进动物生长的组合物，该组合物含有如前所述的与可药用，或可兽用的载体或赋形剂结合的动物生长促进剂。例如，生长促进剂可与水，高岭土，滑石，碳酸钙，乳糖，氯化钠，硫酸铜，硫酸锌，硫酸亚铁，硫酸镁，碘化钾，硫，氯化钾，硒和(或)维生素(如生物素，胆碱，氯化物，烟酰胺，叶酸，及维生素A，D，E，K，B1，B2，B6和B12)一起服用。
根据本发明的再一方面，提供了一种促进动物生长的饲料组合物，该组合物含有与适当的动物饲料结合的前面提到的生长促进剂。
适当的动物饲料的例子包括下列一种或多种物质玉米，小麦，麦麸，大豆粉，鱼粉，禾草粉，脱脂乳，磷酸三钙，麦芽，谷物，大米，鱼精，乳清，苜蓿粉等等。
对掺入到生长促进剂中的不同的酶量(w/w)没有严格限制。掺入到生长促进剂中的最适酶量不用做大量试验即可很快地确定。
按照本发明的做法，每千克生长促进剂最好含有下列酶蛋白酶2×103～2×107Vitapharm蛋白酶单位淀粉酶1×104～4.3×108Vitapharm淀粉酶单位脂肪酶0.5～5×103Vitapharm脂肪酶单位纤维素酶2×102～2×106Vitapharm纤维素酶单位。
更好的是，1千克本发明的生长促进剂含有蛋白酶2×105蛋白酶单位淀粉酶4.3×106淀粉酶单位脂肪酶5×101脂肪酶单位纤维素酶2×104纤维素酶单位。
每种上述酶均为食物级，如在“食物化学索引”，第111版所定义的。
上面所给出的酶单位均为Vitapharm标准单位，并可按照实施例3所述的方法计算。
根据本发明的再一方面，提供了一种动物生长促进剂的生产方法，该方法包括下列步骤(a)使选自下列一组酶的一种或多种酶固定化
(ⅰ)蛋白水解酶;
(ⅱ)脂肪水解酶;
(ⅳ)糖水解酶;
这些酶都在一个核心内，(b)使固定化酶微粒化，(c)用一水溶性机械屏障囊包住这些微粒，和(d)用碱溶而酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物包被步骤(c)的微粒，聚合物的结构可被脂肪酸的间隙和通道所阻断。
这些微粒最好喷涂上步骤(c)的水溶性机械屏障和步骤(d)的包衣。
在核心内的固定化最好适用于在胶联物中固定化的酶。
本发明的动物生长促进剂可提高动物的增重和提高饲料的利用率。此外，动物生长促进剂可使动物尸体的背部脂肪减少。这样可提供便于销售的较瘦的肉。
用下列非限制性实施例将进一步描述和说明本发明。
实例1动物生长促进剂的制备方法(a)在65℃的温度下，将2%～5%(w/v)的K-角叉藻聚糖与纯化水混合，直至角叉藻聚糖完全溶解。然后将该溶液冷却至50℃。
(b)在50℃下，将1%(w/v)的等酶活性(等酶活性是指能够水解与其特定底物等重量的酶的量)的淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂酶溶解于等渗磷酸缓冲液(40% 0.067M Na H2PO4+60% 0.67M Na2HPO4)(pH6)。将这一溶液加到溶液(a)中，且在500转/分的转速下均化15分钟，然后将2～5%(w/v)在水中电离的钙加到该溶液中，再以50转/分的转速将产生的溶液进一步均化一小时，然后冷却到20℃，结果产生一凝胶和一水相。
(c)将产生的凝胶和水相冷却到5℃，经析、过滤后冻干。将冻干材料研磨成25～100微米大小的颗粒后，再用一种硬化剂〔如2.5%(w/w)的戊二醛或甲醛〕进行洗涤。
或者，用3KP/cm2的压力挤压步骤(b)的凝胶相，通过50微米大小的孔进行喷洒，且让它滴落1～5米后进入2.5%(w/w)的戊二醛或福尔马林溶液，形成颗粒。
(d)过滤颗粒后用软化剂(如甘油)洗涤。任何薄膜软化剂均可使用。
(e)将产生的颗粒过滤、流化后，于40℃加热干燥。
(f)于40℃下用1～2%(w/v)的白明胶水溶液喷洒涂布本步骤的颗粒。
(g)将一种耐酸、碱溶性涂料喷洒涂布颗粒，至其最终重量为120%(w/w)。该涂料包括6%(w/w)乙酸邻苯二甲酸纤维素30%(w/w)异丙醇0.5%(w/w)蓖麻油其余均为丙酮(h)作为步骤(g)的替代步骤，是将一种大分子量聚合物(其结构被脂肪酸的间隙或通道打断)喷洒涂布颗粒，至其最终重量为105%(w/w)。该涂料包括3%甲基丙烯酸丁酯0.15%(w/w)邻苯二甲酸二丁酯0.05%(w/w)硬脂酸其余均为乙基乙酸在步骤(a)中，K-角叉藻聚糖可被任何凝胶剂(如藻酸、白明胶或纤维素)及其衍生物取代。
在步骤(b)中，可取代钙的物质包括其它碱性金属离子(如K，Rb2+，Cs+)，碱金属离子(如Mg2+，Sr2+)，二价或三价金属离子(Al3+，Mn2+，Ba2+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Pb2+等)，NH+4，脂族胺或芳香二胺(如三乙胺，亚甲基二胺，乙胺，六亚甲基二胺)，等等。
实例2促进猪的生长给“生长期”的猪(活重22～50千克)以及“成熟期”的猪(活重50～80千克)喂食各种数量的本发明实例1的生长促进剂。每千克生长促进剂包括2×105蛋白酶单位，4.3×106淀粉酶单位，5×101脂酶单位和2×104纤维素酶单位。将该生长促进剂加到一小麦、大麦、香白羽豆种和肉粉的标准原饲料中。该原饲料每千克含有13.4MJ可水解能量，18.3%粗蛋白(含有0.95%赖氨酸，0.54%用硫氨酸和0.56%苏氨酸)以及适当水平的无机物和纤维素。
六种食物试验方法是将生长促进剂以每吨饲料0，1.0，2.0，4.0，8.0和16千克的量加进饲料。用每种处理的饲料三次喂养正在生长的猪，每次喂养的量分别为生长期(22～50千克)和成熟期(50～80千克)全食欲的84%和87%。
这一试验的结果见表Ⅰ
表Ⅰ用与基本饲料混合的生长促进剂喂养的猪的情况生长促进剂(千克/吨)0124816轻重增加20-50千克，克/天57057857556958857750-80千克，克/天732759812791794800饲料转化率20-50千克2.752.692.792.702.662.7150-80千克3.102.992.722.842.832.81背部脂肪，P2毫米 14.1 13.4 12.9 12.8 13.1 12.1躯体净重百分数686868686868从表1所示的结果明显可以看出，本发明的生长促进剂既改善了试验动物的生长，又改善了饲料转化。生长期猪的活重增加没有成熟期猪的增加明显。在成熟期，不用生长促进剂喂养的猪每天轻重增加732克，用每吨含2千克生长促进剂的饲料喂养的猪每天活重增加812克。从这一结果可以明显地看出本方法的功效。
虽然对照动物与用生长促进剂喂养的动物之间的躯体净重百分数没有明显不同，但是看来，随着生长促进剂剂量的增加，躯体背部脂肪减少(用标准卡钳测量)。
实例3与酶活性有关的Vitapharm标准单位的测定A.蛋白酶单位一个Vitapharm蛋白酶单位就是指在30分钟的比色血红蛋白测定中释放0.0447毫克非蛋白氮的酶量。这一测定可在pH4.7、40℃的条件下用变性血红蛋白进行。
测定试剂1.血红蛋白2.浮石粉3.血红蛋白底物称取16.0克DifcoBrandBacto血红蛋白(干基准物)加到一个1升的烧杯中。加入3勺浮石粉后彻底混合干成分。然后一边搅动，一边加入大约400毫升蒸馏水和1至2滴Dow-Corning消泡剂。将-pH电极浸入血红蛋白溶液，一边搅动，一边用2NNaOH将pH调至10.0。再将溶液的体积调至500毫升。然后将该溶液以3000转/分的转速离心15分钟，获取上清液，用作底物。
4.乙酸钠缓冲储液，2M将164克无水乙酸钠溶于大约700毫升蒸馏水。使用一标准pH仪，通过加入冰醋酸将缓冲液pH调至4.70±0.05。然后再用蒸馏水将溶液调至1升。
5.乙酸钠缓冲液，0.2M用移液管吸取50毫升乙酸钠缓冲储液至500毫升容量瓶中，然后用蒸馏水稀释至刻度。
6.溶于蒸馏水的70%三氯乙酸(TCA)7.氢氧化钠，2N8.氢氧化钠，0.5N9.福林试剂用2体积的蒸馏水稀释1体积的Folin-Ciocalteau酚试剂，稀释的酚试剂能够稳定一周。
步骤1.吸取25毫升血红蛋白底物和25毫升0.2M乙酸钠缓冲液至150毫升烧杯。用一标准pH仪测定缓冲底物的值。如果底物的pH不是4.70±0.05，那么就必须调整0.2M乙酸钠缓冲液的pH，以使25毫升血红蛋白底物和25毫升0.2M乙酸钠缓冲液的pH为4.70±0.05。
2.吸取25毫升血红蛋白底物和25毫升0.2M乙酸钠缓冲液至125毫升锥形瓶中。将该锥形瓶在40±0.1℃的水浴中平衡15分钟。
3.在零时，迅速吸取5毫升适当酶稀释液至平衡底物中。在零时按动秒表。
4.准三分钟后，向每一锥瓶中加入5毫升TCA溶液。为了安全，使用了滴定管或移液管。用力摇动每一锥瓶。
5.做一空白对照，它含有25毫升血红蛋白底物，25毫升乙酸钠缓冲液，5毫升蒸馏水，以及5毫升TCA溶液。
6.将锥瓶在室温下放置30分钟，让蛋白质完全凝固。再用Whatman42号滤纸过滤每种溶液。最好用同样的滤纸对最初的一半滤液再次过滤。滤液必须绝对澄清。
7.吸取1毫升每种滤液，4毫升0.5N氢氧化钠和1毫升稀释酚试剂至一试管中，然后充分混合。
8.10分钟之后(但不迟于20分钟)，在660纳米处，通过与空白对照，测定每种滤液的吸收度。
计算一个血红蛋白单位(HU)是在检测条件下释放67.08毫克(5312×6＝67.08)的非蛋白氮的酶量。
HU/克＝ (△A×F)/(W)△A＝酶解滤液在660纳米的吸收值F＝酚试剂的显色与蛋白酶水解之间的固定关系。见标准化程序的说明。
W＝加到5毫升等分水解液中的酶的毫克数。
标准化程序不同的蛋白酶打断不同的肽键。酚试剂的显色与水解程度之间没有普遍关系。但是，对于每一类型的蛋白酶，确实都存在着一种固定的关系。该固定关系(即F因子)可通过将血红蛋白底物与已知其活性的血红蛋白样品一起保温来测定。保温之后就进行凯氏定氮。
试剂1.硼酸溶液，2%2.硫酸钾3.浓硫酸4.1%酚酞溶液(溶于95%乙醇)5.用于定氮的Hengar颗粒6.甲基红指示剂酶的制备用已知活性的血红蛋白样品制备酶溶液，使5毫升最终稀释的等分溶液产生10～12个△N1.5。参考有助于确定酶稀释度的计算。
凯氏方法1.通过比色法中所述的步骤1～6进行测定。制备两份空白和三份酶水解液。
2.吸取10毫升空白滤液，加到100毫升的凯氏烧瓶中，该烧瓶盛有4.0克硫酸钾和1个硒化颗粒。按同样方式在烧瓶中用4毫升滤液制备每一种酶水解样品。
3.待溶液澄清后，吸取4毫升浓硫酸至每个烧瓶中，且水解30分钟。停止加热，使烧瓶冷却。然后加入40毫升蒸馏水和1滴酚酞溶液。再将烧瓶置于冰浴上放置10～30分钟。
4.在检测2%硼酸溶液的pH值之后，立即进行一系列蒸馏。硼酸溶液的pH值应为4.3至4.7。将蒸馏冷凝器的导管放在适当位置，使得冷凝液能够滴到含有40毫升硼酸的150毫升烧杯中。
5.将7.0克的氢氧化钠加到冷却的凯氏烧瓶中。不要混合，立即用一橡皮套将烧瓶与一蒸馏装置相连。用力混合后蒸馏3分钟，降下硼酸烧杯，继续蒸馏1分钟。如果发生暴沸，则立即继续进行下列步骤如同已完成蒸馏。用蒸馏水冲洗导管至硼酸溶液中，从烧瓶下移去支架。
6.加入两滴甲基红指示剂，用0.02N盐酸滴定每一馏出液至pH4.5。测定空白和酶水解液的平均滴定度，用它计算HU/克。
计算按下列方法计算由于蛋白酶的水解而得到的10毫升滤液中氮的毫克数。
毫克氮(△N)＝(样品滴定度×10/4-空白滴定度)(0.02N)(14)毫克氮(△N)＝(样品滴定度×2.5-空白滴定度)(0.28)10/4＝4毫升样品滤液换算为10毫升基准物0.02N＝盐酸的当量浓度14＝氮的分子量将△N的量乘1.5次方，即△N3/2，若将△N3/2对酶的毫克数作图，就会得到一条直线。从这一直线图就可测得精确释放5毫克氮所需要的酶量。
(△N)1.5＝log-1(1.5×log，△N)每克的血红蛋白单位(HU/克)按下列公式计算HU/克=( △N)1. 5× 1,000 × 60E × 10=11.18 × 6,000E]]>(△N)1.5＝10毫升滤液中释放的5毫克氮1，000＝将酶的毫克数换算为克数60/10＝将10毫升的等分溶液换算为60毫升基准物总体积E＝产生5毫克氮的酶的毫克数对于蛋白酶类型的F因子按下列公式计算F＝ (W)/(△A) ×HU/克W＝加到5毫升等分水解液中的酶的毫克数△A＝酶解滤液在660纳米处的吸收值HU/克＝按凯氏标准化程度测得每克蛋白酶的血红蛋白单位一个Vitapharm蛋白酶单位(1VPPV＝1HU)B.淀粉酶单位一个Vitapharm淀粉酶单位定义的是在以下所述的Vitapharm淀粉酶检测的条件下于30分钟内产生1毫克还原糖(麦芽糖)的活性。
检测试剂淀粉底物4%w/v可溶性淀粉溶液可溶性淀粉(干基准物)浆20.00克(适用于碘量法的Merck试剂可溶性淀粉，Merck&CO.，Rahway，N.J.)存在于75ml蒸馏水中。搅拌条件下向其中加入沸腾蒸馏水至300ml，再使淀粉溶液沸腾并微沸3分钟。从加热器上取下并定量转移到500ml派热克斯容量瓶中。用自来水使其冷却至室温并补足至该体积。
淀粉指示剂溶液150克分析纯NaCl溶于480ml蒸馏水并加热至沸腾。用电动搅拌器剧烈搅拌。将5.7克(干重约5.0克)可溶性淀粉加到20ml蒸馏水中所获的均匀悬浮液缓慢加入其中。沸腾至少5分钟，再冷却。
碳酸钠溶液10.6%碳酸钠溶液1.06%储备的碘溶液0.1N12.7克碘(I2)和48克碘化钾(KI)溶于约900ml蒸馏水中。定量转移到1升容量瓶中并用蒸馏水补足至该体积。
碘溶液0.02N硫酸0.5N硫代硫酸钠0.005N酶溶液酶溶液的浓度应当是1ml该酶溶液能在保温期间产生大约20%理论值的麦芽糖。稀释的淀粉酶不稳定。因而，适宜的酶溶液应当在使用前才配制。不要在40℃平衡酶溶液，因为有失活的危险。
程序1.将25ml4%淀粉底物移入50ml容量瓶中。加入5ml适宜的缓冲液和18ml水。以水浴在40℃±0.5°平衡该瓶15分钟。
2.在0时，迅速吸取1ml适宜的酶溶液移至已平衡过的淀粉混合物中。用蒸馏水补足体积并颠倒混匀。对底物空白而言，加入1ml蒸馏水取代酶溶液。
3.在每个反应瓶准确地保温30分钟后，吸取5ml淀粉酶解液移至含1ml10.6%碳酸钠的10ml容量瓶中。用蒸馏水补足体积并颠倒混合。
4.按下述确定酶解液的还原值吸取2ml碳酸钠酶解液等分试样移至50ml带塞的玻璃烧瓶中。所有测定均重复。吸取3ml0.02N碘溶液移入该玻璃烧瓶中，用3ml蒸馏水洗烧瓶壁。以水浴在20℃±0.5℃平衡碘混合物30分钟。加入1ml0.5N硫酸，用标定的0.005N硫代硫酸钠滴定。当溶液变为灰黄时加入三滴淀粉液指示剂。继续滴定直至淀粉-碘复合物消失。
5.对碘空白而言，滴定3ml0.02N碘溶液，2ml1.06%硫酸钠和3ml水。
计算按下述方法计算酶解液的还原值1.用碘空白滴定值减去淀粉液滴定值计算出淀粉空白。
2.按下式计算麦芽糖毫克值麦芽糖毫克值＝(I2空白-淀粉空白-Na2S2O3滴定值)×50×0.855滴定的样品的还原值等于碘空白减去淀粉空白再减去酶解液的硫代硫酸钠滴定值再乘以0.855。1ml0.005N硫代硫酸钠相当于0.855mg麦芽糖。滴定的样品相当于1ml初始酶解液。被滴定样品的还原值乘以50给出了从1克淀粉中得到的以麦芽糖计算的还原糖的实际毫克值。
3.用表2中的修正因子将水解值修正为20%水解值。用下述等式计算淀粉酶效力
效力(mg/mg)＝ (麦芽糖(mg)×修正因子)/(酶(mg/ml))
C.脂酶单位1.Vitapharm脂酶单位定义为在下述Vitapharm淀粉酶检测中2小时释放出1毫克当量脂肪酸的活性。
检测试剂1.缓冲液，0.1M磷酸盐，pH7.32.780克Na H2PO4·H2O溶于水并稀释至100ml。将2.839克无水Na2HPO4溶于水并稀释至100ml量取23.0ml该Na H2PO4溶液和77.0ml该Na2HPO4溶液移至200ml容量瓶中，用蒸馏水补足体积。
2.底物，橄榄油乳液在慢速运行的韦林氏搀合器(调压变压器定在25～30那一档)中的93ml0.1M磷酸盐缓冲液内缓慢加入200mg苯甲酸钠和7.0克USP阿拉伯树胶。当这些试剂完全溶解后，缓慢地加入93mlUSP橄榄油。当全部油加入后，以该速搀合3分钟，然后再以高速搀合5分钟。
3.缓冲的底物向100ml配衡的容量瓶中加入54.4克橄榄油乳液，用0.1M磷酸盐缓冲溶液补足体积。该缓冲的底物应当为pH7.3。
4.乙醇，95%5.百里酚酞，1%(w/v)在95%乙醇中6.氢氧化钠，0.05N程序1.吸取5.0ml被缓冲的底物的等分试样移入50ml锥形烧瓶中。每种待测样品各用一个烧瓶。把它们放在特殊的夹具上，并放在37℃水浴中。
2.制备适宜的酶稀释液。样品的稀释应根据该酶制剂的脂酶活性而定。
3.在一个含底物的烧瓶中加入5.0ml蒸馏水，即成分酶空白。然后在其它的底物烧瓶中各加入一种酶样品5.0ml。充分搅拌，在37℃保温2小时，其间不时回荡烧瓶。
4.向各烧瓶中加入3.0ml乙醇终止反应，加入4滴百里酚酞并充分混合。
5.用0.05NNaOH滴定各烧瓶至灰兰色终点。最好是滴定出空白，然后将样品与其对比。从样品滴定中减去底物空白测得酶反应。
计算不同水平的酶对底物的水解程度不是线性的。为了获得良好的重复性，能给出4.0ml0.05NNaOH滴定差异(样品滴定度一定白滴定度)的酶量是正确的酶量。有两种方法可以用来确定这一酶量。
A.三样品法三种酶制剂样品严格按本方法进行，样品重量的选择应这样进行，一种给出少于4.0ml的滴定差异，另一种给出大于4.0ml的滴定差异，第三种则给出约等于4.0ml的滴定差异。在座标纸上相对滴定差异画出酶的毫克量点，各点之间以直线相连。由图中读出滴定差异正好为4ml所对应的酶毫克值，并用于按下式计算脂酶单位(4.0×N×1000)/(酶样品(毫克)) ＝脂酶单位(LU)/克其中N为NaOH的当量浓度。
B.标准曲线法以预先经准确测定了其活性的制剂作为标准样品，使用几种不等重量的标准样品严格地按方法进行检测。以得到的滴定差异值对标准样品毫克值作图，在各点之间作出平滑的曲线。得到这条标准曲线后，则在确定未知样品的脂酶活性时，则按照方法选用方便的样品重量进行检测。由标准曲线确定给出与未知检测样品相同滴定差异值的标准样品重量值，按下述计算脂酶活性LU/克＝ (标准样品(mg))/(未知样品(mg)) ×标准样品检测值D.纤维素酶单位一个Vitapharm纤维素酶单位定义的是在检测条件下5分钟使给定的羧甲基纤维素底物产生相对流动性改变为1的活性。该检测基于的是在pH4.5，40℃使给定羧甲基纤维素底物的内部β-1，4-糖苷键被酶水解。
试剂和溶液1.乙酸溶液，2N2.乙酸钠溶液，2N3.乙酸溶液，0.4N4.乙酸钠溶液，0.4N5.乙酸焉盐缓冲液(pH4.5)使用标准使用前用纱网过滤底物。
酶制剂制备一种酶制剂，使其在检测条件下，5分钟能产生0.18至0.22的相对流动性的改变。称量该酶用的羧甲基纤维素钠是CMC7HP型(Hercules，Inc.，910MarketStreet，Wihmington，Delaware19899)。
7.羧甲基纤维素钠底物，0.2%w/v将200ml蒸馏水移入韦林氏搀合器的碗中。搀合器定于低速运行，将1.0gCMC7HP小心地加到该碗中，不要有任何液体溅出。用橡胶棒将蒸馏水沿玻璃碗边向下清洗。盖上碗盖，以高速混合1分钟。定量转移到500ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至该体积。使用前用纱网过滤底物。
酶制剂制备一种酶制剂，使其在检测条件下，5分钟能产生0.18至0.22的相对流动性的改变。称量该酶并定量转移到玻璃研钵中。用蒸馏水滴定并定量转移到适当的容量瓶中。用蒸馏水稀释至该体积，使用前，用1号Whatman滤纸过滤酶溶液。
检测程序1.将校准的粘度计以垂直位置放入40°±0.1℃水浴中。应使用经严格清洗过的粘度计。清洗是先吸入大量清洁剂，然后再吸入蒸馏水来完成。还可用带橡皮管的吸气器连接到粘度计的细臂来完成。
2.吸取20ml经过过滤的CMC7HP底物和4.0ml乙酸盐缓冲液(pH4.5)移入到50ml锥形烧瓶中。每种酶样品至少有2瓶，并有一瓶底物空白对照。盖好锥形瓶，放在水浴中平衡15分钟。
3.在0时，吸取1ml酶溶液移入经平衡的底物中。打开1号秒表并充分混合溶液。然后，立即吸取10ml反应混合物移入粘度计的粗臂中。
4.约2分钟后，用橡皮管连在粘度计的细臂上抽吸，使反应混合物超过上标记进入流体头。让反应混合物通过上标记自由流下，测定其时间。当反应混合物的弯月面降过上标记时，开动2号秒表。同时，由1号秒表按分记录反应时间(Tr)。当反应混合物的弯月面降过下标记时，从2号秒表上按秒记录下时间(Tt)。
5.立即再将反应混合物吸过上标记进入流体头部。当反应混合物的弯月面自由下降超过上标记时，再重新开动2号秒表。同时，由1号秒表上按分记录下反应时间(Tr)，由2号秒表按秒记录时间(Tt)。
6.重复步骤5，直至完成4次测定，历时(Tr)不超过15分钟。
7.吸取1ml蒸馏水移入24ml径缓冲的底物中制备底物空白。再吸取10ml反应混合物移入粘度计的粗臂内。按秒记录弯月面下降经过两个标记之间所需的时间(Ts)。以5次测定的平均值作为Ts。
8.吸取10ml经平衡的蒸馏水移入粘度计的粗臂内制成水空白。按秒测定弯月面下降经过2个标记之间所需时间(Tw)。以5次测定的平均值作为Tw。
计算1个纤维素酶单位(CU)定义的是在检测条件下5分钟使给定的羧甲基纤维素底物产生相对粘度改变为1的活性。
按下述对四次流出时间(Tt)和反应时间(Tr)各计算其相对流动性(Fr)和(Tm)值Fr＝(Ts-Tw)(Tt-Tw)Tm＝1/2(Ts/60秒/分)+Tr＝(T2/120)+Tr其中Fr＝每一反应时间的相对流动性Ts＝按秒记录的底物空白流出时间的平均值Tw＝按秒记的水空白流出时间的平均值Tt＝按秒记的反应混合物的流出时间Tr＝从0时开始的按分记的花费的时间，即从向经缓冲的底物加入酶溶液直至开始测定流出时间(Tt)的时间。
Tm＝按分记的反应时间(Tr)加上二分之一转换成分的流出时间(Tt)。
以四次相对流动性(Fr)为纵座标，以四次反应时间(T)为横座标作图。应得到一条直线，其斜率相当于每分钟相对流动性的改变，而且是与酶浓度成比例的。通过一系列实验点的最优直线的斜率作为酶活性标准比单一相对流动性数值更好。从图中确定Fr值为10和5分钟。它们在流动性上的差异不应大于0.22，也不应小于0.18。未知酶活性的计算按下式进行
CU/g=1000F (Fr10-Fr5)W]]>其中Fr＝反应时间为5分钟的相对流动性Fr＝反应时间为10分钟的相对流动性1000＝每克为1000毫克W＝加到反应混合物中的1毫升酶溶液等分试样中的酶毫克量
权利要求
1.一种生长促进剂，该促进剂由具有一个包含选自下列的一种或多种酶的核心的微粒组成(i)蛋白水解酶；(ii)糖水解酶；(iii)脂肪水解酶；和(iv)以固定化形式存在的纤维水解酶；用水溶性薄膜囊包裹核心，并用含有碱溶性，酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物的肠衣包被核心，聚合物的结构可用能被肠液溶解的脂肪酸或其它物质的通道所取代或含有这些通道。
2.一种权利要求
1所要求的生长促进剂，其中核心包括固定在胶联基质内的酶。
3.一种权利要求
2所要求的生长促进剂，其中凝胶基质包括K-角叉藻聚糖，明胶，藻酸盐，纤维素或其衍生物;或胶凝合成聚合物。
4.一种权利要求
1～3中任一项所要求的生长促进剂，其中微粒的大小为25～500μm。
5.一种权利要求
4所要求的生长促进剂，其中颗粒的大小为50～350μm。
6.一种权利要求
1所要求的生长促进剂，其中脂肪酸薄膜包括C12-24脂肪酸。
7.一种权利要求
1所要求的生长促进剂，其中水溶性薄膜是明胶。
8.一种权利要求
1所要求的生长促进剂，其中碱溶性，酸不溶性聚合物是乙酸邻苯二甲酸纤维素。
9.一种权利要求
1所要求的生长促进剂，其中高分子量聚合物是甲基丙烯酸丁酯。
10.一种权利要求
1～9中任一项所要求的生长促进剂，每千克所述生长促进剂含有2×103～2×107蛋白酶单位4.1×104～4.3×108淀粉酶单位0.5～5×103脂肪酶单位2×102～2×106纤维素酶单位。
11.一种增进动物生长的方法，该方法包括供给生长促进量的权利要求
1～10中任一项所要求的生长促进剂。
12.一种权利要求
11所要求的方法，其中生长促进剂以与动物饲料混合的方式给动物服用。
13.一种权利要求
1～10中任一项所要求的生长促进剂，该促进剂与可药用或可兽用的载体或赋形剂结合。
14.一种增进动物生长的方法，该方法包括供给权利要求
13所要求的生长促进组合物。
15.动物饲料，该饲料与权利要求
1～10中任一项所要求的生长促进剂混合。
16.动物饲料，该饲料混有权利要求
13所要求的生长促进组合物。
17.一种动物生长促进剂的生产方法，该方法包括下列步骤(a)使选自下列酶的一种或多种酶固定化(ⅰ)蛋白水解酶;(ⅱ)脂肪水解酶;(ⅲ)纤维水解酶;(ⅳ)糖水解酶;这些酶都在一个核心内;(b)使固定化酶微粒化;(c)用一水溶性机械屏障囊包住这些微粒;和(d)用包括一种碱溶性，酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物的肠衣包被步骤(c)的微粒，聚合物的结构可用能被肠液所溶解的脂肪酸或其它物质的通道取代或含有这些通道。
18.一种权利要求
17所要求的方法，其中使酶在胶联物内固定化。
19.一种权利要求
17所要求的方法，其中用步骤(c)的水溶性屏障和步骤(d)的包衣喷涂微粒。
20.一种生长促进剂，生长促进组合物，促进动物生长的方法，或动物生长促进剂的生产方法，基本上如上文所述。
专利摘要
本发明涉及一种生长促进剂，它由具有一个包含选自下列的一种或多种酶的核心的微粒组成(i)蛋白水解酶；(ii)糖水解酶；(iii)脂肪水解酶；和(iv)固定化形式的纤维水解酶；用水溶性薄膜囊包囊核心，并用含有碱溶性，酸不溶性聚合物，或高分子量聚合物的肠衣包被核心，聚合物的结构可用能被肠液溶解的脂肪酸或其它物质的通道取代或含有这些通道。本发明还描述一种增进动物生长的方法，该方法包括供给生长促进量的生长促进剂，还描述一种生产生长促进剂的方法。
文档编号A61K9/58GK87105846SQ87105846
公开日1988年5月4日 申请日期1987年8月27日
发明者索马斯·科·萨·英格 申请人:索马斯·科·萨·英格